PLoS ONE: mikroRNA-149 hemmer spredning og cellecyklusprogresjonen gjennom målretting av ZBTB2 i Human Gastric Cancer

Abstract

En økende mengde bevis indikerer at MIR-149 kan både dempe og fremme tumorvekst avhengig tumortype. Imidlertid er rollen til mir-149 i progresjonen av magekreft (GC) er fortsatt ukjent. Her rapporterer vi at MIR-149 er en tumor suppressor i human magekreft. MIR-149 uttrykk er redusert i GC-cellelinjer og kliniske prøver, sammenlignet med normal gastrisk epitelial celle og vev, henholdsvis. Uttrykket nivåer av MIR-149 korrelerer også med graden av differensiering GC-celler og vev. Videre ektopisk ekspresjon av MIR-149 i magekreftceller hemmer proliferasjon og cellesyklusprogresjon ved å nedregulere ZBTB2
, en potent repressor av ARF-HDM2-p53-p21 vei, med en potensiell bindingssete for MIR-149 i sin mRNA er 3'UTR. Det er også funnet at ZBTB2 uttrykk økninger i GC-celler og vev, sammenlignet med normal gastrisk epitelial celle og vev, henholdsvis. Stanse av ZBTB2
fører til undertrykkelse av cellevekst og cellesyklusarrest i G0 /G1 fase, noe som indikerer at ZBTB2 kan virke som et onkogen på GC. Videre transfeksjon av MIR-149 etterligner i magecancerceller induserer nedregulering av ZBTB2 og HDM2, og oppregulering av ARF, p53, p21 og sammenlignet med kontrollene. Oppsummert våre data tyder på at Mir-149 fungerer som en tumor suppressor i human magekreft med, i det minste delvis gjennom, målretting ZBTB2

Citation. Wang Y, Zheng X, Zhang Z, Zhou J, Zhao G, Yang J et al. (2012) mikroRNA-149 hemmer spredning og cellecyklusprogresjonen gjennom målretting av ZBTB2
i Human Gastric Cancer. PLoS ONE 7 (10): e41693. doi: 10,1371 /journal.pone.0041693

Redaktør: Wael El-Rifai, Vanderbilt University Medical Center, USA

mottatt: 13 mars 2012; Godkjent: 25 juni 2012; Publisert: 29 oktober 2012

Copyright: © 2012 Wang et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres

Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet med tilskudd fra Natural Science Foundation National of China (nr. 30872966 og nr. 31071135), National Natural Science Foundation of China (nr. 81000864, ​​nr. 81172290, nr. 91129723, nr. 81090270, og nr. 81090273) , og den kinesiske Postdoktor Science Foundation (nr. 20100471776). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer

Innledning

Magekreft kreft~~POS=HEADCOMP (GC) er en av de vanligste kreftformene og viktigste årsakene til kreft dødsfall på verdensbasis, spesielt i Øst-Asia, ifølge de siste globale estimering publisert i 2011 [1]. Til tross for en bemerkelsesverdig nedgang i GC forekomst i de fleste deler av verden, er det fortsatt en stor byrde fra det store antall GC tilfeller og dødsfall på verdensbasis. Den carcinogenesis av GC er en meget komplisert prosess [2] - [5] som innebærer feilregulering av multiple gener [6] - [8], inkludert onkogener [9] - [14] og tumor-suppressorer [15] - [18]. Imidlertid, de molekylære mekanismer som kreves for GC utvikling og progresjon må videre utforsket.

microRNAs (mirnas) er en gruppe av endogent uttrykt, ikke-kodende RNA små (20-25 nukleotider i lengde) som er kjent å ha en negativ regulere genekspresjon ved å undertrykke oversettelse eller redusere stabiliteten av mRNA ved direkte binding til den 3'-ikke-translaterte området (3'-UTR) av mål-mRNA [19], [20]. Samle bevis indikerer at mirnas spiller viktige roller i utvikling, metabolisme, spredning, differensiering og apoptose. I tillegg er avvikende post-transkripsjonell regulering av mRNA ved mirnas relatert til tumorgenese [21]. Unormale uttrykk profiler av mirnas er påvist i ulike typer humane tumorer, inkludert lunge [22], bryst [23], prostata [24], lever [25], tykktarm [26], og magekreft [27]. Dessuten kan noen mirnas fungere som onkogener eller tumor dempere ved å regulere uttrykket av målgener som spiller viktige roller i cellesyklusprogresjon, apoptose, eller spredning. MIR-22 [28], MIR-101 [29], og MIR-7 [30] har alle blitt vist å bli nedregulert i tumorprøver og fungerer som tumor-suppressorer; MIR-17 [31] og MIR-21 [32] har vist seg å være oppregulert i tumorprøver og fungerer som onkogener. Disse studiene tyder på at dysregulering av mirnas er ofte involvert i karsinogenese og progresjon av kreft.

