PLoS ONE: MicroRNA-149 hemmt die Proliferation und Zellzyklus durch die gezielte Ausrichtung der ZBTB2 in menschlichen Magenkrebs

Abstrakt

Eine immer mehr Beweise gibt an, dass miR-149 sowohl unterdrücken kann, und das Tumorwachstum fördern auf dem Tumortyp abhängig. Allerdings bleibt die Rolle von miR-149 in dem Fortschreiten von Magenkrebs (GC) unbekannt. Hier berichten wir, dass miR-149 ein Tumorsuppressor in menschlichen Magenkrebs ist. miR-149 Expression wird in GC-Zelllinien und klinischen Proben im Vergleich zu normalen Magen-Epithelzellen und Gewebe verringert, respectively. Die Expressionsniveaus von miR-149 korrelieren auch mit dem Differenzierungsgrad GC Zellen und Geweben. Außerdem hemmt ektopische Expression von miR-149 in Magenkrebs-Zellen-Proliferation und Zellzyklus-Progression durch Herunterregulierung ZBTB2
, ein potenter Repressor des ARF-HDM2-p53-p21-Weg, mit einem potentiellen Bindungsstelle für miR-149 in seiner mRNAs 3'UTR. Es wird auch gefunden, dass die Expression ZBTB2 steigt in GC Zellen und Gewebe im Vergleich zu normalen Magen-Epithelzellen und Geweben, respectively. Silencing von ZBTB2
führt zur Unterdrückung des Zellwachstums und der Zellzyklusarrest in G0 /G1-Phase, das anzeigt, dass ZBTB2 als ein Onkogen in GC wirken. Weiterhin Transfektion von miR-149 ahmt in Zellen Magenkrebs induziert Herunterregulierung der ZBTB2 und HDM2 und Hochregulierung von ARF, p53 und p21 zu den Kontrollen verglichen. Zusammenfassend weisen unsere Daten, dass miR-149 wirkt als Tumorsuppressor in der menschlichen Magenkrebs durch, zumindest teilweise durch Targeting ZBTB2

Citation:. Wang Y, Zheng X, Zhang Z, Zhou J., Zhao G, Yang J, et al. (2012) MicroRNA-149 hemmt die Proliferation und Zellzyklus-Progression durch die gezielte Ausrichtung der ZBTB2
in menschlichen Magenkrebs. PLoS ONE 7 (10): e41693. doi: 10.1371 /journal.pone.0041693

Editor: Wael El-Rifai, Vanderbilt University Medical Center, Vereinigte Staaten von Amerika

Empfangen: 13. März 2012; Akzeptiert: 25. Juni 2012 um; Veröffentlicht: 29. Oktober 2012

Copyright: © 2012 Wang et al. Dies ist eine Open-Access-Artikel unter den Bedingungen der Lizenz Creative Commons, die uneingeschränkte Nutzung erlaubt, die Verteilung und Vervielfältigung in jedem Medium, vorausgesetzt, der ursprüngliche Autor und Quelle genannt werden

Finanzierung:. Diese Arbeit durch Zuschüsse aus dem National Natural Science Foundation of China unterstützt wurde (Nr. 30872966 und Nr. 31071135), National Natural Science Foundation of China (Nr. 81000864, ​​Nr. 81172290, Nr. 91129723, Nr. 81090270 und Nr. 81090273) und die chinesische Postdoctoral Science Foundation (Nr. 20100471776). Die Geldgeber hatten keine Rolle in Studiendesign, Datenerfassung und Analyse, Entscheidung oder Vorbereitung des Manuskripts zur Veröffentlichung

Konkurrierende Interessen:.. Die Autoren haben erklärt, dass keine Interessenkonflikte bestehen

Einführung

Magenkrebs (GC) ist eine der häufigsten Krebsarten und die wichtigsten Ursachen für Krebstod weltweit, vor allem in Ost-Asien, nach der neuesten globalen Schätzung im Jahr 2011 veröffentlicht [1]. Trotz einer bemerkenswerten Rückgang der GC-Inzidenz in den meisten Teilen der Welt, gibt es immer noch eine große Last von der großen Anzahl von GC Fälle und Todesfälle weltweit. Die Karzinogenese von GC ist ein sehr kompliziertes Verfahren [2] - [5], um die Fehlregulation von mehreren Genen beteiligt sind [6] - [8], einschließlich Onkogene [9] - [14] und Tumorsuppressoren [15] - [18]. Allerdings müssen die molekularen Mechanismen, die für GC Entwicklung und Progression weiter erforscht werden.

