PLoS ONE: MicroRNA-149 inibisce la proliferazione e la progressione del ciclo cellulare attraverso la destinazione dei ZBTB2 in Human gastrico Cancer

Estratto

Un numero crescente di evidenze indica che miR-149 può sia sopprimere e promuovere la crescita del tumore a seconda il tipo di tumore. Tuttavia, il ruolo di miR-149 nella progressione del cancro gastrico (GC) rimane sconosciuta. Qui si segnala che miR-149 è un soppressore del tumore nel cancro gastrico umano. espressione di miR-149 è diminuito in linee cellulari GC e campioni clinici rispetto al normale delle cellule epiteliali gastriche e tessuti, rispettivamente. I livelli di espressione di miR-149 correlano anche con il grado differenziazione delle cellule GC e tessuti. Inoltre, l'espressione ectopica di miR-149 in cellule di cancro gastrico inibisce la progressione del ciclo cellulare e la proliferazione da down-regolazione ZBTB2
, un potente repressore della via ARF-HDM2-p53-p21, con un potenziale sito di legame per miR-149 nel 3'UTR del suo mRNA. Si trova anche che l'espressione ZBTB2 aumenti di cellule e tessuti GC rispetto al normale delle cellule epiteliali gastriche e tessuti, rispettivamente. Silenziamento di ZBTB2
porta alla soppressione della crescita cellulare e arresto del ciclo cellulare in fase G0 /G1, indicando che ZBTB2 può agire come un oncogene in GC. Inoltre, trasfezione di miR-149 imita in cellule di cancro gastrico induce down-regulation di ZBTB2 e HDM2, e up-regolazione di ARF, p53, p21 e rispetto ai controlli. In sintesi, i nostri dati suggeriscono che miR-149 funziona come un soppressore del tumore nel cancro gastrico umano, almeno in parte attraverso, il targeting ZBTB2

Visto:. Wang Y, X Zheng, Zhang Z, Zhou J, Zhao G, Yang J, et al. (2012) microRNA-149 inibisce la proliferazione e la progressione del ciclo cellulare attraverso la destinazione di ZBTB2
in Human cancro gastrico. PLoS ONE 7 (10): e41693. doi: 10.1371 /journal.pone.0041693

Editor: Wael El-Rifai, Vanderbilt University Medical Center, Stati Uniti d'America

Ricevuto: 13 Marzo 2012; Accettato: 25 giugno 2012; Pubblicato: 29 ottobre 2012

Copyright: © 2012 Wang et al. Questo è un articolo ad accesso libero distribuito sotto i termini della Creative Commons Attribution License, che permette l'uso senza restrizioni, la distribuzione e la riproduzione con qualsiasi mezzo, a condizione che l'autore originale e la fonte sono accreditati

Finanziamento:. Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni dal National Science Foundation naturale della Cina (n. 30.872.966 e n. 31.071.135), National Science Foundation naturale della Cina (n. 81.000.864, n. 81.172.290, n. 91.129.723, n. 81.090.270 e n. 81.090.273) , e la cinese Postdoctoral Science Foundation (n. 20.100.471,776 mila). I finanziatori avevano alcun ruolo nel disegno dello studio, la raccolta e l'analisi dei dati, la decisione di pubblicare, o preparazione del manoscritto

Competere interessi:.. Gli autori hanno dichiarato che non esistono interessi in competizione

Introduzione

cancro gastrico (GC) è uno dei tumori più comuni e le principali cause di morte per cancro in tutto il mondo, soprattutto in Asia orientale, secondo l'ultimo stima globale pubblicato nel 2011 [1]. Nonostante una notevole diminuzione del GC incidenza nella maggior parte del mondo, c'è ancora un grande peso dal gran numero di casi GC e morti in tutto il mondo. La carcinogenesi di GC è un processo molto complicato [2] - [5] che coinvolge il disregolazione di geni multipli [6] - [8], tra cui oncogeni [9] - [14] e del tumore soppressori [15] - [18]. Tuttavia, i meccanismi molecolari necessari per lo sviluppo e la progressione GC hanno bisogno di essere ulteriormente esplorata.