Nylige studier har antydet at MIR-149 kan spille en viktig rolle i forskjellige sykdommer, inkludert utviklingen av ondartede svulster. MIR-149 har vist seg å fungere både som en tumor suppressor [33] og et oncogen [34] i utviklingen av flere typer av faste tumorer. For eksempel tap av MIR-149 fører til få av funksjon av noen onkogener og korrelerer med tumor grad av nyrecellekreft [35], astrocytomas [36], og prostata kreft [37]. Ektopisk uttrykk for MIR-149 induserer apoptose av neuroblastom og HeLa celler [33]. Forhøyet uttrykk for MIR-149 har blitt rapportert å være viktig i utviklingen av nasopharyngeal carcinoma [38] og melanoma metastase [34]. Videre er feilregulering av MIR-149 også innblandet i noen ikke-neoplastiske sykdommer. For eksempel er nedregulering av Mir-149 uttrykk som er involvert i utviklingen av primær myelofibrose, polycytemi vera, og essensiell trombocytemi [39], og tap av MIR-149 kan undertrykke hepatitt C virus (HCV) RNA overflod [40]. Men uttrykket mønster og rolle MIR-149 i utviklingen av GC er fortsatt uklart.

I denne studien fant vi at MIR-149 er betydelig nedregulert i GC cellelinjer og kliniske prøver i forhold til normal gastrisk epitelcelle og tilstøtende ikke-tumorvev, respektivt. Ektopisk uttrykk for MIR-149 hemmer spredning og induserer G0 /G1 arrest av AGS og SGC7901 celler in vitro
av målretting ZBTB2
. Videre uttømming av ZBTB2
av siRNA resulterer i hemming av spredning og cellesyklus arrest. Uttrykket mønster av MIR-149 og ZBTB2 i GC cellelinjer og kliniske prøver ble omvendt korrelert, videre tyder på at ZBTB2
er et mål gen av MIR-149. Innføring av MIR-149 resulterer i endringer i uttrykket av p53, p21, ARF, og HDM2, medlemmer av ARF-HDM2-p53-p21 sti som er regulert av ZBTB2. Oppsummert disse resultatene bekrefter at MIR-149 er nedregulert i GC-celler og kliniske prøver og foreslår at MIR-149 fungerer som en suppressor av magekreft cellevekst ved å hemme spredning og cellecyklusprogresjonen.

Resultater

uttrykk av MIR-149 er nedregulert i GC cellelinjer og kliniske prøver

for å vurdere rollen til MIR-149 i kreftutvikling av GC, vi først brukt kvantitativ RT-PCR for å måle uttrykket av MIR-149 i humane GC cellelinjer (MKN45, GC9811, AGS, SGC7901, og MKN28) og funnet ut at MIR-149 ble nedregulert i GC cellelinjer i forhold til en normal mage epiteliale cellelinje, GES-1 (fig. 1a). Spesielt ble ekspresjonsnivået av MIR-149 positivt korrelert med differensieringsgrad GC-celler. Nemlig ekspresjonsnivået av MIR-149 i dårlig differensierte cellelinjer, slik som MKN45, GC9811, og AGS, er betydelig lavere enn i moderat og godt differensierte cellelinjer. Ekspresjonen av MIR-149 i moderat differensierte celler, SGC7901, er lavere enn det i den godt differensiert cellelinje, MKN28 (Fig. 1A).

For å bestemme om nivået av MIR-149 også korrelerer med differensiering grad av svulster vi undersøkte uttrykk for MIR-149 i 44 menneskelige GC kliniske prøver, herunder 13 dårlig, 16 moderat, og 15 godt differensierte prøver. Vi fant at uttrykket av MIR-149 i mage svulster er bemerkelsesverdig lavere enn i matchet normale tilstøtende vev (Fig. 1B). Videre uttrykk for MIR-149 i mer differensierte svulster var høyere enn i mindre differensierte tumorer (figur 1C, F = 65,391, p
. ≪ 0,001). I tillegg vil redusert uttrykk av MIR-149 korrelerer med lymfeknutemetastase (* p
= 0,046) og TNM stadium (** p
= 0,0011) (tabell 1).