MicroRNAs (miRNAs) sind eine Gruppe von endogen exprimiert, nicht-kodierenden kleinen RNAs (20-25 Nukleotide lang) bekannt zu negativ regulieren die Genexpression Übersetzung oder Verringern der Stabilität der mRNAs durch direkte Bindung an die 3'-untranslatierte Region (3'-UTR) von Ziel-mRNAs [19] durch Unterdrückung, [20]. mehr deutet darauf hinweisen, dass miRNAs eine wichtige Rolle in der Entwicklung, Stoffwechsel, Proliferation, Differenzierung und Apoptose spielen. Zusätzlich wird aberrant post-transkriptionelle Regulation von mRNAs von miRNAs tumorigenesis bezogen [21]. Anormalen Expressionsprofile von miRNAs sind in verschiedenen Arten von menschlichen Tumoren nachgewiesen worden, einschließlich Lunge [22], Brust [23], Prostata [24], der Leber [25], Kolon [26] und Magenkrebs [27]. Darüber hinaus können einige miRNAs als Onkogene oder Tumorsuppressoren funktionieren, indem die Expression von Zielgenen regulieren, die eine wichtige Rolle in der Zellzyklusprogression, Apoptose oder die Proliferation spielen. miR-22 [28], miR-101 [29], und miR-7 [30] wurden alle gezeigt in Tumorproben und Funktion als Tumorsuppressoren downregulated zu werden; miR-17 [31] und miR-21 [32] wurden in Tumorproben und Funktion wie Onkogene werden aufreguliert gezeigt. Diese Studien zeigen, dass eine Fehlregulation der miRNAs häufig in der Karzinogenese und der Tumorprogression beteiligt ist.

Jüngste Studien haben vorgeschlagen, dass miR-149 eine wichtige Rolle bei verschiedenen Erkrankungen spielt, einschließlich der Progression der malignen Tumoren. miR-149 wurde sowohl als Tumorsuppressor [33] und ein Onkogen [34] in der Entwicklung von mehrfachen Arten von soliden Tumoren gezeigt, zu funktionieren. Beispielsweise Verlust von miR-149 führt der Funktion einiger Onkogene zu gewinnen und mit dem Tumorgrad in Nierenzellkarzinom [35], Astrozytome [36] und Prostatakarzinom [37] zu korrelieren. Ektopische Expression von miR-149 induziert Apoptose von Neuroblastom und HeLa-Zellen [33]. Erhöhte Expression von miR-149 wurde in der Progression der Nasopharynxkarzinom [38] und Melanom-Metastasen [34] wichtig zu melden. Darüber hinaus Dysregulation von miR-149 ist auch in einigen nicht-neoplastischen Erkrankungen in Verbindung gebracht. Zum Beispiel wird die Herunterregulierung von miR-149-Expression bei der Entwicklung von primären Myelofibrose, Polycythemia vera, essentieller Thrombozythämie und [39] beteiligt sind, und den Verlust von miR-149 kann Hepatitis C-Virus (HCV) RNA Überfluß [40] unterdrücken. Allerdings bleibt das Expressionsmuster und die Rolle der miR-149 in der Entwicklung von GC unklar.

In der vorliegenden Studie haben wir festgestellt, dass miR-149 deutlich in GC-Zelllinien und klinischen Proben im Vergleich zu der nach unten reguliert wird normale Magenepithelzellen Zelle und benachbarten nicht-Tumorgewebe sind. Die ektopische Expression von miR-149 hemmt die Proliferation und induziert G0 /G1-Arrest von AGS und SGC7901 Zellen in vitro und Videos Targeting ZBTB2
. Darüber hinaus Erschöpfung der ZBTB2 und Videos siRNA führt zu einer Hemmung der Proliferation und Zellzyklusarrest. Das Expressionsmuster von miR-149 und ZBTB2 in GC-Zelllinien und klinische Proben wurden invers korreliert, weiterhin darauf hindeutet, dass ZBTB2
ist ein Zielgen von miR-149. Einführung von miR-149 führt zu Veränderungen in der Expression von p53, p21, ARF und HDM2, die Mitglieder des ARF-HDM2-p53-p21-Weg, der durch ZBTB2 reguliert wird. Zusammenfassend bestätigen diese Ergebnisse, dass miR-149 in GC-Zellen und klinischen Proben nach unten reguliert wird, und legen nahe, dass miR-149 Funktionen als Suppressor von Magenkrebs Zellwachstum durch Progression Proliferation und Zellzyklus-Hemmung.

Ergebnisse

die Expression von miR-149 ist in GC-Zelllinien und klinischen Proben
downregulated

die Rolle der miR-149 in der Karzinogenese von GC zur Beurteilung verwendeten wir erste quantitative RT-PCR die Expression zu messen miR-149 in der menschlichen GC-Zelllinien (MKN45, GC9811, AGS, SGC7901 und MKN28) und fand heraus, dass miR-149 in GC-Zelllinien im Vergleich zu einer normalen Magen-epithelialen Zelllinie GES-1 (Abb. 1A) nach unten reguliert wurde. Insbesondere wurde die Expression von miR-149 positiv mit dem Differenzierungsgrad GC-Zellen korreliert. Und zwar in der Expression von miR-149 schlecht differenzierten Zelllinien, wie MKN45, GC9811 und AGS, ist deutlich geringer als in mäßig und gut differenzierte Zelllinien. Die Expression von miR-149 in mäßig differenzierten Zellen, SGC7901, ist geringer als die in der gut differenzierte Zelllinie, MKN28 (Abb. 1A).