I microRNA (miRNA) sono un gruppo di endogeno espresso, non codificante piccoli RNA (20-25 nucleotidi di lunghezza) noti per negativamente regolare l'espressione genica sopprimendo traduzione o diminuendo la stabilità di mRNA da direttamente vincolanti per la regione 3'-non tradotta (3'-UTR) del mRNA bersaglio [19], [20]. Accumulando prove indicano che i miRNA svolgono un ruolo importante nello sviluppo, il metabolismo, la proliferazione, la differenziazione e l'apoptosi. Inoltre, aberranti regolazione post-trascrizionale di mRNA da miRNA è legato alla tumorigenesi [21]. profili di espressione anormali di miRNA sono stati rilevati in vari tipi di tumori umani, tra cui polmone [22], della mammella [23], della prostata [24], il fegato [25], del colon [26], e cancro gastrico [27]. Inoltre, alcune miRNA possono funzionare come oncogeni o soppressori tumorali regolando l'espressione di geni bersaglio che giocano un ruolo importante nella progressione del ciclo cellulare, apoptosi, o la proliferazione. miR-22 [28], miR-101 [29], e miR-7 [30] sono stati tutti dimostrato di essere downregulated nei campioni tumorali e funzionano come soppressori tumorali; miR-17 [31] e miR-21 [32] hanno dimostrato di essere upregulated in campioni tumorali e la funzione come oncogeni. Questi studi indicano che la disregolazione dei miRNA è spesso coinvolto nella carcinogenesi e nella progressione del cancro.

Studi recenti hanno suggerito che miR-149 può svolgere un ruolo importante in varie malattie, tra cui la progressione dei tumori maligni. miR-149 ha dimostrato di funzionare sia come soppressore tumorale [33] e un oncogene [34] nello sviluppo di diversi tipi di tumori solidi. Ad esempio, la perdita di miR-149 porta al guadagno di funzione di alcuni oncogeni e correlare con il grado tumorale nel carcinoma renale [35], astrocitoma [36], e carcinoma prostatico [37]. espressione ectopica di miR-149 induce apoptosi del neuroblastoma e cellule HeLa [33]. espressione elevata di miR-149 è stato segnalato per essere importante nella progressione del carcinoma nasofaringeo [38] e la metastasi del melanoma [34]. Inoltre, disregolazione del miR-149 è anche coinvolto in alcune malattie non neoplastiche. Ad esempio, down-regulation di espressione miR-149 è coinvolta nello sviluppo di mielofibrosi primaria, policitemia vera e trombocitemia essenziale [39], e la perdita di miR-149 può sopprimere il virus dell'epatite C (HCV) RNA abbondanza [40]. Tuttavia, il pattern di espressione e il ruolo di miR-149 per lo sviluppo di GC rimane poco chiaro.

Nel presente studio, abbiamo scoperto che miR-149 è significativamente downregulated in linee cellulari GC e campioni clinici rispetto al normale delle cellule gastriche epiteliali e tessuti non tumorali adiacenti, rispettivamente. espressione ectopica di miR-149 inibisce la proliferazione e induce arresto G0 /G1 di AGS e SGC7901 cellule in vitro
di mira ZBTB2
. Inoltre, l'esaurimento delle ZBTB2
da siRNA risultati in inibizione della proliferazione e arresto del ciclo cellulare. Il pattern di espressione di miR-149 e ZBTB2 in linee cellulari GC e campioni clinici sono stati inversamente correlata, inoltre suggerendo che ZBTB2
è un gene bersaglio di miR-149. Introduzione del miR-149 risultati in alterazioni nell'espressione di p53, p21, ARF, e HDM2, i membri del pathway ARF-HDM2-p53-p21, che è regolata da ZBTB2. In sintesi, questi risultati confermano che miR-149 è downregulated nelle cellule GC e campioni clinici e suggeriscono che miR-149 funziona come un soppressore della crescita delle cellule del cancro gastrico inibendo la progressione proliferazione e del ciclo cellulare.

Risultati

l'espressione di miR-149 è downregulated in linee cellulari GC e campioni clinici

per valutare il ruolo di miR-149 nella carcinogenesi del GC, in primo luogo abbiamo usato RT-PCR quantitativa per misurare l'espressione di miR-149 in linee cellulari GC umane (MKN45, GC9811, AGS, SGC7901, e MKN28) e ha scoperto che miR-149 è stato downregulated in linee cellulari GC rispetto ad un normale gastrica epiteliale linea cellulare, GES-1 (Fig. 1A). In particolare, il livello di espressione di miR-149 è stata positivamente correlata con il grado differenziazione delle cellule GC. Vale a dire, il livello di espressione di miR-149 linee di cellule in poco differenziati, come MKN45, GC9811, e AGS, è significativamente inferiore a quella moderatamente e linee cellulari ben differenziati. L'espressione del miR-149 in cellule moderatamente differenziato, SGC7901, è inferiore a quella nella linea di cellule ben differenziati, MKN28 (Fig. 1A).