Ektopisk uttrykk for MIR-149 hemmer spredning og induserer G0 /G1 arrest i AGS og SGC7901 celler

for å undersøke hvilken rolle MIR-149 i GC-celler, vi utnyttet dårlig og moderat differensierte GC cellelinjer, AGS og SGC7901 hhv. AGS og SGC7901 celler ble transient transfektert med eithermature Mir-149 etterligner, inhibitor, mock transfektert eller MIR-NC. Som vist i figur 2A, 2D, kvantitative RT-PCR-resultater viser at ekspresjon av MIR-149 etterligner eller inhibitorer vesentlig oppregulere eller nedregulere ekspresjonen av MIR-149, henholdsvis i AGS og SGC7901 celler fra den første til femte dag posttransfection (Fig . 2A, F = 8,429, p
= 0,003;.. fig 2D, F = 8,595, p
= 0,003) sammenlignet med NC og mock kontrollene

AGS og SGC7901 celler transfektert med MIR-149 etterligner og inhibitorer viste signifikant lavere og høyere nivåer av celleproliferasjon, henholdsvis enn den NC eller mock-grupper som bestemt ved MTT-analysen (figur 2B, F = 27,47, p <. 0,001, fig. 2E, F = 44,061, p < 0,001). Transfeksjon av AGS og SGC7901 celler med Mir-149 etterligner resultatene i betydelig G1 fase arrest i forhold til NC og mock kontrollene ( p
< 0,05). Videre behandling med MIR-149 hemmere førte til færre AGS og SGC7901 celler i G1 arrest i forhold til NC og mock kontrollene ( p
< 0,05). (Fig 2C, F = 134,177, p
< 0,001;. fig. 2F, F = 58,792, p
= 0,003)

ZBTB2
er et mål på MIR-149

Tidligere data tyder på at MIR-149 kan være en suppressor av GC-cellevekst ved å målrette gener som kontrollerer proliferasjon og cellesyklusprogresjon (33-34) (38). Derfor søkte vi etter flere potensielle mål av MIR-149 fra TargetScanHuman database. Vi identifiserte en rekke potensielle Mir-149 mål gener, inkludert ZBTB2
, en POK familie transkripsjonsfaktor og potent repressor av ARF-HDM2-p53-p21 veien (41). ZBTB2
ble funnet å ha antatte MIR-149 bindingssteder innenfor sitt 3'UTR (Fig. 3A). Luciferaserapportørplasmid analyser ble utført for å verifisere om ZBTB2
er et direkte mål på MIR-149 ved hjelp av AGS og SGC7901 celler. Vi kotransfektert AGS og SGC7901 celler henholdsvis med en psiCHECK-2 vektor som inneholder enten 3'UTR for ZBTB2 eller mutert 3'UTR for ZBTB2, og etterligner av MIR-149 eller hemmere av MIR-149. Wild-type og mutant ZBTB2-3'UTR inneholder den antatte bindingssetet av MIR-149 ble klonet inn psiCHECK-2 vektor nedstrøms fra luciferase genet (fig. S1). Innføring av MIR-149 reduserte signifikant luciferase aktivitet fra ZBTB2 3'UTR reporter vektor (fig 3B-3C, p
. ≪ 0,001), men ikke påvirke luciferase aktivitet fra mutant ZBTB2-3 'UTR reporter vektor. Disse data tyder på at Mir-149 direkte regulerer ZBTB2
uttrykk nivåer. Videre er det ingen signifikant reduksjon i relativ luciferaseaktivitet i cellene ko-transfektert med MIR-149-inhibitor eller 3'UTR-ZBTB2 /psiCHECK-2 vektor (Fig. 3B-3C). Det er kanskje på grunn av mangel på interaksjon mellom 3'UTR av ZBTB2 og endogen MIR-149, følgelig, redusert MIR-149 uttrykk økte ikke luciferaseaktivitet fra ZBTB2-3'UTR reporter vektoren. Disse resultatene ytterligere bekrefter at MIR-149 undertrykker ZBTB2 uttrykk ved å målrette den 3'-UTR av ZBTB2
mRNA.