Um auch wenn Ebenen von miR-149, um zu bestimmen korrelieren mit der Differenzierung Grad von Tumoren untersuchten wir die Expression von miR-149 in 44 menschlichen GC klinischen Proben, darunter 13 schlecht, 16 mäßig und 15 gut differenzierte Proben. Wir fanden, dass die Expression von miR-149 in Magentumoren ist bemerkenswert geringer als in angepaßten normalen angrenzenden Geweben (Fig. 1B). Darüber hinaus war die Expression von miR-149 in differenzierter Tumoren höher als in weniger differenzierten Tumoren (1C, F = 65,391, p
. ≪ 0,001). Darüber hinaus verringerte Expression von miR-149 korreliert mit Lymphknotenmetastasen (* p
= 0,046) und TNM-Stadium (** p
= 0,0011) (Tabelle 1).

die ektopische Expression von miR-149 hemmt die Proliferation und induziert G0 /G1-Arrest in AGS und SGC7901 Zellen

die Rolle der miR-149 in GC-Zellen Um zu untersuchen, verwendeten wir schlecht und mäßig differenzierten GC-Zelllinien, AGS und SGC7901 sind. AGS und SGC7901 Zellen wurden transient mit eithermature miR-149 ahmt transfiziert, Inhibitor, scheintransfizierten oder miR-NC. Wie in 2A gezeigt, 2D zeigen quantitative RT-PCR-Ergebnisse, dass die Expression von miR-149-Mimetika oder Inhibitoren signifikant hochreguliert oder die Expression von miR-149, jeweils in AGS und SGC7901 Zellen aus dem ersten bis fünften Tag der Transfektion (Fig downregulate . 2A, F = 8,429, p
= 0,003;. Abb. 2D, F = 8,595, p
= 0,003) im Vergleich zu NC und Mock Kontrollen

AGS und SGC7901 Zellen, transfiziert mit miR-149-Mimetika und Inhibitoren zeigten signifikant niedrigere und höhere Zellproliferation, die jeweils als die NC oder mock-Gruppen, bestimmt durch MTT-Assay (2B, F = 27,47, p <. 0,001; Fig. 2E, F = 44,061, p < 0,001). Die Transfektion von AGS und SGC7901 Zellen mit miR-149 ahmt führt zu einer signifikanten G1-Phase Verhaftung im Vergleich zu NC und Mock Kontrollen ( p
< 0,05). Darüber hinaus führte die Behandlung mit miR-149-Inhibitoren führte zu weniger AGS und SGC7901 Zellen in G1-Arrest im Vergleich zu NC und Mock Kontrollen ( p
< 0,05). (2C, F = 134,177, p
< 0,001;. Abb. 2F, F = 58,792, p
= 0,003)

ZBTB2
ist ein Ziel von miR-149

Frühere Daten deuten darauf hin, dass miR-149 ein Suppressor der GC Zellwachstum sein könnten Gene, indem sie auf die Proliferation und Zellzyklus-Progression (33-34) (38) zu steuern. So haben wir für weitere potenzielle Ziele von miR-149 von TargetScanHuman Datenbank gesucht. Wir identifizierten zahlreiche potenzielle miR-149 Zielgene, einschließlich ZBTB2
, ein POK Familie Transkriptionsfaktor und potenter Repressor des ARF-HDM2-p53-p21-Weg (41). ZBTB2
wurde gefunden mutmaßliche miR-149-Bindungsstellen haben innerhalb ihrer 3'UTR (Abb. 3A). Luziferase-Reporter-Assays wurden durchgeführt, um zu überprüfen, ob ZBTB2
ein direktes Ziel von miR-149 unter Verwendung von AGS und SGC7901 Zellen. Wir cotransfiziert AGS und SGC7901 Zellen, die jeweils mit einem psiCHECK-2-Vektor, die entweder 3'UTR für ZBTB2 oder mutierte 3'UTR für ZBTB2 und Mimetika von miR-149 oder Inhibitoren von miR-149. Wildtyp- und mutante ZBTB2-3'UTR enthielten, wurden die putative Bindungsstelle von miR-149 kloniert in psiCHECK-2-Vektor stromabwärts von Luciferase-Gen (Fig. S1). Einführung von miR-149 deutlich reduziert die Luciferase-Aktivität aus dem ZBTB2 3'UTR Reportervektor (3B-3C, p
. ≪ 0,001), aber keinen Einfluss auf die Luciferase-Aktivität aus dem mutierten ZBTB2-3 'UTR-Reportervektor. Diese Daten legen nahe, dass miR-149 direkt reguliert ZBTB2
Expressionsniveaus. Darüber hinaus gibt es keine signifikante Abnahme der relativen Luciferase-Aktivität in Zellen co-transfiziert mit miR-149-Inhibitor oder 3'UTR-ZBTB2 /psiCHECK-2-Vektor (Fig. 3B-3C). Es ist vielleicht, weil der Mangel an Interaktion zwischen 3'UTR von ZBTB2 und endogenen miR-149, somit verringert miR-149 Expression nicht aus dem ZBTB2-3'UTR Reportervektor Luciferase-Aktivität erhöhte. Diese Ergebnisse bestätigen weiterhin, dass miR-149 ZBTB2 Ausdruck unterdrückt, indem sie auf die 3'-UTR von ZBTB2
mRNA.