Al fine di determinare se i livelli di miR-149 sono correlati anche con il grado di differenziazione dei tumori abbiamo esaminato l'espressione di miR-149 in 44 campioni clinici GC umani, tra cui 13 mal, 16 moderatamente, e 15 campioni ben differenziati. Abbiamo scoperto che l'espressione di miR-149 nei tumori gastrici è notevolmente inferiore a quello abbinate normali tessuti adiacenti (Fig. 1B). Inoltre, l'espressione di miR-149 nei tumori più differenziati è stato superiore nei tumori meno differenziati (Fig 1C, F = 65,391, p
. ≪ 0,001). Inoltre, diminuita espressione di miR-149 è correlata con metastasi linfonodali (* p
= 0,046) e lo stadio TNM (** p = 0,0011
) (Tabella 1).

l'espressione ectopica di miR-149 inibisce la proliferazione e induce arresto G0 /G1 in AGS e SGC7901 cellule

linee di cellule GC Per studiare il ruolo di miR-149 in cellule di GC, abbiamo utilizzato male e moderatamente differenziato, AGS e SGC7901, rispettivamente. AGS e SGC7901 cellule sono state trasfettate con eithermature miR-149 imita, inibitore, finto transfettate, o miR-NC. Come mostrato in figura 2A, 2D, i risultati RT-PCR quantitativa mostrano che l'espressione di miR-149 imita o inibitori significativamente upregulate o downregulate l'espressione di miR-149, rispettivamente, in AGS e SGC7901 cellule dal primo al quinto posttransfection giorno (Fig . 2A, F = 8,429, p
= 0,003;. Fig. 2D, F = 8,595, p
= 0.003) rispetto ai controlli NC e finte

AGS e cellule SGC7901 trasfettate con miR-149 imita e inibitori hanno mostrato significativamente più bassi e più alti livelli di proliferazione cellulare, rispettivamente, rispetto al NC o gruppi di finte come determinato mediante test MTT (Fig 2B, F = 27.47, p. < 0,001; Fig. 2E, F = 44,061, p < 0,001). Transfection di AGS e SGC7901 cellule con miR-149 imita risultati in significativo arresto fase G1 in confronto a NC e controlli finte ( p
< 0,05). Inoltre, il trattamento con miR-149 inibitori ha portato a un minor numero di AGS e SGC7901 cellule in arresto G1 rispetto al NC e controlli finti ( p
< 0,05). (Fig 2C, F = 134,177, p
< 0,001;. Fig. 2F, F = 58,792, p
= 0,003)

ZBTB2
è un bersaglio di miR-149

i dati precedenti suggeriscono che miR-149 potrebbe essere un soppressore della crescita delle cellule GC di mira i geni che controllano la proliferazione e la progressione del ciclo cellulare (33-34) (38). Così, abbiamo cercato per ulteriori obiettivi potenziali di miR-149 dal database di TargetScanHuman. Abbiamo identificato numerosi potenziali geni target miR-149, tra cui ZBTB2
, un fattore di trascrizione e POK famiglia potente repressore della via ARF-HDM2-p53-p21 (41). ZBTB2
è stato trovato per avere putativo miR-149 siti di legame nel suo 3'UTR (Fig. 3A). saggi di luciferasi sono stati eseguiti per verificare se ZBTB2
è un bersaglio diretto di miR-149 utilizzando AGS e SGC7901 cellule. Abbiamo co-trasfettato AGS e SGC7901 cellule, rispettivamente, con un vettore psiCHECK-2 contenente sia 3'UTR per ZBTB2 o mutato 3'UTR per ZBTB2, e mima di miR-149 o inibitori di miR-149. Wild-type e mutante ZBTB2-3'UTR che contiene il sito di legame putativo di miR-149 sono stati clonati in psiCHECK-2 vettore a valle gene della luciferasi (Fig. S1). Introduzione del miR-149 ha ridotto significativamente l'attività della luciferasi dal giornalista vettore ZBTB2 3'UTR (Fig 3B-3C, p
. ≪ 0,001), ma non ha influenzato l'attività della luciferasi dal ZBTB2-3 mutante 'giornalista vettore UTR. Questi dati suggeriscono che miR-149 regola direttamente ZBTB2
livelli di espressione. Inoltre, non vi è alcuna significativa diminuzione dell'attività della luciferasi relativa in cellule co-trasfettate con miR-149 inibitore o 3'UTR-ZBTB2 /psiCHECK-2 vettore (Fig. 3B-3C). E 'forse a causa della mancanza di interazione tra 3'UTR di ZBTB2 e endogeni miR-149, quindi, è diminuita miR-149 espressione non ha aumentato l'attività della luciferasi dal vettore giornalista ZBTB2-3'UTR. Questi risultati inoltre confermano che miR-149 sopprime l'espressione ZBTB2 di mira il 3'-UTR di ZBTB2
mRNA.

miR-149 e di espressione ZBTB2 è correlato negativamente nelle cellule GC e campioni clinici