MIR-149 og ZBTB2 uttrykk er negativt korrelert i GC-celler og kliniske prøver

for ytterligere å undersøke forholdet mellom MIR-149 og ZBTB2, undersøkte vi uttrykket av ZBTB2 i GC celler ved hjelp av western blotting og i GC vev ved hjelp av immunhistokjemi. Det ble funnet at GC-cellene har betydelig høyere ekspresjonsnivå av ZBTB2 enn den normale gastriske epitelcelle, GES-1 (figur 4A a-b F = 167,843, p
<. 0,001). ZBTB2 uttrykk negativt korrelert med differensieringsgrad GC celler; dårlig differensierte GC vev viste en signifikant høyere ZBTB2 uttrykk nivå enn godt differensierte GC vev og matchet normale mage vev (Fig S2A-B, F = 117,280, p
. < 0,001). ZBTB2
mRNA uttrykk nivåer er sammenfallende med de proteinnivået (fig 4B en, F = 283,355, p
. ≪ 0,001). Videre er uttrykk for MIR-149 og ZBTB2 negativt korrelert (Fig. 4B b, p
= 0,033, R = -0,908). Vi deretter målt uttrykket nivåer av MIR-149 og ZBTB2
bruker kvantitativ RT-PCR i 5 GC cellelinjer (MKN45, GC9811, AGS, SGC7901, og MKN28) (fig. 4C a) og 18 GC klinisk prøvene (6 dårlig, 6 moderat, og 6 godt differensierte prøver) (fig. 4C b). Resultatene bekrefter at mRNA nivået av ZBTB2
negativt korrelert med Mir-149 uttrykk (fig 4C en, p
= 0,033, R = -0,847;. Fig. 4C b, p
< 0,001, R = -0,908). Videre AGS (fig. 4D) og SGC7901-celler (fig. 4E) transfektert med MIR-149 etterligner har betydelig redusert ekspresjon av ZBTB2 på proteinnivå (panelene A-B) og mRNA-nivåer (panel C) sammenlignet med uekte eller NC celler ( p
< 0,001). Våre funn tyder på at Mir-149 kan direkte regulere uttrykk for ZBTB2
.

MIR-149 undertrykker GC celleproliferasjon og cellesyklusprogresjon ved å målrette ZBTB2

det neste vi bekreftet at MIR-149-mediert spredning hemming og induksjon av cellesyklus arrest i GC celler krever målretting av ZBTB2
. ZBTB2
uttrykk ble slått ned ved hjelp sirnas i AGS og SGC7901 celler. Western blotting (fig. 5A, a-c) og kvantitativ PCR-analyse viste at uttømming av ZBTB2
av siRNA transfeksjon kunne bli kompensert betraktelig ved MIR-149-inhibitor og en markert økning av ZBTB2 ble observert i celler transfektert med MIR-149-hemmere (figur 5B, p
. < 0,001). MTT-analysen viser at proliferasjonen av celler transfektert med siRNA-ZBTB2 ble undertrykket og proliferasjonen av celler transfektert med MIR-149-inhibitorer økte signifikant sammenlignet med celler transfektert med siRNA-NC (kontroll) og siRNA-ZBTB2 + MIR-149 (fig. 5C ). Videre hemming av ZBTB2
uttrykk fremmer G0 /G1 arrest og undertrykker G0 /G1 cellesyklus arrest indusert av MIR-149-hemmer behandling i AGS og SGC7901 celler i forhold til NC kontrollceller (Fig. 5D-5E, p
< 0,001). Våre funn tyder på at Mir-149 hemmer GC celleproliferasjon og cellesyklusprogresjon ved å hemme ZBTB2
uttrykk.

Innføring av MIR-149 endret uttrykk for ZBTB2 og celle-syklus-relaterte proteiner

ZBTB2 har blitt rapportert å være en potent repressor av ARF-HDM2-p53-p21 veien, noe som er viktig i cellesyklus regulering (41). For å undersøke regulering av disse proteiner ved MIR-149 i GC-celler, transfektert vi AGS og SGC7901 celler med Mir-149 etterligner eller MIR-NC og utført RT-PCR og western blotting analyse for ZBTB2 målgener. Som vist i figur 6A-6B, ektopisk ekspresjon av MIR-149 nedregulerer ekspresjonen av ZBTB og HDM2, og oppregulerer ekspresjonen av ARF, p53 og p21 ( p
< 0,001). Disse data er i overensstemmelse med funksjonen av ZBTB2 i undertrykke transkripsjon av ARF, p53 og p21 og aktivering av ekspresjon av HDM2 (41). Videre ektopisk ekspresjon av ZBTB2 ved transfeksjon reversert MIR-149-formidlet reduksjon av HDM2 ekspresjon og økning i ARF, p53 og p21 ekspresjon i AGS og SGC7901 celler (Fig. 6A-B). . Ektopisk ZBTB2 uttrykk ble bekreftet i transfekterte AGS og SGC7901 celler (fig S3, SGC7901 celler, F = 806,365, p
< 0,001; AGS celler, F = 1436,300, p
< 0,001). ARF, p53 og p21 fremme cellecyklusprogresjonen derfor deres downregulation av uttrykk for Mir-149 etterligner forklarer G0 /G1 fase arrest i AGS og SGC7901 celler.