miR-149 und ZBTB2 Expression negativ in GC-Zellen und klinischen Proben korreliert

weiter Um die Beziehung zwischen miR-149 und ZBTB2 untersuchen, untersuchten wir die Expression von ZBTB2 in GC-Zellen unter Verwendung von Western-Blot und in GC Gewebe mittels Immunhistochemie. Es wurde festgestellt, dass GC-Zellen signifikant höhere Expression von ZBTB2 als die normale Magen-epithelialen Zell, GES-1 (4A a-b F = 167,843, p
. ≪ 0,001). ZBTB2 Ausdruck negativ mit dem Differenzierungsgrad der GC-Zellen korreliert sind; schlecht differenzierten GC Gewebe zeigten eine signifikant höhere ZBTB2 Expressionsniveau als gut differenzierte GC Gewebe und abgestimmt normalen Magen-Gewebe (Abb S2A-B, F = 117,280, p
. < 0,001). ZBTB2
mRNA-Expressionsniveaus sind deckungsgleich mit den Proteinspiegel (4B a, F = 283,355, p
. ≪ 0,001). Darüber hinaus wird die Expression von miR-149 und ZBTB2 invers korreliert (Abb. 4B b, p
= 0,033, R = -0,908). Wir maßen dann die Expression von miR-149 und ZBTB2
mittels quantitativer RT-PCR in 5 GC-Zelllinien (MKN45, GC9811, AGS, SGC7901 und MKN28) (Abb. 4C a) und 18 GC klinischen Proben (6 schlecht, 6 mäßig und 6 gut differenzierten Proben) (Abb. 4C b). Die Ergebnisse bestätigen, dass die mRNA von ZBTB2
mit miR-149 Expression (Abb negativ korreliert 4C a, p
= 0,033, R = -0,847;.. 4C b, p
< 0,001, R = -0,908). Außerdem AGS (Fig. 4D) und SGC7901 Zellen (Fig. 4E), transfiziert mit miR-149 nachahmt erheblich verminderte Expression von ZBTB2 an den Proteinspiegel (Tafeln a-b) und mRNA-Spiegel (Panel c) im Vergleich zu mock oder NC Zellen ( p
< 0,001). Unsere Ergebnisse zeigen, dass miR-149 direkt die Expression von regulieren kann ZBTB2
.

miR-149 unterdrückt GC Zellproliferation und Zellzyklus, indem sie auf ZBTB2

Als nächstes haben wir bestätigt, dass Proliferationshemmung und Induktion von Zellzyklusarrest in GC-Zellen miR-149-vermittelten erfordert Targeting von ZBTB2
. ZBTB2
wurde Ausdruck zerlegten siRNAs in AGS und SGC7901 Zellen. Western Blot (Fig. 5A, a-c) und quantitative PCR-Analyse zeigte, dass Abreicherung von ZBTB2 Videos siRNA-Transfektion signifikant von miR-149-Inhibitor könnte kompensiert und eine deutliche Zunahme der ZBTB2 wurde in Zellen transfiziert gesehen mit miR-149-Inhibitoren (5B, p
. < 0,001). MTT-Test zeigt, dass die Proliferation von Zellen mit siRNA-ZBTB2 transfiziert wurde unterdrückt und die Proliferation von Zellen mit miR-149-Inhibitoren transfiziert signifikant erhöht im Vergleich zu Zellen, die mit siRNA-NC (Kontrolle) und siRNA-ZBTB2 + miR-149 (Abb. 5C ). Weiterhin würde eine Hemmung von ZBTB2
Ausdruck fördert G0 /G1-Arrest und unterdrückt die G0 /G1 Zellzyklusarrest induziert durch miR-149-Hemmer in AGS und SGC7901 Zellen im Vergleich zu NC-Kontrollzellen (Abb. 5D-5E, p
< 0,001). Unsere Ergebnisse legen nahe, dass miR-149 hemmt GC Zellproliferation und Zellzyklus-Progression durch Hemmung ZBTB2
Ausdruck.

Einführung von miR-149, die Expression von ZBTB2 und Zellzyklus-verwandte Proteine ​​verändert

ZBTB2 wurde berichtet, ein potenter Repressor des ARF-HDM2-p53-p21-Weg zu sein, die in Zellzyklusregulation wichtig ist (41). Um die Regulation dieser Proteine ​​von miR-149 in GC-Zellen zu untersuchen, transfizierten wir AGS und SGC7901 Zellen mit miR-149 nachahmt oder miR-NC und ausgeführt RT-PCR und Western-Blot-Analyse für ZBTB2 Zielgene. Wie in 6A und 6B gezeigt ist, ektopische Expression von miR-149 downregulates die Expression von ZBTB und HDM2 und upregulates die Expression von ARF, p53 und p21 ( p
< 0,001). Diese Daten sind konsistent mit der Funktion der in ZBTB2 Unterdrückung der Transkription von ARF, p53 und p21 und die Aktivierung der Expression von HDM2 (41). Außerdem umgekehrt ektopische Expression von ZBTB2 durch Transfektion der miR-149-vermittelte Reduktion der HDM2 Expression und Erhöhung der ARF, p53 und p21-Expression in AGS und SGC7901 Zellen (Abb. 6A-B). . Ectopic ZBTB2 Expression wurde in transfizierten AGS und SGC7901 Zellen bestätigt (Abb S3, SGC7901 Zellen, F = 806,365, p
< 0,001; AGS-Zellen, F = 1436,300, p
< 0,001). ARF, p53 und p21 fördern Zellzyklus daher ihre Herabregulation durch Expression von miR-149 imitiert, erklärt der G0 /G1-Phase Arrest in AGS und SGC7901 Zellen.