Per studiare ulteriormente il rapporto tra miR-149 e ZBTB2, abbiamo esaminato l'espressione di ZBTB2 nelle cellule GC utilizzando western blotting e nei tessuti GC con immunoistochimica. E 'stato trovato che le cellule di GC hanno significativamente più alto livello di espressione del ZBTB2 rispetto al normale delle cellule epiteliali gastriche, GES-1 (Fig 4A a-b F = 167,843, p
. ≪ 0,001). espressione ZBTB2 negativamente correlata con il grado di differenziazione delle cellule GC; mal tessuti differenziati GC hanno mostrato un significativo livello di espressione ZBTB2 superiore tessuti GC ben differenziati e abbinati normali tessuti gastrici (Fig S2A-B, F = 117,280, p
. < 0,001). ZBTB2
livelli di espressione di mRNA sono coincidenti con i livelli di proteine ​​(Fig 4B A, F = 283,355, p
. ≪ 0,001). Inoltre, l'espressione di miR-149 e ZBTB2 è inversamente correlato (Fig. 4B b, p = 0.033
, R = -0,908). Abbiamo poi misurato i livelli di espressione di miR-149 e ZBTB2
con RT-PCR quantitativa in 5 linee di cellule GC (MKN45, GC9811, AGS, SGC7901, e MKN28) (Fig. 4C a) e 18 GC clinica campioni (6 male, 6 moderatamente, e 6 campioni ben differenziati) (Fig. 4C b). I risultati confermano che il livello di mRNA di ZBTB2
correla negativamente con miR-149 espressione (Fig 4C una, p = 0.033
, R = -0,847;. Fig. 4C b, p
< 0,001, R = -0,908). Inoltre, AGS (Fig. 4D) e SGC7901 cellule (Fig. 4E) trasfettate con miR-149 imita hanno significativamente diminuita espressione di ZBTB2 ai livelli di proteine ​​(pannelli A-B) e livelli di mRNA (pannello C) rispetto al finto o NC cellule ( p
< 0,001). I nostri risultati indicano che miR-149 può disciplinare direttamente l'espressione di ZBTB2
.

miR-149 sopprime la progressione proliferazione cellulare e del ciclo cellulare GC di mira ZBTB2

Il prossimo confermato che miR-149-mediato l'inibizione della proliferazione e induzione di arresto del ciclo cellulare nelle cellule GC richiede il targeting di ZBTB2
. ZBTB2
espressione era abbattuto utilizzando siRNA in AGS e SGC7901 cellule. Western blotting (Fig. 5A, A-C) e l'analisi PCR quantitativa hanno dimostrato che la deplezione di ZBTB2
da siRNA transfection ha potuto essere compensata in modo significativo da miR-149 inibitore e un marcato aumento di ZBTB2 è stato visto in cellule trasfettate con miR-149 inibitori (Fig 5B, p
. < 0,001). saggio MTT dimostra che la proliferazione di cellule trasfettate con siRNA-ZBTB2 fu soppresso e la proliferazione delle cellule trasfettate con miR-149 inibitori aumentato in modo significativo rispetto alle cellule trasfettate con siRNA-NC (controllo) e siRNA-ZBTB2 + miR-149 (Fig. 5C ). Inoltre, l'inibizione di ZBTB2
espressione promuove G0 /G1 arresto e sopprime la G0 /G1 arresto del ciclo cellulare indotta da miR-149 trattamento inibitore di AGS e SGC7901 cellule rispetto alle cellule di controllo numerico (Fig. 5D-5E, p
< 0,001). I nostri risultati suggeriscono che miR-149 inibisce la proliferazione delle cellule GC e la progressione del ciclo cellulare, inibendo ZBTB2
espressione.

Introduzione di miR-149 alterato l'espressione di ZBTB2 e proteine ​​del ciclo cellulare correlati

ZBTB2 è stato segnalato per essere un repressore potenti della via ARF-HDM2-p53-p21, che è importante nella regolazione del ciclo cellulare (41). Per studiare la regolazione di queste proteine ​​da miR-149 in cellule di GC, abbiamo trasfettato cellule AGS e SGC7901 con miR-149 imita o miR-NC e svolta RT-PCR e western blotting per ZBTB2 geni bersaglio. Come mostrato nella Figura 6A-6B, l'espressione ectopica di miR-149 downregulates l'espressione di ZBTB e HDM2, e fa aumentare l'espressione di ARF, p53 e p21 ( p
< 0,001). Questi dati sono coerenti con la funzione di ZBTB2 nel reprimere la trascrizione di ARF, p53 e p21 e attivando l'espressione di HDM2 (41). Inoltre, l'espressione ectopica di ZBTB2 per trasfezione invertito riduzione miR-149-mediata espressione HDM2 e aumento ARF, p53 e p21 espressione in AGS e SGC7901 cellule (Fig. 6A-B). . Espressione ZBTB2 ectopica è stata confermata in AGS transfettate e SGC7901 cellule (Fig S3, SGC7901 cellule, F = 806,365, p
< 0,001; cellule AGS, F = 1436,300, p
< 0,001). ARF, p53 e p21 promuovere la progressione del ciclo cellulare, pertanto, la loro regolazione negativa per l'espressione di miR-149 imita spiega la fase di arresto G0 /G1 in AGS e SGC7901 cellule.

