PLoS One: a mikro-RNS-149 proliferációját gátolja, és a sejtciklus előrehaladását a célzás a ZBTB2 Humán gyomorkarcinóma

absztrakt katalógusa

Egyre több bizonyíték utal arra, hogy a miR-149 egyaránt elnyomja és elősegíti a tumor növekedését függően a tumor típusát. Azonban a szerepe a miR-149, a progresszió gyomorrák (GC) továbbra is ismeretlen. Kimutattuk, hogy a miR-149 egy tumor szupresszor humán gyomorrák. miR-149 expresszió csökkent GC sejtvonalak és klinikai mintákból képest normál gyomornyálkahártya sejt és szövetek, ill. Az expressziós szinteket a miR-149 is korrelál a differenciálódás foka GC sejteket és szöveteket. Sőt, ektopikus expressziója miR-149 a gyomorrák-sejtek proliferációját gátolja, és a sejtciklus progressziójában által alulszabályozza ZBTB2 katalógusa, egy erős represszor az ARF-HDM2-p53-p21 útvonal, a potenciális kötőhelyet miR-149 annak mRNS-3'UTR. Azt is tapasztaltuk, hogy ZBTB2 expresszió növekedése GC sejtekben és szövetekben, összehasonlítva a normál gyomornyálkahártya sejt és szövetekben, ill. Csendesítése ZBTB2
vezet elnyomása sejtek növekedését és sejtciklus G0 /G1 fázisban, jelezve, hogy ZBTB2 is működhet, onkogén GC. Továbbá transzfekciója miR-149 utánozza a gyomor rákos sejteket indukál down-regulációja ZBTB2 és HDM2, és up-regulációját ARF, p53, és a p21 a kontrollhoz képest. Összefoglalva, adataink azt mutatják, hogy a miR-149 működik, mint egy tumorszuppresszor humán gyomorrák által, legalább részben keresztül, célzás ZBTB2
.

bevezető hivatkozás: Wang Y, Zheng X., Zhang Z, Zhou J., Zhao G, Yang J, et al. (2012) a mikro-RNS-149 proliferációját gátolja, és a sejtciklus előrehaladását a célzás a ZBTB2 katalógusa Humán gyomorrákban. PLoS ONE 7 (10): e41693. doi: 10,1371 /journal.pone.0041693 katalógusa

Szerkesztő: Wael El-Rifai, Vanderbilt University Medical Center, Amerikai Egyesült Államok katalógusa

Beérkezett: március 13, 2012; Elfogadva: június 25, 2012; Megjelent: október 29, 2012 katalógusa

Copyright: © 2012 Wang et al. Ez egy nyílt hozzáférésű cikk feltételei szerint terjeszthető a Creative Commons Nevezd meg! Licenc, amely engedélyezi a korlátlan használatát, a forgalmazás és a reprodukció bármilyen adathordozón, feltéve, hogy az eredeti szerző és a forrás jóváírásra. Katalógusa

Forrás: Ez a munka ben támogatták a Nemzeti Természettudományi Alapítvány Kína (no. 30872966 és nem. 31071135), Nemzeti Természettudományi Alapítvány Kína (no. 81000864, ​​no. 81172290, no. 91129723, no. 81090270, és nem. 81090273) , és a kínai Posztdoktori Science Foundation (nincs. 20100471776). A finanszírozók nem volt szerepe a tanulmány tervezés, adatgyűjtés és elemzés, döntés, hogy közzéteszi, vagy a készítmény a kézirat. Katalógusa

Érdekütközés: A szerzők kijelentették, hogy nem ellentétes érdekek léteznek. Katalógusa

Bevezető

a gyomorrák (GC) az egyik leggyakoribb rákos megbetegedések és a fő oka a daganatos halálok világszerte, különösen Kelet-Ázsiában, a legfrissebb globális becslés 2011-ben megjelent [1]. Annak ellenére, hogy a figyelemre méltó csökkenést GC előfordulása a legtöbb a világ, még mindig nagy teher a nagyszámú GC megbetegedések és halálesetek világszerte. A karcinogenezis GC egy nagyon bonyolult folyamat [2] - [5] járó szabályozási zavarának több gén [6] - [8], beleértve az onkogének [9] - [14], és tumorszuppresszorok [15] - [18]. Azonban a molekuláris mechanizmusok szükséges GC kialakulásának és progressziójának tovább kell vizsgálni. Katalógusa