Diskussion

Zunehmende Hinweise darauf, dass miRNAs spielen eine entscheidende Rolle bei der Krebsentstehung und Progression von Krebs [21]. Veränderte miRNA-Expressionsniveaus wurden bei der Initiierung und Entwicklung von Tumoren beteiligt; Modulation von miRNAs, die als negative Regulatoren von Onkogenen oder Tumorsuppressoren Ergebnisse in die Förderung der Krebszellproliferation und das Wachstum [28] funktioniert - [32]. Frühere Studien haben gezeigt, dass die Rolle von miR-149 in dem Fortschreiten von verschiedenen Typen von Tumoren umstritten ist [33] - [36], [38]. Das Expressionsmuster und die Ziele von miR-149 unterscheiden sich in verschiedene Arten von Tumoren. miR-149-Expression in einigen Tumoren herunterreguliert, als Tumorsuppressor fungieren von Onkogenen in einigen Krebsarten zielen. Zum Beispiel wird in einem klarzelligen Nierenzellkarzinom miR-149 nach unten reguliert und seine wahrscheinliche Ziele wurden als KCNMA1 und LOX (35) identifiziert. Darüber hinaus ist miR-149 auch in Glioblastomzellen herunterreguliert und wurde als Tumorsuppressor durch gezielte RAP1B, CD47, CCN1 und NXF1 [36] zu handeln vorgeschlagen. Im Gegensatz dazu kann miR-149 auch als ein Tumorsuppressor-Funktion von bestimmten Onkogenen Targeting. Der Nachweis von miRNA-Expressionsprofile in verschiedenen klinischen Stadien des Nasen-Rachen-Karzinom (NPC) und Lymphe NPC Knoten Metastasen zeigt, dass die Expression von miR-149 in NPC upregulated und Ausdruck seines Zielgens, Smad2
, verringert mit das Fortschreiten der NPC [38]. Eine ähnliche onkogene Rolle für miR-149 wurde auch in dem Hochregulation von miR-149 bewirkt, dass die Herunterregulierung von GSK3-α und Hochregulation von Mcl-1, was zu einer apoptotische Resistenz [34] in Melanom gesehen. Bisher ist wenig über die Rolle der miR-149 in Magenkrebs bekannt. Hier berichten wir, dass miR-149 Expression bemerkenswert in mehreren Magenkrebszelllinien und klinischen Proben im Vergleich mit der normalen Magen-epithelialen Zellen und abgestimmt angrenzenden normalen Gewebe bzw. reduziert wird. Wichtig ist, dass das Niveau der miR-149 Expression mit der Differenzierung Grad der GC-Zellen und Proben zugeordnet sind; schlecht differenzierten GC-Zellen oder Proben haben niedrigere miR-149 Expression im Vergleich zu gut differenzierten Proben. Die ektopische Expression von miR-149 hemmt Zellen-Proliferation und Zellzyklus, indem sie auf ZBTB2
in AGS und SGC7901 Zellen. miR-149 und ZBTB2 Expression sind in GC-Zellen und klinischen Proben negativ korreliert, und die Überexpression von miR-149 bewirkt, dass die Herunterregulierung von ZBTB2
. Depletion von ZBTB2 führt zu einer Hemmung von AGS und SGC7901 Zellen-Proliferation und Zellzyklus-Progression. Zusammengefasst zeigen diese Ergebnisse zum ersten Mal, dass ZBTB2 kann als ein Onkogen in der Tumorgenese von Magenkrebs funktionieren.

Unsere Daten zeigen, dass die Einführung von miR-149 in GC-Zellen induziert Arrest des Zellzyklus, was darauf hindeutet, dass miR-149 Ziele können in der Zellzyklusregulation beteiligt sein. ZBTB2 ist ein POK Familie Transkriptionsfaktor, der die ARF-HDM2-p53-p21-Weg unterdrücken kann [41]. ARF, ein Tumorsuppressor [42] kann durch anhaltende mitogene Stimulation und spielt eine Schlüsselrolle bei der Aktivierung von p53 unabhängig voneinander und zum Steuern der Stabilität von p53 durch Wechselwirkung mit HDM2 [43], ein wichtiger Regulator von p53 induziert werden. Der Tumorsuppressor p53 spielt eine kritische Rolle bei der Aufrechterhaltung der Homöostase Zelle durch Induktion der Zellzyklusarrest und Apoptose bei Zellen Stressoren ausgesetzt werden, wie Hypoxie, DNA-Schädigung und Telomerdysfunktion [44]. p21, p53 ein Zielgen, vermittelt Zellzyklus-G1-Phase Verhaftung durch die Bindung und die Aktivität von Cyclin-CDK2 oder CDK1 Komplexe Hemmung [45]. ZBTB2 können die Transkription von ARF, p53 und p21, unterdrücken und HDM2 Ausdruck [41] induzieren. Um zu überprüfen, ob die Auswirkungen des Zellzyklus induziert durch miR-149 Expression durch ZBTB2 Verlust vermittelt wird, untersuchten wir die Expression von HDM2, ARF, p53 und p21 von AGS und SGC7901 Zellen, die mit miR-149 imitiert. Wir fanden heraus, dass die ektopische Expression von miR-149 führt zu einer erhöhten Expression von ARF, p53 und p21 und verminderte Expression von hdm2 und ZBTB2. Diese Ergebnisse unterstützen die Idee, dass miR-149 übt seine Rolle GC-Zellen-Proliferation und Zellzyklusprogression zu hemmen, indem sie auf ZBTB2
dadurch die Modulation der Expression von nachgeschalteten Regler des Zellzyklus.