Discussione

Una crescente evidenza suggerisce che miRNA svolgono un ruolo critico nella cancerogenesi e progressione del cancro [21]. Altered livelli di espressione di miRNA sono stati implicati in avvio e lo sviluppo di tumori; la modulazione dei miRNA che funzionano come regolatori negativi di oncogeni o tumore soppressori risultati nella promozione della proliferazione delle cellule tumorali e la crescita [28] - [32]. Studi precedenti hanno dimostrato che il ruolo di miR-149 nella progressione di vari tipi di tumori è controversa [33] - [36], [38]. Il modello e gli obiettivi di miR-149 espressione variano in diversi tipi di tumori. espressione di miR-149 è downregulated in alcuni tumori, funziona come un soppressore del tumore di mira oncogeni in alcuni tipi di cancro. Ad esempio, nel carcinoma renale a cellule chiare miR-149 è downregulated e le sue probabili obiettivi sono stati identificati come KCNMA1 e LOX (35). Inoltre, miR-149 è anche downregulated in cellule di glioblastoma ed è stato proposto di agire come soppressore del tumore di mira RAP1B, CD47, CCN1, e NXF1 [36]. Al contrario, miR-149 può anche funzionare come un soppressore del tumore di mira alcuni oncogeni. Rilevamento dei profili di espressione dei miRNA in diverse fasi cliniche di carcinoma nasofaringeo (NPC) e NPC metastasi linfonodali dimostra che l'espressione di miR-149 è upregulated in NPC e l'espressione del suo gene bersaglio, Smad2
, è diminuita con la progressione di NPC [38]. Un ruolo oncogenico simile per miR-149 è stato visto anche nel melanoma in cui upregulation di miR-149 fa sì che sottoregolazione di GSK3-α e aumenta i Mcl-1, con conseguente resistenza apoptotico [34]. Finora, poco si sa circa il ruolo di miR-149 nel cancro gastrico. Qui, si segnala che l'espressione miR-149 è notevolmente ridotta in più linee di cellule di cancro gastrico e campioni clinici rispetto alle normali cellule epiteliali gastriche e tessuti normali adiacenti abbinati rispettivamente. È importante sottolineare che il livello di espressione miR-149 è associato con il grado differenziazione delle cellule di GC e campioni; mal cellule differenziate GC o campioni hanno una minore espressione di miR-149 rispetto ai campioni ben differenziati. espressione ectopica di miR-149 inibisce la proliferazione delle cellule e la progressione del ciclo cellulare di mira ZBTB2
in AGS e SGC7901 cellule. miR-149 e l'espressione ZBTB2 sono correlate negativamente nelle cellule GC e campioni clinici, e sovraespressione di miR-149 provoca sottoregolazione di ZBTB2
. L'esaurimento delle ZBTB2 risultati in inibizione della AGS e SGC7901 proliferazione delle cellule e la progressione del ciclo cellulare. Collettivamente, questi risultati dimostrano, per la prima volta, che ZBTB2 può funzionare come un oncogene nella tumorigenesi del cancro gastrico.

I nostri dati mostrano che l'introduzione di miR-149 in cellule GC induce arresto del ciclo cellulare, suggerendo che bersagli miR-149 possono essere implicati nella regolazione del ciclo cellulare. ZBTB2 è un fattore di trascrizione famiglia POK che può sopprimere la via ARF-HDM2-p53-p21 [41]. ARF, un soppressore tumorale [42], può essere indotta dalla stimolazione mitogenica sostenuta e svolge un ruolo chiave nell'attivazione p53 indipendente e controllare la stabilità di p53 attraverso l'interazione con HDM2 [43], un importante regolatore di p53. Il soppressore di tumore p53 gioca un ruolo fondamentale nel mantenimento dell'omeostasi cellulare attraverso indurre l'arresto del ciclo cellulare e l'apoptosi quando le cellule sono sottoposte a stress, come ipossia, danni al DNA, e la disfunzione del telomero [44]. p21, un gene bersaglio p53, media del ciclo cellulare fase G1 arresto attraverso il legame e inibendo l'attività di ciclina-CDK2 o complessi CDK1 [45]. ZBTB2 può reprimere la trascrizione di ARF, p53, p21 e, e indurre l'espressione HDM2 [41]. Per convalidare se gli effetti del ciclo cellulare indotti da espressione di miR-149 è mediato da ZBTB2 perdita, abbiamo esaminato l'espressione di HDM2, ARF, p53 e p21 di AGS e SGC7901 cellule trasfettate con miR-149 imita. Abbiamo scoperto che l'espressione ectopica di miR-149 si traduce in una maggiore espressione di ARF, p53, p21 e e diminuita espressione di HDM2 e ZBTB2. Questi risultati supportano l'idea che miR-149 esercita il suo ruolo di inibire le cellule GC proliferazione e progressione del ciclo cellulare di mira ZBTB2
modulando in tal modo l'espressione di regolatori a valle della progressione del ciclo cellulare
.