A mikroRNS (miRNS) egy csoportja az endogén kifejezve, nem kódoló RNS-ek kis (20-25 nukleotid hosszúságú) ismert negatív szabályozzák a génexpressziót azáltal, hogy elnyomja fordítás vagy csökkentésével stabilitását mRNS-ek által közvetlenül kötelezőek a 3'-nem transzlatált régió (3'-UTR) a megcélzott mRNS-ek [19], [20]. Egyre több bizonyíték jelzi, hogy a miRNS-ek fontos szerepet játszanak a fejlődés, anyagcsere, proliferáció, differenciálódás és apoptózis. Ezen túlmenően, az aberráns poszt-transzkripciós szabályozása mRNS-ek által miRNS kapcsolódik a tumorigenezis [21]. Abnormális expressziója profilok miRNS mutattak ki a különböző típusú emberi tumorok, beleértve a tüdő [22], emlő [23], a prosztatában [24], a májban [25], a vastagbél, [26] és a gyomorrák [27]. Sőt, egyes miRNS működhet onkogének vagy tumorszupresszorok szabályozása által a célgének expresszióját, amelyek fontos szerepet játszanak a sejtciklus előrehaladását, apoptózis vagy proliferáció. miR-22 [28], a miR-101 [29], és a miR-7 [30] mind kimutatták, hogy downregulált tumor minták és a funkciója, mint tumorszuppresszorok; miR-17 [31] és a miR-21 [32] kimutatták, hogy szabályozva az tumorfajták és funkció, mint onkogének. Ezek a tanulmányok azt jelzik, hogy szabályozási zavarának miRNS gyakran részt vesz a karcinogenezis és a rák progressziójának.

A legújabb vizsgálatok azt sugallják, hogy a miR-149 is fontos szerepet játszanak a különböző betegségek, többek között a progresszió a rosszindulatú daganatok. miR-149 kimutatták, hogy funkcionálhat mind tumorszuppresszor [33] és egy onkogént [34] a fejlesztés különböző típusú szilárd daganatok. Például elvesztése miR-149 vezet, hogy megszerezzék a funkció bizonyos onkogének korrelál a tumor grade vesesejtes karcinóma [35], asztrocitómákat [36], és a prosztata karcinóma [37]. Méhen kívüli kifejezése miR-149 apoptózist indukál neuroblastoma és HeLa sejtekben [33]. Emelkedett expressziójának miR-149 leírták, hogy fontos a progresszióját nazofaringeális karcinóma [38] és a melanoma metasztázisok [34]. Továbbá szabályozási zavarának miR-149 is érintett az egyes nem-daganatos betegségek. Például alulszabályozása miR-149 expressziós részt vesz a fejlesztése az elsődleges myelofibrosis, policythemia vera, és esszenciális trombocitémia [39], és a veszteség a miR-149 elnyomja a hepatitis C vírus (HCV) RNS bőség [40]. Azonban az expressziós mintázata és szerepe miR-149 a fejlesztés a GC tisztázatlan marad.

A jelen vizsgálatban azt találtuk, hogy a miR-149 jelentősen downregulált GC sejtvonalakban és klinikai minták képest az normál gyomornyálkahártya sejt és a szomszédos nem-tumoros szövetben, ill. Méhen kívüli kifejezése miR-149 proliferációját gátolja, és indukálja G0 /G1 AGS és SGC7901 sejtek in vitro katalógusa megcélozva ZBTB2 katalógusa. Továbbá, az ózonréteg ZBTB2 katalógusa siRNS gátlását eredményezi proliferációs és sejtciklus leállásra. Az expressziós mintázata a miR-149 és ZBTB2 GC sejtvonalak és klinikai mintákat fordítottan arányos, továbbá arra utal, hogy ZBTB2 katalógusa célpontja gén miR-149. Bevezetés a miR-149 eredményeket változtatta meg a kifejezés a p53, p21, ARF, és HDM2 tagjai az ARF-HDM2-p53-p21 bioszintézisutat, amely szabályozza ZBTB2. Összefoglalva, ezek az eredmények megerősítik, hogy a miR-149 downregulált GC-sejtek és a klinikai minták és azt sugallják, hogy a miR-149 működik, mint egy szuppresszor gyomorrák sejtek növekedését gátlásával proliferáció és a sejtciklus progressziójában.

Eredmények

Expression miR-149 downregulált GC sejtvonalak és klinikai minták

szerepének értékeléséhez miR-149 a karcinogenezis GC, először használt kvantitatív RT-PCR mérésére kifejezése miR-149 humán GC sejtvonalak (MKN45, GC9811, AGS, SGC7901, és MKN28), és megállapította, hogy a miR-149-ben downregulált GC sejtvonalak, mint a normál gyomornyálkahártya sejtvonal, GES-1 (1A.). Különösen az expressziós szintje a miR-149 pozitívan korrelált a differenciálódás foka GC sejteket. Nevezetesen, az expressziós szint a miR-149 rosszul differenciált sejtvonalak, mint például a MKN45, GC9811, és AGS, lényegesen alacsonyabb, mint a mérsékelten és jól differenciált sejtvonalak. A kifejezés a miR-149 közepesen differenciált sejtek, SGC7901, alacsonyabb, mint a jól differenciált sejtvonal MKN28 (1A.). Katalógusa

