PLoS ONE: микроРНК-149 ингибирует пролиферацию и клеточного цикла Прогрессия через прицельное ZBTB2 в человека рака желудка

Абстрактный
<р> Все большее количество доказательств указывает на то, что микроРНК-149 может одновременно подавлять и стимулировать рост опухоли в зависимости от типа опухоли. Тем не менее, роль микроРНК-149 в прогрессии рака желудка (GC) остается неизвестной. Здесь мы сообщаем, что микроРНК-149 представляет собой супрессор опухоли при раке желудка человека. выражение микроРНК-149 уменьшается в клеточных линиях, ГХ и клинических образцах по сравнению с нормальной желудочной эпителиальной клетки и ткани, соответственно. Уровни экспрессии микроРНК-149 также коррелирует со степенью дифференцировки GC клеток и тканей. Кроме того, эктопическая экспрессия микроРНК-149 в клетках рака желудка ингибирует прогрессирование пролиферации и клеточного цикла с помощью понижающего регулирования ZBTB2
, мощный репрессор АРФ-HDM2-p53-p21 пути, с потенциальным сайтом связывания для микроРНК-149 в 3'UTR его мРНК в. Также установлено, что экспрессия ZBTB2 увеличение GC клеток и тканей по сравнению с нормальной желудочной эпителиальной клетки и ткани, соответственно. Сайленсинг <ЕМ> ZBTB2
приводит к подавлению роста клеток и арест клеточного цикла в G0 /G1 фазе, указывая, что ZBTB2 может действовать как онкоген в GC. Кроме того, трансфекция микроРНК-149 мимике Into клеток рака желудка индуцирует понижающую регуляцию ZBTB2 и HDM2, и повышающую регуляцию ARF, p53, p21 и по сравнению с контрольной группой. Таким образом, наши данные свидетельствуют о том, что микроРНК-149 функционирует как опухолевый супрессор при раке желудка человека путем, по меньшей мере, частично через, таргетинга ZBTB2

<р> Образец цитирования:. Ван Y, Чжэн X, Чжан Z, Чжоу J, Чжао G, J Ян и др. (2012) микроРНК-149 ингибирует пролиферацию и клеточного цикла Прогрессия через прицельное ZBTB2
в человека рака желудка. PLoS ONE 7 (10): e41693. DOI: 10.1371 /journal.pone.0041693
<р> Редактор: Ваэль Эль-Рифаи, Университет Вандербильта медицинский центр, Соединенные Штаты Америки
<р> Поступило: 13 марта, 2012 года; Принято: 25 июня 2012 года; Опубликовано: 29 октября, 2012
<р> Copyright: © 2012 Wang и др. Это статья с открытым доступом распространяется в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution, которая позволяет неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе, при условии, что оригинальный автор и источник кредитуются

Финансирование:. Эта работа при поддержке грантов от Национального фонда естественных наук Китая (нет. 30872966 и нет. 31071135), Национальный фонд естественных наук Китая (нет. 81000864, ​​нет. 81172290, нет. 91129723, нет. 81090270, и нет. 81090273) и китайский Постдокторское научный фонд (№. 20100471776). Доноры не играет никакой роли в дизайн исследования, сбора и анализа данных, решение о публикации или подготовки рукописи
<р> Конкурирующие интересы:.. Авторы заявили, что не существует никаких конкурирующих интересов

Введение
<р> рак желудка (GC) является одним из наиболее распространенных видов рака и основных причин смерти от рака во всем мире, особенно в Восточной Азии, в соответствии с последней глобальной оценки, опубликованной в 2011 году [1]. Несмотря на значительное снижение заболеваемости ГК в большинстве частей мира, есть еще большая нагрузка от большого числа случаев GC и смерти во всем мире. Канцерогенеза GC является очень сложным процессом [2] - [5] с участием дисрегуляцию множественных генов [6] - [8], в том числе онкогенов [9] - [14] и опухолевые супрессоры [15] - [18]. Однако молекулярные механизмы, необходимые для развития и прогрессирования ГХ необходимо дополнительно изучить.