In sintesi , i nostri dati indicano che miR-149 può funzionare come un soppressore del tumore nelle cellule di cancro gastrico e svolge un ruolo importante nella inibizione ZBTB2
. Pertanto, down-regulation di miR-149 promuove la proliferazione cellulare GC e la progressione del ciclo cellulare. Inoltre, i nostri risultati dimostrano che ZBTB2 può funzionare come un oncogene nello sviluppo del cancro gastrico. Tuttavia, dato il fatto che ogni miRNA può regolamentare molti geni bersaglio che possono influenzare la carcinogenesi in modi diversi, sono necessari ulteriori studi per indagare altri miR-149 obiettivi che possono avere un ruolo critico in GC tumorigenesi. Il presente studio fornisce anche romanzo spaccato il ruolo di miR-149 nella progressione del cancro gastrico umano e indica che miR-149 può servire come un obiettivo terapeutico per il trattamento del cancro gastrico.

Materiali e Metodi

Etica Dichiarazione

Per i campioni di tessuto, il consenso informato scritto è stato ottenuto da pazienti. Le procedure utilizzate in questo studio sono stati approvati dal Institutional Review Board della Quarta Università Medica Militare ed è stato conformi alla Dichiarazione di Helsinki e alla legislazione locale.

linee cellulari e condizioni di coltura

gastrico linee di cancro AGS, MKN28, MKN45 sono stati acquistati dalla AGCC e, linee cellulari GC9811 e SGC7901 sono stati ottenuti da Pechino, Istituto di Oncologia. Tutte le linee cellulari sono state mantenute in nostro istituto secondo i protocolli consigliati. Le cellule sono state coltivate in RPMI-1640 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) supplementato con siero 10% fetale bovino (FBS) (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) a 37 ° C in un CO 5% _{2 incubatore .}

campioni umani

Tutte le procedure sperimentali sono state approvate dal Institutional Review Board della Quarta Università medica militare. consenso informato scritto è stato ottenuto per tutti i samples.Human campioni di cancro gastrico dei pazienti (n = 44) ed esemplari non tumorali adiacenti abbinati sono stati ottenuti da pazienti a Xijing Hospital di Malattie Digestive, il Quarto militare Medical University, con il consenso informato da ciascun paziente.

purificazione di RNA, la sintesi del DNA, e quantitativa real-time PCR (qRT-PCR)

L'RNA totale di cellule in coltura è stato estratto con il reagente TRIzol (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) secondo protocollo e RNA del produttore sono stati conservati a -80 ° C prima dell'analisi qRT-PCR. espressione matura miR-149 è stato rilevato utilizzando un TM qRT-PCR miRNA Detection Kit Mirvana (Ambion Inc. Austin, Texas), con U6 come controllo interno. espressione ZBTB2 è stato rilevato con primer F: 5'ACTCGGGCGAGATCCACGGC 3 ', R: 5' ACGCAGGCTGCTCATCGGAG 3 ', e GAPDH è stato utilizzato come controllo interno. I prodotti di PCR sono stati separati su un gel di agarosio 1,5% bromuro-macchiato etidio e visualizzati con UV.

Cell trasfezione

L'uomo miR-149 duplex imitano e inibitore (miR-149) e negativo il controllo oligonucleotide duplex mimica (miR-NC) sono stati progettati e fornito da Ribobio (Guangzhou, Guangdong, Cina). La piccoli RNA interferenti (siRNA) per ZBTB2 e l'RNA controllo negativo (siRNA-NC) sono stati sintetizzati e purificati da Genepharma (Shanghai, Cina). miRNA, siRNA e ZBTB2 cDNA plasmide (FulenGen Co. Cina) sono state trasfettate con LipofectamineTM 2000 reagente (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) secondo il protocollo del produttore. Il ZBTB2 siRNA sequenza: F: 5 'GCUGGCUUCUUUCCAAGUU dTdT 3', R: 5 'AACUUGGAAAGAAGCCAGC 3'; La sequenza NC siRNA: F: 5'-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT -3 ', R: 5'-ACGUGACACGUUCGGAGAATT -3'

miRNA bersaglio previsione

Per trovare potenziali geni bersaglio miRNA, sito TargetScanHuman (. http://www.targetscan.org/) è stato utilizzato, l'energia libera di legame è stato calcolato e siti biding sono stati analizzati utilizzando il sito http://bibiserv.techfak.uni-bielefeld.de/rnahybrid.