Annak érdekében, hogy eldönthessük szinten a miR-149 is korrelál a differenciálás mértékét daganatok kifejeződését vizsgáltuk a miR-149 44 humán klinikai minták GC, köztük 13 rosszul, 16 közepesen és 15 jól differenciált mintákat. Azt találtuk, hogy a kifejezés a miR-149 a gyomor tumorok rendkívül alacsonyabb, mint a párosított normál szomszédos szövetek (ábra. 1B). Sőt, a kifejezés a miR-149 több differenciált daganatokban magasabb volt, mint a kevésbé differenciált (ábra. 1C, F = 65,391, p katalógusa < 0,001). Emellett csökkent expressziója miR-149 korrelál nyirokcsomómetastasis (* p katalógusa = 0,046) és a TNM (** p katalógusa = 0,0011) (1. táblázat). Katalógusa

Méhen kívüli kifejezése miR-149 proliferációját gátolja, és indukálja G0 /G1 AGS és SGC7901 sejtek

szerepének vizsgálata a miR-149 GC sejtekben alkalmaztunk, gyengén és közepesen differenciált GC sejtvonalak AGS és SGC7901, ill. AGS és SGC7901 sejteket tranziensen transzfektáltunk eithermature miR-149-utánzatok, inhibitor, mock transzfektált, vagy miR-NC. Amint a 2a ábrán látható, a 2D, kvantitatív RT-PCR-eredmények azt mutatják, hogy az expresszió a miR-149 utánozza, vagy inhibitorok jelentősen upregulate vagy downregulate expressziójának miR-149, illetve a AGS és SGC7901 sejteket az első-ötödik napon a transzfekció utáni (ábra . a 2A, F = 8,429, p = 0,003 katalógusa; ábra. 2D, F = 8,595, p katalógusa = 0,003), mint a NC és ál ellenőrzéseket. katalógusa

AGS SGC7901 transzfektált sejtek miR-149 utánozza és inhibitorok szignifikánsan alacsonyabb és magasabb szintű sejtproliferáció volt, mint az NC, vagy ál csoportok által meghatározott MTT assay (ábra. 2B, F = 27,47, p 0,001; ábra. 2E, F = 44,061, p < 0,001). Transzfekciója AGS és SGC7901 sejtek miR-149 utánozza eredményez jelentős G1 fázis leállását képest NC és mock kontrollok ( p
< 0,05). Továbbá kezelés miR-149-gátlók vezetett kevesebb AGS és SGC7901 sejtek G1 képest NC és mock kontroll ( p katalógusa < 0,05) (ábra. 2C, F = 134,177, p
< 0,001 mutatja be. 2F, F = 58,792, p = 0,003 katalógusa). katalógusa

ZBTB2 katalógusa célpontja a miR-149 katalógusa

Korábbi adatok azt sugallják, hogy a miR-149 lehet egy szuppresszor GC sejtnövekedést célozza szabályozó gének proliferációját és a sejtciklus előrehaladását (33-34) (38). Így kerestünk további potenciális célpontjai a miR-149-re TargetScanHuman adatbázisban. Mi azonosított számos potenciális miR-149 target gének, köztük ZBTB2 katalógusa, a POK család transzkripciós faktor és hatásos represszor az ARF-HDM2-p53-p21 útvonal (41). ZBTB2 katalógusa találták, hogy a feltételezett miR-149 kötőhely belül 3'UTR (3A.). Luciferáz riporter vizsgálatot végeztünk annak megállapítására, hogy ZBTB2 katalógusa közvetlen célpontja a miR-149 segítségével AGS és SGC7901 sejteket. Mi kotranszfektált AGS és SGC7901 sejtek rendre egy psiCHECK-2 vektor, amely vagy 3'UTR az ZBTB2 vagy mutált 3'UTR az ZBTB2, és utánozza a miR-149 vagy inhibitorok miR-149. A vad típusú és mutáns ZBTB2-3'UTR tartalmazó feltételezett kötőhely miR-149 klónoztuk psiCHECK-2 vektor downstream luciferáz gén (ábra. S1). Bevezetés a miR-149 szignifikánsan csökkentette a luciferáz aktivitást a ZBTB2 3'UTR riporter vektor (ábra. 3B-3C, p
< 0,001), de nem volt hatással a luciferáz aktivitást a mutáns ZBTB2-3 'UTR riporter vektor. Ezek az adatok arra utalnak, hogy a miR-149 közvetlenül szabályozza ZBTB2 katalógusa szinteket. Továbbá, nincs jelentős csökkenése viszonylagos luciferáz aktivitás sejtekben kotranszfektáltuk miR-149 inhibitor vagy 3'UTR-ZBTB2 /psiCHECK-2 vektor (ábra. 3B-3C). Ez talán azért, mert a hiánya közötti kölcsönhatás 3'UTR a ZBTB2 és endogén miR-149, így csökkent miR-149 expresszió nem növekedett a luciferázaktivitást a ZBTB2-3'UTR riporter vektort. Ezek az eredmények megerősítik, hogy a miR-149 elnyomja ZBTB2 kifejezés megcélozva 3'-UTR ZBTB2 katalógusa mRNS.