Diskusjoner

Økende bevis tyder på at mirnas spille en avgjørende rolle i kreftutvikling og kreft progresjon [21]. Endrede miRNA ekspresjonsnivåer har vært implisert i initiering og utvikling av tumorer; modulering av miRNAs som fungerer som negative regulatorer av onkogener eller svulst dempere resultater i markedsføringen av kreftcelle spredning og vekst [28] - [32]. Tidligere studier har vist at rollen til mir-149 i progresjonen av forskjellige typer tumorer er kontroversiell [33] - [36], [38]. Uttrykket mønster og mål fra Mir-149 varierer i ulike typer svulster. MIR-149 uttrykk er nedregulert i noen svulster, fungerer som en tumor suppressor ved å målrette onkogener i visse typer kreft. For eksempel, i klarcellet nyrecellekarsinom MIR-149 er nedregulert og dens sannsynlige målene ble identifisert som KCNMA1 og LOX (35). Videre er MIR-149 også nedregulert i glioblastom celler og har blitt foreslått å fungere som en tumor suppressor ved å målrette RAP1B, CD47, CCN1, og NXF1 [36]. I kontrast, kan MIR-149 også fungere som en tumor suppressor ved å målrette visse onkogener. Påvisning av miRNA uttrykk profiler i ulike kliniske stadier av nasopharyngeal karsinom (NPC) og NPC lymfeknutemetastase viser at uttrykket av MIR-149 er oppregulert i NPC og uttrykk av målet genet, Smad2
, er redusert med progresjon av NPC [38]. En lignende onkogen rolle for MIR-149 ble også sett i melanom i hvilken oppregulering av MIR-149 fører til nedregulering av GSK3p-α og oppregulering av Mcl-1, noe som resulterer i apoptotisk motstand [34]. Så langt vi vet lite om hvilken rolle MIR-149 i magekreft. Her rapporterer vi at Mir-149 uttrykk er bemerkelsesverdig redusert i flere magekreft cellelinjer og kliniske prøver sammenlignet med normal mage epitelceller og matchet tilstøtende normalt vev, henholdsvis. Viktigere, er nivået på MIR-149 uttrykk knyttet til differensiering grad av GC-celler og prøver; dårlig differensierte GC-celler eller prøvene har lavere Mir-149 uttrykk i forhold til godt differensierte prøver. Ektopisk uttrykk for MIR-149 hemmer celler spredning og cellecyklusprogresjonen ved å målrette ZBTB2
i AGS og SGC7901 celler. MIR-149 og ZBTB2 uttrykk er negativt korrelert i GC celler og kliniske prøver, og overekspresjon av MIR-149 forårsaker nedregulering av ZBTB2
. Nedbryting av ZBTB2 resulterer i hemming av AGS og SGC7901 celler spredning og cellesyklusprogresjon. Samlet viser disse resultatene, for første gang, at ZBTB2 kan fungere som et onkogen i tumorgenese av magekreft.

Våre data viser at innføringen av MIR-149 inn i GC-celler induserer cellesyklusrest, noe som tyder på at MIR-149 mål kan være innblandet i cellesyklusregulering. ZBTB2 er en POK familie transkripsjonsfaktor som kan undertrykke ARF-HDM2-p53-p21 vei [41]. ARF, en tumor suppressor [42], kan være forårsaket av vedvarende mitogen stimulering og spiller en nøkkelrolle i å aktivere p53 selvstendig og kontrollere stabiliteten av p53 gjennom interaksjon med HDM2 [43], en viktig regulator av p53. Den tumor suppressor p53 spiller en avgjørende rolle i opprettholdelsen av cellen homeostase ved indusering av cellesyklus og apoptose når cellene blir utsatt for stressfaktorer, som hypoksi, DNA-skade, og telomere dysfunksjon [44]. p21, p53 et målgen, medierer cellesyklus G1 faserest gjennom binding og hemme aktiviteten av cyclin-CDK2 eller CDK1 komplekser [45]. ZBTB2 kan undertrykke transkripsjon av ARF, p53 og p21, og indusere HDM2 uttrykk [41]. For å validere om cellesyklus effekter indusert av Mir-149 uttrykk formidles av ZBTB2 tap, undersøkte vi uttrykk for HDM2, ARF, p53 og p21 av AGS og SGC7901 celler transfektert med Mir-149 etterligner. Vi fant at ektopisk uttrykk for MIR-149 resulterer i økt uttrykk av ARF, p53 og p21 og redusert uttrykk for HDM2 og ZBTB2. Disse resultatene støtter ideen om at MIR-149 utøver sin rolle til å hemme GC celler spredning og cellecyklusprogresjonen ved å målrette ZBTB2
dermed modulerende uttrykk for nedstrøms regulatorer av cellesyklusprogresjon.