Zusammengefasst unsere Daten zeigen, dass miR-149 als Tumorsuppressor in Magenkrebszellen funktionieren kann und spielt eine wichtige Rolle ZBTB2
bei der Hemmung. Daher Herabregulation von miR-149 fördert GC Zellproliferation und Zellzyklus-Progression. Darüber hinaus zeigen unsere Ergebnisse, dass ZBTB2 als ein Onkogen in der Entwicklung von Magenkrebs fungieren. Doch angesichts der Tatsache, dass jedes miRNA Gene viele Ziel regulieren können, die Karzinogenese auf unterschiedliche Weise beeinflussen können, sind weitere Studien erforderlich andere miR-149 Ziele zu untersuchen, die eine entscheidende Rolle bei GC tumorigenesis haben. Die vorliegende Studie stellt auch neue Einblicke in die Rolle von miR-149 in menschlichen Magenkrebsprogression und zeigt an, dass miR-149 als ein therapeutisches Ziel für die Behandlung von Magenkrebs dienen kann.

Materialien und Methoden

Statement
Ethik

Für Gewebeproben wurde eine schriftliche Einverständniserklärung von Patienten erhalten. Die Verfahren in dieser Studie verwendet wurden von der Institutional Review Board der Vierten Military Medical University zugelassen und wurde in der Erklärung von Helsinki und der lokalen Gesetzgebung angepasst.

Die Zelllinien und Kulturbedingungen

Magen Krebslinien AGS, MKN28, MKN45 wurden von AGCC und GC9811 und SGC7901 gekauft Zelllinien wurden von Beijing Institute of Oncology erhalten. Alle Zelllinien wurden in unserem Institut gehalten gemäß den empfohlenen Protokolle. Zellen wurden in RPMI-1640-Medium (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) mit 10% fötalem Rinderserum (FBS) (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) bei 37 ° C in einer 5% CO _{2 -Inkubator .}

Humanproben

Alle experimentellen Verfahren, die von der Institutional Review Board der Vierten Military Medical University genehmigt. Eine schriftliche Einverständniserklärung wurde für alle Patienten samples.Human Magenkrebs Proben (n = 44) und angepasst benachbarten Nicht-Tumorproben wurden von Patienten bei Xijing Hospital of Digestive Diseases erhalten, die Vierte Military Medical University, mit Einverständniserklärung von jedem Patienten.

RNA-Reinigung, cDNA-Synthese und quantitative Echtzeit-PCR (qRT-PCR)

Die Gesamt-RNA von kultivierten Zellen extrahiert wurde mit Trizolreagenz (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) gemäß Protokoll des Herstellers und RNAs wurden bei -80 ° C vor der qRT-PCR-Analyse gespeichert. Ältere miR-149-Expression wurde unter Verwendung eines Mirvana TM qRT-PCR miRNA Detection Kit (Ambion Inc. Austin, Texas), mit U6 als interne Kontrolle festgestellt. ZBTB2 Expression wurde mit Primern F festgestellt: 5'ACTCGGGCGAGATCCACGGC 3 ', R: 5' ACGCAGGCTGCTCATCGGAG 3 'und GAPDH wurde als interne Kontrolle verwendet. PCR-Produkte wurden auf einem ethidiumbromidgefärbten 1,5% Agarose-Gel und visualisiert mit UV getrennt.

Zelltransfektion

Der menschliche miR-149 Duplex nachahmen und Inhibitor (miR-149) und Negativkontrolle Oligonucleotidduplex mimischen (miR-NC) wurden entwickelt und zur Verfügung gestellt von Ribobio (Guangzhou, Guangdong, China). Die small interfering RNA (siRNA) für ZBTB2 und die negative Kontroll-RNA (siRNA-NC) wurden synthetisiert und gereinigt durch Genepharma (Shanghai, China). miRNAs, siRNAs und ZBTB2 cDNA-Plasmid (FulenGen Co. China) wurden durch LipofectamineTM 2000 Reagenz transfiziert (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) nach dem Protokoll des Herstellers. Die ZBTB2 siRNA-Sequenz: F: 5 'GCUGGCUUCUUUCCAAGUU dTdT 3', R: 5 'AACUUGGAAAGAAGCCAGC 3'; Die NC-siRNA-Sequenz: F: 5'-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT -3 ', R: 5'-ACGUGACACGUUCGGAGAATT -3'

miRNA Ziel Vorhersage

Um mögliche miRNA Zielgene, TargetScanHuman Website (. http://www.targetscan.org/) verwendet wurde, wurde die freie Bindungsenergie berechnet und abwartend Websites wurden mit http://bibiserv.techfak.uni-bielefeld.de/rnahybrid Webseite analysiert.