miR-149 és ZBTB2 kifejezés negatívan korrelál a GC-sejtek és klinikai minták

Ahhoz, hogy tovább vizsgálják a kapcsolat miR-149 és ZBTB2 megvizsgáltuk expresszióját ZBTB2 GC sejtek western blot és GC szövetek immunhisztokémiai. Azt találtuk, hogy a GC-sejtek szignifikánsan magasabb expressziós szintjét ZBTB2, mint a normál gyomornyálkahártya sejt, GES-1 (4A. A-B F = 167,843, p
< 0,001). ZBTB2 kifejezés negatívan korrelált a differenciálódás mértékét a GC-sejtek; rosszul differenciált GC szövetekben mutatott szignifikáns magasabb ZBTB2 expressziós szint, mint a jól differenciált GC szövetek és párosított normál gyomor szövetekben (ábra. S2A-B, F = 117,280, p
< 0,001). ZBTB2
mRNS expressziós szintek egybeesik a fehérje szinten (ábra. 4B A, F = 283,355, p
< 0,001). Továbbá, a kifejezés a miR-149 és ZBTB2 fordítottan arányos (ábra. 4B b, p katalógusa = 0,033, R = -0,908). Ezután mérjük expressziós szintjét miR-149 és ZBTB2 katalógusa kvantitatív RT-PCR 5 GC sejtvonalak (MKN45, GC9811, AGS, SGC7901 és MKN28) (ábra. 4C) és 18 GC klinikai minták (6 rosszul, 6 közepesen és 6 jól differenciált minták) (ábra. 4C b). Eredményei megerősítik, hogy az mRNS szint ZBTB2
negatívan korrelál a miR-149 expresszió (ábra. 4C egy p katalógusa = 0,033, R = -0,847; ábra. 4C b, p katalógusa < 0,001, R = -0,908). Sőt, AGS (ábra. 4d) és SGC7901 sejtek (ábra. 4E) transzfektált miR-149 utánozza jelentősen csökkent expressziója ZBTB2 a fehérje szinten (a panelek A-B) és az mRNS-szintek (C panel), összehasonlítva a mock vagy NC sejteket ( p katalógusa < 0,001). Eredményeink azt mutatják, hogy a miR-149 közvetlenül expresszióját szabályozzák ZBTB2 katalógusa.

miR-149 elnyomja GC sejtburjánzás és a sejtciklus progressziójában megcélozva ZBTB2 Matton

a következő azt megerősítette, hogy a miR-149-közvetített proliferáció gátlás és indukció sejtciklus GC sejtek igényel megcélzása ZBTB2 katalógusa. ZBTB2 katalógusa kifejezést letaglózott a siRNS AGS és SGC7901 sejteket. Western-blot (ábra. 5A, A-C) és a kvantitatív PCR-analízis azt mutatta, hogy kimerülése ZBTB2
siRNS transzfekció lehetne ellensúlyozni jelentősen miR-149 inhibitor és jelentős növekedést ZBTB2 volt látható transzfektált sejtekben miR-149-gátlók (ábra. 5B, p katalógusa < 0,001). MTT assay azt mutatja, hogy proliferációját transzfektált sejtek siRNS-ZBTB2 elnyomták és elterjedése a transzfektált sejtek miR-149 inhibitorok jelentős mértékben megemelkedett, hogy transzfektált sejtek siRNS-NC (kontroll) és siRNS-ZBTB2 + miR-149 (ábra. 5C ). Továbbá gátlása ZBTB2 katalógusa kifejezés elősegíti G0 /G1 és az elnyomja a G0 /G1 sejtciklusmegállás indukált miR-149 inhibitor kezelés AGS és SGC7901 sejtekben, mint a NC vezérlés sejtek (ábra. 5D-5E, p katalógusa < 0,001). Eredményeink arra utalnak, hogy a miR-149 gátolja GC sejtburjánzás és a sejtciklus progressziójában gátlásával ZBTB2 katalógusa kifejezést.

Bevezetés a miR-149 megváltozott expresszióját ZBTB2 és a sejtciklus kapcsolódó fehérjék

ZBTB2 leírták, hogy hatásos represszor az ARF-HDM2-p53-p21 útvonal, ami fontos a sejtciklus szabályozásában (41). Hogy vizsgálja meg a szabályozás ezen fehérjék miR-149 GC sejtekben, mi transzfektált AGS és SGC7901 sejtek miR-149 utánozza, vagy miR-NC és végzett RT-PCR és Western blot analízis ZBTB2 célgénjeinek. Amint az a 6A-6B, ektopikus expressziója miR-149 gátló módon szabályozza a kifejezés a ZBTB és HDM2 és upregulálja expresszióját ARF, p53, és a p21 ( p
< 0,001). Ezek az adatok összhangban vannak a funkciója ZBTB2 a elnyomását transzkripcióját ARF, p53, és a p21 és aktiválja a kifejezése HDM2 (41). Sőt, ektopikus expressziója ZBTB2 transzfekcióval megfordította a miR-149 által közvetített csökkenését HDM2 expresszió és növekedése ARF, p53, és a p21-expresszió AGS és SGC7901 sejtek (ábra. A 6A-B). Méhen kívüli ZBTB2 kifejezés megerősítette transzfektált AGS és SGC7901 sejtek (ábra. S3, SGC7901 sejtek, F = 806,365, p katalógusa < 0,001; AGS sejtek, F = 1.436,300, p katalógusa < 0,001). ARF, p53 és p21 elősegíti a sejtciklus előrehaladását ezért azok downregulációját expressziója által miR-149 utánozza magyarázza a G0 /G1 fázisban letartóztatását AGS és SGC7901 sejteket. Katalógusa