I sammendraget våre data indikerer at MIR-149 kan fungere som en tumor suppressor i mage kreftceller og spiller en viktig rolle i å hemme ZBTB2
. Derfor nedregulering av MIR-149 fremmer GC celleproliferasjon og cellesyklusprogresjon. Dessuten viser våre resultater at ZBTB2 kan fungere som et onkogen i utvikling av magekreft. Men gitt det faktum at hver miRNA kan regulere mange mål gener som kan påvirke kreftutvikling på ulike måter, er flere studier for å undersøke andre Mir-149 mål som kan ha viktige roller i GC tumorigenesis. Denne studien gir også ny innsikt i rollen som MIR-149 i human magekreft progresjon og indikerer at MIR-149 kan tjene som et terapeutisk mål for magekreft behandling.

Materialer og metoder

Etikk Statement

For vevsprøver, skriftlig informert samtykke ble innhentet fra pasienter. De prosedyrer som brukes i denne studien ble godkjent av Institutional Review Board av den fjerde Military Medical University og ble forvandlet til Helsinki-deklarasjonen, og til lokal lovgivning.

Cellelinjer og kulturforhold

Gastric kreft linjer AGS, ble MKN28, MKN45 kjøpt fra AGCC og, GC9811 og SGC7901 cellelinjer ble hentet fra Beijing Institute of Oncology. Alle cellelinjene ble opprettholdt i vårt institutt i henhold til anbefalte protokoller. Celler ble dyrket i RPMI-1640-medium (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) supplert med 10% føtalt bovint serum (FBS) (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) ved 37 ° C i en 5% CO _{2 inkubator .}

Menneskelige prøver

Alle eksperimentelle prosedyrer ble godkjent av Institutional Review Board av den fjerde Military Medical University. Skriftlig informert samtykke ble innhentet for alle pasient samples.Human magekreft prøver (n = 44) og matchet tilstøtende ikke-kreftprøver ble innhentet fra pasienter på Xijing Hospital of Digestive Diseases, den fjerde Military Medical University, med informert samtykke fra den enkelte pasient.

RNA rensing, cDNA syntese, og kvantitativ real-time PCR (QRT-PCR)

Total RNA fra dyrkede celler ble ekstrahert med TRIzol reagens (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) i henhold til produsentens protokoll og RNA ble lagret ved -80 ° C før QRT-PCR-analyse. Moden MIR-149 uttrykk ble oppdaget ved hjelp av en Mirvana TM QRT-PCR miRNA Detection Kit (Ambion Inc. Austin, Texas), med U6 som en intern kontroll. ZBTB2 ekspresjon ble påvist med primere F: 5'ACTCGGGCGAGATCCACGGC 3 ', R: 5' ACGCAGGCTGCTCATCGGAG 3 ', og GAPDH ble anvendt som en intern kontroll. PCR produktene ble separert på en etidiumbromid-farget 1,5% agarosegel og visualisert med UV.

Cell transfeksjon

Den menneskelige MIR-149 duplex ligne og inhibitor (MIR-149) og negativ kontroll oligonukleotid duplex ligne (MIR-NC) ble designet og levert av Ribobio (Guangzhou, Guangdong, Kina). Den lille interfering RNA (siRNA) for ZBTB2 og negativ kontroll RNA (siRNA-NC) ble syntetisert og renset ved Genepharma (Shanghai, Kina). mirnas, sirnas og ZBTB2 cDNA plasmid (FulenGen Co. Kina) ble transfektert med LipofectamineTM 2000 reagens (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) i henhold til produsentens protokoll. Den ZBTB2 siRNA sekvens: F: 5 'GCUGGCUUCUUUCCAAGUU dTdT 3', R: 5 'AACUUGGAAAGAAGCCAGC 3'; NC siRNA sekvens: F: 5'-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT -3 ', R: 5'-ACGUGACACGUUCGGAGAATT -3'

miRNA mål prediksjon

For å finne potensielle miRNA målgener, TargetScanHuman nettsted (. http://www.targetscan.org/) ble brukt, bindingen fri energi ble beregnet og avventende steder ble analysert ved hjelp http://bibiserv.techfak.uni-bielefeld.de/rnahybrid nettside.