Vector Konstrukte und die Luciferase-Reporterassay

ZBTB2-3'UTR Plasmid zu konstruieren, ein Wildtyp-3'-UTR-Fragment des menschlichen ZBTB2 mRNA (1238-1244 nt, Genbank-Nr. NM_020861.1) die mutmaßliche enthält miR-7-Bindungssequenz wurde durch RT-PCR amplifiziert und in die Stelle zwischen Xho I kloniert und I stromabwärts Nicht des Luciferase-Reportergens des psiCHECK ™ Vektor (Promega, USA). Eine Mutante des einzelnen miR-7-Bindungsstelle in der 3'-UTR von ZBTB2 (5 'GAGCCAG-3' ACCGCGC-3 bis 5 '') durch zielgerichtete Mutagenese-Kit (SBS Genetech, Beijing, China aufgenommen wurde ). Wild- und Mutantenarten pmirGLO-ZBTB2-UTR-Vektoren wurden durch DNA-Sequenzierung bestätigt

Die Nukleotidsequenzen von Primern für ZBTB2-3'UTR (MT) Klon:. MutZBTB2F: 5'GGCCTCACAAGACAAAACAGACCGCGCAAGTAAGGACTGAAGGAGAA 3 'mutZBTB2R: 5' TTCTCCTTCAGTCCTTACTTGCGCGGTCTGTTTTGTCTTGTGAGGCC 3 '

Die Nukleotidsequenzen der Primer für ZBTB2-3'UTR (WT) Klon: ZBTB2XhoIF: 5'CCGCTCGAG ATGTCACTTATCTTTTTAAAAAACTCTCA 3' ZBTB2NotIR: 5'ATAAGAATGCGGCCGC TACTCATTTAATTAAACGTTTATTC 3 'ZBTB2XhoIF2: 5'CCGCTCGAGATGTCACTTATCTTTTTAAAAAACTCTCATTTTTACAAAGACTATC 3' ZBTB2F3: 5'CCGCTCGAG CTGTAGTTCTCCATGGCATGATAC 3 '.

die Zellen wurden mit den miR-149 ahmt transfiziert, NC und pmirGLO Plasmid in 24-Well-Platten unter Verwendung von Lipofectamin ™ 2000 (Invitrogen) gemäß den Anweisungen. 48 h später wurden die Zellen geerntet und auf Luciferase-Aktivität untersucht unter Verwendung des Dual Luciferase Reporter Assay System (Promega, USA) und detektiert durch den GloMaxTM 20/20 Erfassungssystem (E5331, Promega).

Western Blotting

Das Gesamtprotein aus kultivierten Zellen wurden lysiert durch Lysepuffer PMSF auf Eis enthält. Dann Protein wurden durch 12% SDS-Polyacrylamidgelen elektrophoretisch aufgetrennt und wurden dann auf eine PVDF-Membran (Millipore) transferiert. Membranen wurden 1 h mit 5% fettfreien Milchpulver bei Raumtemperatur blockiert und über Nacht mit primären Antikörpern inkubiert. Membranen wurden nach drei 10 min Waschen in TBS-T (triethanolaminebuffered Kochsalzlösung mit Tween) mit sekundären Antikörpern markiert mit HRP für 1 h bei Raumtemperatur inkubiert. Schließlich wurden die Signale ECL-Kits nachgewiesen unter Verwendung von (Pierce Biotech., Rockford, IL, USA) und die Membranen wurden gescannt und analysiert, um ein Bio-Rad ChemiDoc XRS + Abbildungssystem mit Imaging-Software (Version Menge 1) verwendet wird. Die Protein-Expression wurde an ein endogenes Referenz (Actin) normalisiert und relativ zu der Kontrolle. Die Spectra Multicolor-Weitbereichsleiter Protein (Fermentas) wurde als molekulare Marker verwendet. Alle verwendeten Antikörper im Western-Blot-Assays sind in Tabelle S1 aufgelistet.

Immunhistochemie und immunhistochemische scoring

Paraffinschnitte, 4-um Dicke, wurden bei 65 ° C für 2 h gebacken und entparaffiniert . Antigen Retrieval wurde 15 Minuten bei Verwendung von Citrat-Natriumpuffer (pH 7,2), 95 ° C durchgeführt und dann wurden die Objektträger für 30 Minuten bei Raumtemperatur abgekühlt. Nach 15 Minuten mit 3% Wasserstoffperoxid behandelt wird, um die endogene Peroxidase zu blockieren, wurden die Schnitte für 30 Minuten mit normalem Ziegenserum Sperrflüssigkeit behandelt unspezifische Bindung zu reduzieren und dann polyklonalen Kaninchen-anti-ZBTB2 (1:500, Bioss Co . China) die Abschnitte für 12 h bei 4 ° C.After Wiedererwärmung für 1 h und Waschen für 5 mal inkubiert wurden die Schnitte mit sekundärem Antikörper für 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Diaminobenzidin (DAB) wurde für Farbreaktionen verwendet. Nachfolgende immunhistochemischen Färbung erzielt wurde, wie zuvor beschrieben [46].