Vita katalógusa

Egyre több bizonyíték arra utal, hogy miRNS kritikus szerepet játszanak a carcinogenesisben és a rák progressziója [21]. Altered miRNS expressziós szintek hozták összefüggésbe a kezdeményezése és fejlesztése daganatok; modulációja miRNS funkcionáló, negatív szabályozó onkogének vagy tumorszupresszorok eredményezi előmozdítása rákos sejtek szaporodását és növekedését [28] - [32]. Korábbi tanulmányok kimutatták, hogy a szerepe a miR-149 a progresszió a különböző típusú daganatok ellentmondásos [33] - [36], [38]. Az expressziós mintázata és célokat a miR-149 változhat a különböző típusú daganatok. miR-149 expresszió downregulált bizonyos tumorok, működik, mint egy tumorszuppresszor célzásával onkogének egyes daganatok. Például, a világos sejtes vesesejtes karcinóma miR-149 downregulált és valószínű célokat azonosítottuk KCNMA1 és LOX (35). Továbbá, a miR-149 is downregulált a glioblasztóma sejtek és javasolták, hogy egyfajta tumorszuppresszor célzásával RAP1B, CD47, CCN1, és NXF1 [36]. Ezzel szemben, a miR-149 is funkcionálhat tumorszuppresszor célzásával bizonyos onkogének. Kimutatása miRNS expressziós profilok különböző klinikai stádiumaiban orr-garat karcinóma (NPC) és NPC nyirokcsomómetastasis azt mutatja, hogy a kifejezés a miR-149 felülszabáiyoződik NPC és kifejezése a megcélzott gén, Smad2 katalógusa, csökken a progresszióját NPC [38]. Hasonló onkogén szerepe miR-149 is látható volt a melanoma, amelyben túlszabályzását miR-149 okozza downregulációját GSK3-α és fokozza a Mcl-1, ami apoptotikus ellenállás [34]. Eddig keveset tudunk arról, milyen szerepet miR-149 gyomorrákban. Itt azt jelentették, hogy a miR-149 expressziós jelentős mértékben lecsökken több gyomorrák sejtvonalakat és klinikai minták összehasonlítva a normál gyomornyálkahártya sejt, és kiegyenlített szomszédos normális szövetekben, ill. Fontos, hogy a szint a miR-149 expressziós társul a differenciálódás foka GC sejtek és példányok; rosszul differenciált sejtek GC vagy példányokat alacsonyabb miR-149 expresszió, mint a jól differenciált mintákat. Méhen kívüli kifejezése miR-149 gátolja a sejtek szaporodását és a sejtciklus progressziójában megcélozva ZBTB2 katalógusa AGS és SGC7901 sejteket. miR-149 és ZBTB2 kifejezés negatívan korrelálnak a GC-sejtek és klinikai mintákból, és túlzott mértékű miR-149 okozza downregulációját ZBTB2 katalógusa. Kiürülése ZBTB2 gátlását eredményezi AGS és SGC7901 sejtek proliferációját és a sejtciklus progressziójában. Együttesen ezek az eredmények azt mutatják, az első alkalommal, hogy ZBTB2 működhet egy onkogént a tumorigenezisben gyomorrák.

Adataink azt mutatják, hogy a bevezetése a miR-149 a GC-sejtek sejtciklusleállást, ami arra utal, hogy a miR-149 célokat érintett lehet a sejtciklus szabályozásában. ZBTB2 egy POK család transzkripciós faktor, amely elnyomja az ARF-HDM2-p53-p21 útvonal [41]. ARF, tumorszuppresszor [42], indukálható tartós mitogén stimuláció és kulcsfontosságú szerepet játszik aktiválásában p53 függetlenül és szabályozására a stabilitás a p53 kölcsönhatás révén HDM2 [43], egy fontos szabályozója a p53. A tumor szuppresszor a p53 kritikus szerepet játszik a karbantartási sejt homeosztázis keresztül indukáló sejtciklus és apoptózis, amikor a sejteket vetjük alá stressz, például hipoxia, DNS-károsodás, és a telomer diszfunkció [44]. P21, p53-célgén, közvetíti a sejtciklus G1 fázis leállását keresztül kötődés és aktivitásának gátlására ciklin-CDK2 vagy CDK1 komplexek [45]. ZBTB2 is elnyomják a transzkripciós ARF, p53, p21, és indukálják HDM2 kifejezés [41]. Annak megerősítését, hogy a sejtciklus által kiváltott miR-149 expresszió közvetítik ZBTB2 veszteség, megvizsgáltuk expresszióját HDM2, ARF, p53 és p21 AGS és SGC7901 transzfektált sejtek miR-149 utánozza. Azt találtuk, hogy a méhen kívüli kifejezése miR-149 eredményez fokozott expressziója ARF, p53, p21 és csökkent expressziója HDM2 és ZBTB2. Ezek az eredmények alátámasztják azt az elképzelést, hogy a miR-149 fejti ki szerepét gátló GC sejtek szaporodását és a sejtciklus progressziójában megcélozva ZBTB2 katalógusa ezáltal módosítsák a kifejezés a downstream szabályozó sejtciklus progresszióját. Katalógusa