Vector konstruerer og luciferase reporter analysen

for å konstruere ZBTB2-3'UTR plasmid, en villtype 3'-UTR fragment av humant ZBTB2 mRNA (1238-1244 nt, Genbank tiltredelse no. NM_020861.1) som inneholder den antatte MIR-7 bindende sekvens ble amplifisert ved RT-PCR og klonet inn i området mellom Xhol og NotI nedstrøms for luciferase reporter-genet av psiCHECK ™ vektor (Promega, USA). En mutant av singelen MIR-7 bindingssetet (5'GAGCCAG-3 'til 5'ACCGCGC-3') i 3'-UTR av ZBTB2 ble inkludert ved seterettet mutagenese Kit (SBS Genetech, Beijing, Kina ). Wild og mutante typer pmirGLO-ZBTB2-UTR vektorer ble validert ved hjelp av DNA-sekvensering

Nukleotidsekvensene av primere for ZBTB2-3'UTR (MT) klone. MutZBTB2F: 5'GGCCTCACAAGACAAAACAGACCGCGCAAGTAAGGACTGAAGGAGAA 3 'mutZBTB2R: 5' TTCTCCTTCAGTCCTTACTTGCGCGGTCTGTTTTGTCTTGTGAGGCC 3 '

nukleotidsekvensene av primere for ZBTB2-3'UTR (WT) klone: ​​ZBTB2XhoIF: 5'CCGCTCGAG ATGTCACTTATCTTTTTAAAAAACTCTCA 3' ZBTB2NotIR: 5'ATAAGAATGCGGCCGC TACTCATTTAATTAAACGTTTATTC 3 'ZBTB2XhoIF2: 5'CCGCTCGAGATGTCACTTATCTTTTTAAAAAACTCTCATTTTTACAAAGACTATC 3' ZBTB2F3: 5'CCGCTCGAG CTGTAGTTCTCCATGGCATGATAC 3 '.

Celler ble transfektert med Mir-149 etterligner, NC og pmirGLO plasmid i 24-brønners plater ved hjelp Lipofectamin 2000 (Invitrogen) i henhold til instruksjonene. 48 timer senere ble cellene høstet og analysert for luciferase aktivitet ved hjelp av Dual-luciferaserapportørplasmid analysesystem (Promega, USA) og oppdaget av GloMaxTM 20/20 deteksjonssystem (E5331, Promega).

Western blotting

Total protein fra dyrkede celler ble lysert ved Lysis Buffer inneholder PMSF på is. Deretter protein ble underkastet elektroforese gjennom 12% SDS-polyakrylamidgeler og ble deretter overført til en PVDF-membran (Millipore). Membranene ble blokkert med 5% ikke-fett melkepulver ved romtemperatur i 1 time og inkubert over natten med primære antistoffer. Membraner ble inkubert med sekundære antistoffer merket med HRP i 1 time ved romtemperatur etter tre 10 min vaskinger i TBS-T (triethanolaminebuffered saltvann med Tween). Til slutt ble de signaler som påvist ved anvendelse av ECL-sett (Pierce Biotech., Rockford, IL, USA) og membranene ble scannet og analysert ved bruk av en Bio-Rad ChemiDoc XRS + avbildningssystem med bilde (versjon mengde 1). Proteinet ekspresjon ble normalisert til en endogen referanse (aktin) og i forhold til kontrollgruppen. Den Spectra flerfarget bredt spekter protein stige (Fermentas) ble anvendt som molekyl markør. Alle antistoffer som brukes i western blot analyse er oppført i tabell S1.

Immunohistochemistry og Immunhistokjemisk scoring

Parafin seksjoner, fire-mikrometer i tykkelse, ble bakt i 2 timer ved 65 ° C og deparaffinized . Antigen gjenfinning ble utført ved anvendelse av citrat natrium-buffer (pH 7,2) ved 95 ° C i 15 minutter og deretter objektglass ble avkjølt ved romtemperatur i 30 minutter. Etter å ha blitt behandlet med 3% hydrogenperoksid i 15 minutter for å blokkere endogen peroksidase, ble delene behandlet med normalt geiteserum begrensnings væske i 30 minutter for å redusere ikke-spesifikk binding, og deretter kanin polyklonalt anti-ZBTB2 (1:500, BIOSs Co . Kina) ble inkubert seksjonene i 12 timer ved 4 ° C.After gjenoppvarming i 1 time, og vasking av 5 ganger ble snittene inkubert med sekundært antistoff i 30 minutter ved romtemperatur. Diaminobenzidin (DAB) ble anvendt for fargereaksjoner. Påfølgende immunhistokjemisk farging ble scoret som tidligere beskrevet [46].