Vector costrutti e luciferasi giornalista test

Per costruire plasmide ZBTB2-3'UTR, una wild-type 3'-UTR frammento di umana ZBTB2 mRNA (1238-1244 nt, GenBank adesione n. NM_020861.1) contenente il putativo miR-7 sequenza di legame è stato amplificato mediante RT-PCR e clonato nel sito tra il Xho I e non sono a valle del gene reporter della luciferasi del vettore psiCHECK ™ (Promega, USA). Un mutante del singolo miR-7 sito di legame (5'-GAGCCAG-3 'a 5'ACCGCGC-3') nel 3'-UTR di ZBTB2 è stato incluso da mutagenesi sito-diretta kit (SBS Genetech, Pechino, Cina ). Selvaggio e tipi mutanti di vettori pmirGLO-ZBTB2-UTR sono stati convalidati dal sequenziamento del DNA

Le sequenze nucleotidiche di primer per ZBTB2-3'UTR (MT) clone: ​​mutZBTB2F: 5'GGCCTCACAAGACAAAACAGACCGCGCAAGTAAGGACTGAAGGAGAA 3 'mutZBTB2R: 5'. TTCTCCTTCAGTCCTTACTTGCGCGGTCTGTTTTGTCTTGTGAGGCC 3 '

Le sequenze nucleotidiche di primer per ZBTB2-3'UTR (WT) clone: ​​ZBTB2XhoIF: 5'CCGCTCGAG ATGTCACTTATCTTTTTAAAAAACTCTCA 3' ZBTB2NotIR: 5'ATAAGAATGCGGCCGC TACTCATTTAATTAAACGTTTATTC 3 'ZBTB2XhoIF2: 5'CCGCTCGAGATGTCACTTATCTTTTTAAAAAACTCTCATTTTTACAAAGACTATC 3' ZBTB2F3: 5'CCGCTCGAG CTGTAGTTCTCCATGGCATGATAC 3 '.

le cellule sono state trasfettate con i miR-149 imita, NC e pmirGLO plasmidi a 24 pozzetti utilizzando Lipofectamine ™ 2000 (Invitrogen) secondo le istruzioni. 48 ore più tardi, le cellule sono state raccolte e analizzate per l'attività della luciferasi utilizzando il Dual-reporter luciferasi sistema di analisi (Promega, USA) e rilevati dal sistema di rilevazione GloMaxTM 20/20 (E5331, Promega).

Western blotting

proteina totale da cellule in coltura sono state lisate con tampone di lisi contenente PMSF sul ghiaccio. Poi proteine ​​erano elettroforesi a 12% gel di SDS poliacrilammide e sono stati poi trasferiti su una membrana PVDF (Millipore). Le membrane sono state bloccate con 5% non grasso di latte in polvere a temperatura ambiente per 1 h ed incubate overnight con anticorpi primari. Le membrane sono state incubate con anticorpi secondari marcati con HRP per 1 ora a temperatura ambiente dopo tre 10 min lavaggi in TBS-T (soluzione salina triethanolaminebuffered con Tween). Infine, i segnali sono stati rilevati utilizzando il kit ECL (Pierce Biotech., Rockford, IL, USA) e le membrane sono stati digitalizzati e analizzati utilizzando un sistema di imaging + Bio-Rad ChemiDoc XRS con software di imaging (quantità versione 1). L'espressione della proteina è stata normalizzata ad un riferimento endogena (actina) e rispetto al controllo. Il multicolore scala proteina vasta gamma Spectra (Fermentas) è stato utilizzato come marcatore molecolare. Tutti gli anticorpi utilizzati nel test Western Blot sono elencati nella tabella S1.

immunoistochimica e immunoistochimica punteggio

Sezioni in paraffina, 4 micron di spessore, sono stati cotti per 2 ore a 65 ° C e deparaffinate . Antigen recupero è stata effettuata utilizzando tampone sodio citrato (pH 7,2) a 95 ° C per 15 minuti e poi vetrini sono stati raffreddati a temperatura ambiente per 30 minuti. Dopo il trattamento con perossido di idrogeno al 3% per 15 minuti per bloccare la perossidasi endogena, le sezioni sono state trattate con siero normale di capra limitandosi liquido per 30 minuti per ridurre il legame non specifico e quindi policlonale di coniglio anti-ZBTB2 (1:500, BIOSs Co . Cina) è stato incubato sezioni per 12 ore a 4 ° C.After rewarming per 1 h e lavaggio per 5 volte, le sezioni sono state incubate con anticorpo secondario per 30 minuti a temperatura ambiente. Diaminobenzidina (DAB) è stato utilizzato per le reazioni di colore. La successiva colorazione immunoistochimica è stato segnato come descritto in precedenza [46].