Összegezve , adataink azt mutatják, hogy a miR-149 működhet, mint egy tumorszuppresszor a gyomor rákos sejteket, és fontos szerepet játszik a gátlására ZBTB2 katalógusa. Ezért downregulációját miR-149 elősegíti a GC sejtproliferáció és a sejtciklus progressziójában. Továbbá, az eredmények azt mutatják, hogy ZBTB2 működhet egy onkogént a fejlesztés a gyomorrák. Tekintettel azonban arra a tényre, hogy egyes miRNS szabályozhatják számos megcélzott gének, amelyek hatással lehetnek a rákkeltő képességet különböző módokon, szükséges vizsgálatokat, hogy vizsgálja meg a többi miR-149 célokat, amelyek elsődleges szerep jut a GC tumorogenezisben. A jelen tanulmány továbbá olyan új betekintést a szerepét miR-149 a humán gyomorrák progresszió, és azt jelzi, hogy a miR-149 szolgálhat, mint terápiás célpont a gyomor-rák kezelésére.

Anyagok és módszerek

Etikai nyilatkozat katalógusa

A szövetminták, írásos beleegyezését adta a betegektől. Eljárások ebben a tanulmányban alkalmazott jóváhagyta az Institutional Review Board negyedik Katonai Orvostudományi Egyetem, és megfelelt a Helsinki Nyilatkozat, és a helyi előírásoknak megfelelően. Katalógusa

Sejtvonalak és tenyésztési körülmények katalógusa

A gyomor rák vonalak AGS, MKN28, MKN45 vásárolta AGCC és GC9811 és SGC7901 sejtvonalak nyert pekingi Onkológiai Intézet. Az összes sejtvonalat fenn intézet szerint ajánlott protokollokat. A sejteket RPMI-1640 tápközegben (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), kiegészítve 10% magzati borjúszérummal (FBS) (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) 37 ° C-on, 5% CO _{2 inkubátorban .}

az emberi egyedek

Minden vizsgálati eljárást jóváhagyta az Institutional Review Board negyedik Katonai Orvostudományi Egyetem. Írásos beleegyezését adta az összes beteg samples.Human gyomorrák minták (n = 44), és kiegyenlített szomszédos, nem daganatminták nyerték betegek Xijing Kórház Digestive Diseases, a negyedik Katonai Orvostudományi Egyetem, a beleegyező nyilatkozatot minden beteg.

RNS tisztítása, cDNS-szintézis, és a kvantitatív valós idejű PCR (qRT-PCR)

teljes RNS tenyésztett sejtek extraháljuk TRIzol reagenssel (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) szerint a gyártó protokollja és RNS-eket -80 ° C-on, mielőtt qRT-PCR elemzést. Érett miR-149 expressziós detektáltuk Mirvana TM QRT-PCR miRNS Detection Kit (Ambion Inc. Austin, Texas), a U6 belső kontrollként. ZBTB2 expressziót detektáltunk primerekkel F: 5'ACTCGGGCGAGATCCACGGC 3 ', R: 5' ACGCAGGCTGCTCATCGGAG 3 ', és a GAPDH-t használjuk belső kontrollként. A PCR-termékeket elkülönítettük egy etídium-bromiddal festett 1,5% -os agaróz gélen, és UV-vel.

Cell transzfekció

Az emberi miR-149 duplex utánozzák és inhibitor (MIR-149) és a negatív kontroll oligonukleotid duplex utánzó (miR-NC) arra tervezték, és a Ribobio (Guangzhou, Guangdong, Kína). A kis interferáló RNS (siRNS) az ZBTB2 és a negatív kontroll RNS (siRNS-NC) állítottunk elő és tisztítottuk Genepharma (Sanghaj, Kína). miRNS-ek, siRNS és ZBTB2 cDNS-plazmid (FulenGen Co. Kína) transzfektáltunk által LipofectamineTM 2000 reagenst (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) alkalmazásával a gyártó protokollja. A ZBTB2 siRNS szekvencia: F: 5 'GCUGGCUUCUUUCCAAGUU dTdT 3', R: 5 'AACUUGGAAAGAAGCCAGC 3'; Az NC siRNS szekvencia: F: 5'-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT -3 ', R: 5'-ACGUGACACGUUCGGAGAATT -3'. Katalógusa