MTT analyse

Celler ble transfektert med 100 nM MIR-149 inhibitor (Genepharma, Shanghai, Kina), etterligner (Ribobio, Guangzhou, Guangdong) eller 100 nM siRNA-ZBTB2 (Genepharma) .Twenty-fire senere, celler ble sådd i 96-brønns plater (2 x 103 /brønn). Levedyktighet av cellene ble undersøkt av MTT (3-2, 5-difenyl tetrazoliumbromid) assay (Sigma, USA) daglig i 6 dager.

Cell syklus analyse av flowcytometri

Magekreft cellelinjer, AGS og SGC7901 ble dyrket i RPMI-1640-medium (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) supplert med 10% FBS i 6-brønns plater. Transfeksjon ble utført når cellene nådde 80 %% - 90% konfluens. Deretter ble cellene høstet, vasket to ganger ved å bruke PBS og fiksert i 70% etanol ved 4 ° C over natten. Deretter ble cellene inkubert med propidiumjodid ved romtemperatur i 1 time og ble analysert ved hjelp av strømningscytometri ved bruk av et FACScan strømningscytometer (BD Biosciences, Mountain View, CA). Disse dataene ble analysert ved hjelp av FlowJo (FlowJo).

Statistisk analyse

Data ble uttrykt som gjennomsnitt ± SEM av tre uavhengige forsøk. For statistiske tester, SPSS statistisk programvare pakken, version17.0 (SPSS, Chicago, IL, USA) ble brukt. Den t-test, enveis ANOVA og to-veis ANOVA-testen ble utført for MTT-analyser, kvantitativ PCR og tumorvekst kurve. Korrelasjonen mellom MIR-149 og ZBTB2 ble analysert med Spearman rank korrelasjon. P-verdiene < 0,05 ble ansett som statistisk signifikant

Hjelpemiddel Informasjon
Figur S1..
Wild-type og mutant ZBTB2
-3'UTR inneholder den antatte bindingssetet av MIR-149 ble klonet inn psiCHECK-2 vektor. A. ZBTB2
-3'UTR ble forsterket fra genomisk DNA fra AGS. B. Lane 1,3, 5: rekombinante plasmider av ZBTB2-1, ZBTB2-2, ZBTB2-3
henholdsvis; lane 2,4,6: Resultater av enzymet fordøyelsen av rekombinante plasmider av ZBTB2-1, ZBTB2-2, ZBTB2-3
hhv. Resultatene viste at ZBTB2
-1/2/3 har blitt satt inn i vektorer (M1. DL2000 DNA Marker, M2: DL1 kb DNA Marker, ZTBT2-1 /2/3 bånd: 1406 bp; vektorer band: 6.1 kB). C. M1: 1 kb DNA Ladder Marker. Felt 1: forsterkning av mut ZBTB2
F1 /R1 (negativ kontroll uten Taq enzym); Lane 2: forsterkning av mut ZBTB2
F1 /R1. En gjeng mut ZBTB2 product: (7.6 Kb) demonstrerte vellykket PCR av mutant forsterkning. D. Sekvense resultatene av WT ZBTB2 Hotell og MT - ZBTB2
doi:. 10,1371 /journal.pone.0041693.s001 plakater (TIF)
Figur S2 .
ZBTB2 uttrykk i menneskelige mage kreftprøver og matchet tilstøtende normalt vev. A. Representative bildene som vises er positive immunhistokjemisk farging av ZBTB2 i menneskelige magekreft prøver (b-c) og matchet tilstøtende normalt vev (a) (forstørrelse 200 ×). B. Immunhistokjemisk farging ble scoret som tidligere beskrevet [46]; statistisk analyse av data om ZBTB2 uttrykk forskjellen mellom menneskemagekreft prøver og matchet tilstøtende ikke-kreft vev (One-Way ANOVA analyse, F = 117,280, *** p
< 0,001).
doi: 10,1371 /journal.pone.0041693.s002 plakater (TIF)
Figur S3.
Ektopisk ZBTB2
mRNA uttrykk øker ZBTB2 protein uttrykk i GC cellelinjer.

• PLoS ONE: CYP2E1 RsaI /Pstl polymorfisme og Gastric Cancer Følsomhets: Meta-analyser Basert på 24 kasus-kontrollstudier
• PLoS ONE: genetisk mottakelighet Faktorer på gener som er involvert i steroid hormon biosyntesebanen og progesteron reseptor for Gastric Cancer Risk