MTT-Test

Zellen wurden mit 100 nM miR-149-Inhibitor (Genepharma, Shanghai, China), ahmt (Ribobio, Guangzhou, Guangdong, China) oder 100 nM siRNA-ZBTB2 (Genepharma) .Twenty-vier später wurden die Zellen in 96-Well-Platten (2 × 103 /Vertiefung) ausgesät. Die Lebensfähigkeit der Zellen wurde durch MTT untersucht (3-2, 5-Diphenyl tetrazoliumbromid) Assay (Sigma, USA) täglich für 6 Tage.

Zellzyklus-Test mittels Durchflusszytometrie

Magenkrebs Zelllinien, AGS und SGC7901 wurden in RPMI-1640-Medium (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), ergänzt mit 10% FBS in Platten mit 6 Vertiefungen gezüchtet. Die Transfektion wurden durchgeführt, wenn die Zellen erreicht 80 %% - 90% Konfluenz. Anschließend wurden die Zellen geerntet, zweimal mit PBS gewaschen und über Nacht in 70% Ethanol bei 4 ° C fixiert. Dann wurden die Zellen für 1 h mit Propidiumiodid bei Raumtemperatur inkubiert und wurden durch die Strömung analysiert Zytometrie eine FACScan Durchflusszytometer (BD Biosciences, Mountain View, CA) verwendet wird. Diese Daten wurden mit FlowJo (FlowJo) analysiert.

Die statistische Analyse

Die Daten wurden als Mittelwert ± SEM von drei unabhängigen Experimenten ausgedrückt. Für statistische Tests, SPSS Statistik-Software-Paket, version17.0 (SPSS, Chicago, IL, USA) verwendet wurde. Der Student-t-Test, die Einweg-ANOVA und Zwei-Wege-ANOVA-Test wurden für die MTT-Assays, quantitative PCR und Tumorwachstumskurve durchgeführt. Die Korrelation zwischen miR-149 und ZBTB2 wurde mit Spearman Rangkorrelation analysiert. P-Werte < 0,05 wurden als statistisch signifikant betrachtet

Hintergrundinformationen
Abbildung S1..
Wildtyp und Mutante ZBTB2
-3'UTR die mutmaßliche Bindungsstelle von miR-149 enthielten, wurden kloniert in psiCHECK-2-Vektor. A. ZBTB2
-3'UTR wurde aus genomischer DNA von AGS amplifiziert. B. Lane 1,3, 5: Rekombinante Plasmide von ZBTB2-1, ZBTB2-2, ZBTB2-3
sind; Spur 2,4,6: Ergebnisse der Enzymverdauung von rekombinanten Plasmiden von ZBTB2-1, ZBTB2-2 bzw. ZBTB2-3
. Die Ergebnisse zeigten, dass ZBTB2
-1/2/3 erfolgreich in die Vektoren eingeführt worden (M1:. DL2000 DNA-Marker; M2: DL1 kb DNA-Marker; ZTBT2-1 /2/3 Bands: 1406 bp; Vektoren Bands: 6.1 Kb). C. M1: 1 kb DNA Ladder Marker. Spur 1: Amplifikation von mut ZBTB2
F1 /R1 (Negativkontrolle ohne Taq-Enzym); Spur 2: Amplifikation von mut ZBTB2
F1 /R1. Eine Bande von mut ZBTB2
(7.6 Kb) demonstriert die erfolgreiche PCR von mutierten Verstärkung. D. Sequenzierung Ergebnisse von WT- ZBTB2
und MT - ZBTB2
doi:. 10.1371 /journal.pone.0041693.s001
(TIF)
Abbildung S2 .
ZBTB2 Expression in menschlichen Magenkrebs Proben und abgestimmt angrenzenden normalen Geweben. A. Repräsentative gezeigten Bilder sind positive immunohistochemische Färbung von ZBTB2 in menschlichen Magenkrebsproben (b-c) und angepaßten benachbarten normalen Geweben (a) (Vergrößerung 200 ×). B. immunhistochemische Färbung erzielt wurde, wie zuvor beschrieben [46]; statistische Analyse der Daten auf dem ZBTB2 Ausdruck Unterschied zwischen menschlichen Magenkrebs Proben und abgestimmt benachbarten nicht-Krebsgewebe (One-Way ANOVA-Analyse, F = 117,280, *** p
< 0,001).

• PLoS ONE: CYP2E1 RsaI /PstI Polymorphismus und Magenkrebs Immission: Meta-Analysen Basierend auf 24 Fall-Kontroll-Studies
• PLoS ONE: Genetische Anfälligkeitsfaktoren auf Gene, die in der Steroidhormon-Biosyntheseweg und Progesterone Receptor für Magenkrebs Risk