miRNS target predikciós katalógusa

Ahhoz, hogy megtalálja a lehetséges miRNS célgének, TargetScanHuman honlapján ( http://www.targetscan.org/) használunk, a kötési energia szabad kiszámítottuk, és biding oldalak segítségével elemeztük http://bibiserv.techfak.uni-bielefeld.de/rnahybrid honlapján. katalógusa

vektor konstrukciók és a luciferáz riporter assay

a konstrukció ZBTB2-3'UTR plazmid, egy vad típusú 3'-UTR-fragmens a humán ZBTB2 mRNS (1238-1244 nt, GenBank hozzáférési szám. NM_020861.1), amely a feltételezett miR-7 kötő szekvenciát amplifikáltuk RT-PCR-rel és klónoztunk az oldalon között Xho I és Not I downstream a luciferáz riporter gént a psiCHECK ™ vektorba (Promega, USA). A mutáns az egységes miR-7 kötőhely (5'GAGCCAG-3 '5'ACCGCGC-3'), a 3'-UTR ZBTB2 szerepelt helyspecifikus mutagenezis készlet (SBS Genetech, Peking, Kína ). Vad és mutáns típusú pmirGLO-ZBTB2-UTR vektorok által hitelesített DNS-szekvenálás. Katalógusa

A nukleotid szekvenciákat primerek ZBTB2-3'UTR (MT) klón: mutZBTB2F: 5'GGCCTCACAAGACAAAACAGACCGCGCAAGTAAGGACTGAAGGAGAA 3 'mutZBTB2R: 5' TTCTCCTTCAGTCCTTACTTGCGCGGTCTGTTTTGTCTTGTGAGGCC 3 '

nukleotid szekvenciáit láncindítók ZBTB2-3'UTR (WT) klón: ZBTB2XhoIF: 5'CCGCTCGAG ATGTCACTTATCTTTTTAAAAAACTCTCA 3' ZBTB2NotIR: 5'ATAAGAATGCGGCCGC TACTCATTTAATTAAACGTTTATTC 3 'ZBTB2XhoIF2: 5'CCGCTCGAGATGTCACTTATCTTTTTAAAAAACTCTCATTTTTACAAAGACTATC 3' ZBTB2F3: 5'CCGCTCGAG CTGTAGTTCTCCATGGCATGATAC 3 '.

a sejteket transzfektáltuk a miR-149 utánozza, NC és pmirGLO plazmid 24-lyukú lemezeken Lipofectamine ™ 2000 (Invitrogen) utasításai szerint. 48 óra múlva a sejteket összegyűjtöttük és analizáltuk luciferázaktivitást a Dual-Luciferase Reporter Assay System (Promega, USA), és detektáltuk a GloMaxTM 20/20 érzékelő rendszer (E5331, Promega).

Western blotting

származó összes fehérje tenyésztett sejteket lizáltuk Lysis Buffer tartalmazó PMSF jégen. Ezután fehérje elektroforézisnek vetettünk 12% -os SDS poliakrilamid gélen és átvisszük PVDF membránra (Millipore). A membránokat blokkoltuk 5% zsírmentes tejpor szobahőmérsékleten 1 órán és éjszakán át inkubáltuk primer antitestekkel. A membránokat ezután a másodlagos antitestekkel jelzett HRP 1 óra után szobahőmérsékleten három 10 perc mosás TBS-T (triethanolaminebuffered sóoldat Tween). Végül a jelek alkalmazásával detektáltuk ECL kit (Pierce, Biotech., Rockford, IL, USA), és a membránokat beolvasott és elemeztük egy Bio-Rad ChemiDoc XRS + képalkotó rendszer képalkotó szoftver (verzió mennyiség 1). A fehérje expresszióját normalizáltuk egy endogén referencia (aktin) és a kontrollhoz viszonyítva. A Spectra többszínű széles spektrumú protein létra (Fermentas) használtunk molekuláris marker. Minden alkalmazott antitestek Western blot assay táblázat sorolja fel az S1.

Immunhisztokémia és immunhisztokémiai pontozási

paraffin metszeteket, 4-um vastagságú, sütöttek 2 órán át 65 ° C-on és paraffint . Antigén-visszanyerés alkalmazásával végeztük citrát nátrium-pufferrel (pH = 7,2) 95 ° C-on 15 percig, majd tárgylemezeket lehűtjük szobahőmérsékleten 30 percig. Miután kezeltük 3% -os hidrogén-peroxid 15 percig, hogy blokkolja az endogén peroxidáz, a metszeteket kezelt normál kecske szérummal határoló folyékony 30 percig, hogy csökkentsék a nem-specifikus kötődés, majd nyúl poliklonális anti-ZBTB2 (1:500, BIOS-ban át Co . Kína) inkubáljuk a szakaszok 12 órán át 4 ° C.After felmelegítés 1 órán és mosás 5-ször, metszeteket szekunder antitesttel 30 percig, szobahőmérsékleten. Diaminobenzidinnel (DAB) használtunk szín reakciókat. Későbbi immunhisztokémiai festést lőtt a leírtak szerint [46]. Katalógusa