saggio MTT

Le cellule sono state trasfettate con 100 nM miR-149 inibitore (Genepharma, Shanghai, Cina), imita (Ribobio, Guangzhou, Guangdong, Cina) o 100 nM siRNA-ZBTB2 (Genepharma) .Twenty-quattro in seguito, le cellule sono state seminate in piastre da 96 pozzetti (2 × 103 /pozzetto). La vitalità delle cellule è stato esaminato da MTT (3-2, 5-difenil tetrazolio bromuro) test (Sigma, USA) al giorno per 6 giorni.

analisi del ciclo cellulare mediante citometria di flusso

cancro gastrico linee cellulari, AGS e SGC7901 sono state coltivate in RPMI-1640 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) supplementato con 10% FBS in 6 pozzetti. Transfection sono stati eseguiti quando le cellule hanno raggiunto 80 %% - il 90% di confluenza. Successivamente, le cellule sono state raccolte, lavate due volte con PBS e fissate in etanolo al 70% a 4 ° C durante la notte. Quindi le cellule sono state incubate con ioduro di propidio a temperatura ambiente per 1 ora e sono stati analizzati mediante citometria a flusso utilizzando un flusso FACScan citofluorimetro (BD Biosciences, Mountain View, CA). Questi dati sono stati analizzati utilizzando FlowJo (FlowJo).

Analisi statistica

I dati sono stati espressi come media ± SEM di tre esperimenti indipendenti. Per i test statistici, SPSS pacchetto software statistico, version17.0 (SPSS, Chicago, IL, USA) è stato utilizzato. t-test di Student, l'ANOVA e due vie test di ANOVA a senso unico sono stati eseguiti per saggi MTT, quantitativa curva di PCR e la crescita del tumore. La correlazione tra miR-149 e ZBTB2 è stata analizzata con la correlazione di Spearman. valori e lt P; 0,05 sono stati considerati statisticamente significativi

informazioni di supporto
Figura S1..
wild-type e mutante ZBTB2
-3'UTR che contiene il sito di legame putativo di miR-149 sono stati clonati in psiCHECK-2 vettore. A.
ZBTB2 -3'UTR è stato amplificato dal DNA genomico di AGS. B. corsia 1,3, 5: plasmidi ricombinanti di ZBTB2-1, ZBTB2-2, ZBTB2-3 rispettivamente
; corsia 2,4,6: Risultati della digestione enzimatica di plasmidi ricombinanti di ZBTB2-1, ZBTB2-2, ZBTB2-3
rispettivamente. I risultati hanno mostrato che ZBTB2
-1/2/3 sono stati inseriti con successo in vettori (M1:. DL2000 DNA Marker; M2: DL1 kb DNA Marker; ZTBT2-1 /2/3 bande: 1406 bp; Vettori bande: 6.1 Kb). C. M1: 1 kb Ladder DNA Marker. Corsia 1: amplificazione del mut ZBTB2
F1 /R1 (controllo negativo senza Taq enzima); Corsia 2: amplificazione del mut ZBTB2
F1 /R1. Una banda di mut ZBTB2
(7.6 Kb) ha dimostrato la riuscita della PCR di amplificazione del mutante. D. risultati sequenziamento del WT- ZBTB2
e MT - ZBTB2
doi:. 10.1371 /journal.pone.0041693.s001
(TIF)
Figura S2 .
espressione ZBTB2 in campioni di cancro gastrico e tessuti umani normali adiacenti abbinati. A. Immagini rappresentative mostrate sono colorazione immunoistochimica positiva del ZBTB2 in campioni umani di cancro gastrico (B-C) e abbinati tessuti sani adiacenti (a) (ingrandimento 200 ×). B. la colorazione immunoistochimica è stato segnato come precedentemente descritto [46]; analisi statistica dei dati sulla differenza espressione ZBTB2 tra campioni di cancro gastrico umano e abbinati tessuti non tumorali adiacenti (One-Way analisi ANOVA, F = 117,280, *** p
< 0,001).

• PLoS ONE: CYP2E1 RsaI /PstI polimorfismo e cancro gastrico di sensibilità: Meta-analisi sulla base di 24 studi caso-controllo
• PLoS ONE: fattori di suscettibilità genetica su geni coinvolti nella biosintesi di steroidi Hormone Pathway e progesterone recettore per il cancro gastrico rischio