MTT assay katalógusa

sejteket 100 nM miR-149 inhibitor (Genepharma, Shanghai, Kína), utánozza (Ribobio, Guangzhou, Guangdong, Kína) vagy 100 nM siRNS-ZBTB2 (Genepharma) .Twenty-négy később a sejteket szélesztettünk 96 mérőhelyes lemezeken (2 × 103 /lyuk). A sejtek életképességét úgy vizsgáltuk MTT-t (3-2, 5-difenil-tetrazólium-bromid) vizsgálattal (Sigma, USA) naponta 6 napon át.

Sejtciklus esszé áramlási citometriával

Gyomorrák sejtvonalak, AGS és SGC7901 RPMI-1640 tápközegben (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), kiegészítve 10% FBS-sel 6 lyukú lemezeken. Transzfekció végeztük, amikor a sejtek elérték a 80 %% - 90% -os összefolyásig. Ezt követően a sejteket összegyűjtöttük, kétszer mostuk PBS-sel, és a rögzített 70% -os etanolban 4 ° C hőmérsékleten egy éjszakán át. Ezután a sejteket inkubáltuk propidium-jodiddal szobahőmérsékleten 1 órán és elemeztük áramlási citometriával, egy FACScan áramlási citométer (BD Biosciences, Mountain View, CA). Ezeket az adatokat analizáltuk alkalmazásával Flowjo (Flowjo).

Statisztikai analízis

Az adatokat átlag ± SEM három független kísérlet során. A statisztikai tesztek, az SPSS statisztikai szoftvercsomag, version17.0 (SPSS, Chicago, IL, USA) használtunk. A Student-féle t-tesztet, a one-way ANOVA és kétutas ANOVA tesztet végeztünk MTT assay, kvantitatív PCR és a tumor növekedési görbe. A korreláció miR-149 és ZBTB2 elemeztük Spearman rank korreláció. P értékek < 0,05 statisztikailag szignifikánsnak tekintettük. Katalógusa

alátámasztó információk katalógusa ábra S1.
A vad típusú és mutáns ZBTB2
-3'UTR tartalmazó feltételezett kötőhely miR-149 klónoztuk psiCHECK-2 vektor. A. ZBTB2
-3'UTR amplifikáltunk genomi DNS-AGS. B. Lane 1,3, 5: rekombináns plazmidot ZBTB2-1, ZBTB2-2, ZBTB2-3 katalógusa volt; sáv 2,4,6: eredményei enzimmel rekombináns plazmidok a ZBTB2-1, ZBTB2-2, ZBTB2-3 katalógusa volt. Az eredmények azt mutatták, hogy a ZBTB2 katalógusa -1/2/3 sikeresen behelyezett vektorok. (M1: DL2000 DNS Marker, M2: DL1 kb DNS-marker; ZTBT2-1 /2/3 sáv: 1406 bp; Vektor sávok: 6,1 Kb). C. M1: 1 kb-os DNS létra Marker. 1. sáv: erősítés a mut ZBTB2 katalógusa F1 /R1 (negatív kontroll nélkül Taq enzim); 2. sáv: erősítés a mut ZBTB2 katalógusa F1 /R1. Egy sáv mut ZBTB2 katalógusa (7,6 Kb) igazolták a sikeres PCR mutáns erősítés. D. szekvenálása eredményei WT- ZBTB2 katalógusa és MT - ZBTB2 katalógusa.
Doi: 10,1371 /journal.pone.0041693.s001 katalógusa (TIF) hotelben ábra S2 .
ZBTB2 expresszió humán gyomorrák példányok és kiegyenlített szomszédos normál szövetben. A. Reprezentatív képek látható pozitív immunhisztokémiai festése ZBTB2 humán gyomorrák példányok (B-C), és illeszkedik a szomszédos normális szövetekben (a) (nagyítás 200 ×). B. Az immunhisztokémiai pontoztuk a korábban leírt [46]; statisztikai adatok elemzése a ZBTB2 kifejezés különbség az emberi gyomorrák példányok és kiegyenlített szomszédos, nem rákos szövetekben (One-Way ANOVA, F = 117,280, *** p katalógusa < 0,001). katalógusa doi: 10,1371 /journal.pone.0041693.s002 katalógusa (TIF) hotelben ábra S3.
Méhen ZBTB2 katalógusa mRNS expresszióját fokozza ZBTB2 fehérje expresszió GC sejtvonalak.

• PLoS One: CYP2E1 Rsa /PstI-polimorfizmus és a gyomorrák Érzékenység: metaanalízise alapján 24 Case-Control Studies
• PLoS One: genetikai hajlam tényezők a gének a Szteroid hormon bioszintézis és progeszteron receptor gyomorrák Risk