MicroRNAs (миРНК) представляют собой группу эндогенной экспрессии некодирующих малых РНК (20-25 нуклеотидов в длину), как известно, отрицательно регулируют экспрессию генов путем подавления перевода или уменьшения стабильности мРНК путем прямого связывания с 3'-нетранслируемой области (3'-UTR) целевых мРНК [19], [20]. Накопленные данные показывают, что микроРНК играют важную роль в развитии, обмене веществ, пролиферации, дифференцировки и апоптоза. Кроме того, аберрантное пост-транскрипционной регуляции мРНК с помощью микроРНК связан с онкогенеза [21]. Аномальные профили экспрессии микроРНК были обнаружены в различных типах опухолей человека, в том числе легких [22], молочной железы [23], предстательной железы [24], печени [25], толстой кишки [26], и рак желудка [27]. Кроме того, некоторые микроРНК могут функционировать в качестве онкогенов или супрессоров опухолей путем регуляции экспрессии генов-мишеней, которые играют важную роль в развитии клеточного цикла, апоптоза или пролиферации. микроРНК-22 [28], микроРНК-101 [29], и микроРНК-7 [30] было показано, все быть подавлена ​​в опухолевых образцах и функции как супрессоров опухолей; микроРНК-17 [31] и микроРНК-21 [32] было показано, что в опухолевых повышающей регуляции образцов и функции как онкогены. Эти исследования показывают, что дерегуляция микроРНК часто участвует в канцерогенезе и прогрессии рака.
<Р> Недавние исследования показали, что микроРНК-149 может играть важную роль при различных заболеваниях, в том числе и прогрессирование злокачественных опухолей. микроРНК-149 было показано, функционировать и как опухолевый супрессор [33] и онкоген [34] в развитии нескольких видов твердых опухолей. Например, потеря микроРНК-149 приводит к увеличению функции некоторых онкогенов и коррелирует со степенью опухоли в почечной клеточной карциномы [35], астроцитомы [36], и рак предстательной железы [37]. Эктопическая экспрессия микроРНК-149 индуцирует апоптоз клеток нейробластомы и HeLa [33]. Повышенная экспрессия микроРНК-149 было сообщено, что важную роль в прогрессировании рака носоглотки [38] и метастазирования меланомы [34]. Кроме того, дерегуляция MIR-149 также участвует в некоторых неопухолевых заболеваний. Например, понижающая регуляция экспрессии микроРНК-149 участвует в развитии первичной миелофиброза, полицитемии и эссенциальной тромбоцитемией [39], а также к потере микроРНК-149 может подавлять вирус гепатита С (ВГС) РНК изобилие [40]. Тем не менее, характер экспрессии и роль микроРНК-149 в развитии GC остается неясным.
<Р> В настоящем исследовании мы обнаружили, что микроРНК-149 значительно подавлена ​​в клеточных линиях GC и клинических образцах по сравнению с нормальная желудка эпителиальных клеток и прилегающих к нему тканей неопухолевой, соответственно. Эктопическая экспрессия микроРНК-149 ингибирует пролиферацию и индуцирует G0 /G1 арест AGS и SGC7901 клетки в пробирке
таргетинг ZBTB2
. Кроме того, истощение ZBTB2
по результатам миРНК в подавлении пролиферации и клеточного цикла. Паттерн экспрессии микроРНК-149 и ZBTB2 в клеточных линиях GC и клинических образцах были обратно коррелируют, дополнительно предполагая, что ZBTB2
является целевой ген микроРНК-149. Введение микроРНК-149 приводит к изменениям в экспрессии p53, p21, ARF и HDM2, члены АРФ HDM2-p53-p21 пути, который регулируется ZBTB2. Таким образом, эти результаты подтверждают, что микроРНК-149 подавляется в GC клетках и клинических образцах и предполагают, что микроРНК-149 функционирует как подавитель желудочного роста раковых клеток путем ингибирования прогрессии пролиферации и клеточного цикла.

Результаты <бр>

выражение MIR-149 подавляются в GC клеточных линий и клинических образцов
<р> для того, чтобы оценить роль микроРНК-149 в канцерогенеза GC, мы впервые использовали количественный RT-PCR для измерения экспрессии микроРНК-149 в линиях человека ГХ клеток (MKN45, GC9811, AGS, SGC7901 и MKN28) и обнаружили, что микроРНК-149 была подавлена ​​в линиях GC клеток по сравнению с нормальным желудочной эпителиальной клеточной линии, ГЭС-1 (рис. 1А). В частности, уровень экспрессии микроРНК-149 положительно коррелирует со степенью дифференцировки клеток GC. А именно, уровень экспрессии микроРНК-149 в слабо дифференцированных клеточных линий, таких как MKN45, GC9811 и AGS, значительно ниже, чем в умеренно и хорошо дифференцированные клеточные линии. Выражение MIR-149 в умеренно дифференцированных клеток, SGC7901, ниже, чем в хорошо дифференцированной клеточной линии, MKN28 (рис. 1А).
<Р> Для того, чтобы определить, есть ли уровни микроРНК-149 также коррелируют со степенью дифференцировки опухоли мы исследовали экспрессию микроРНК-149 в 44 GC клинических образцов человека, в том числе 13 плохо, 16 умеренно, и 15 хорошо дифференцированные образцы. Мы обнаружили, что экспрессия микроРНК-149 в опухолях желудка значительно ниже, чем в норме у соседних тканей (рис. 1, б). Кроме того, экспрессия микроРНК-149 в более дифференцированных опухолей была выше, чем в менее дифференцированных опухолей (рис 1C, F = 65,391, р
&л;. 0.001). Кроме того, снижение экспрессии микроРНК-149 коррелирует с метастазов в лимфатических узлах (* р
= 0,046) и стадия TNM (** р = 0,0011
) (таблица 1).

Эктопическая экспрессия микроРНК-149 ингибирует пролиферацию и индуцирует G0 /G1 арест в AGS и SGC7901 клетки

Для того, чтобы исследовать роль микроРНК-149 в GC клетки, мы использовали плохо и умеренно дифференцированные GC клеточные линии, AGS и SGC7901 соответственно. AGS и SGC7901 клетки были трансфицированы с eithermature микроРНК-149 мимика, ингибитор, насмехайся трансфицируют или MIR-NC. Как показано на рисунке 2А, ​​2D, количественные результаты RT-PCR показывают, что экспрессия микроРНК-149 мимике или ингибиторов значительно апрегулируются или подавляют экспрессию микроРНК-149, соответственно, в AGS и SGC7901 клеток с первого по пятый день после трансфекции (рис ., 2А, F = 8,429, р
= 0,003;.. рис 2D, F = 8,595, р
= 0,003) по сравнению с NC и напускной управления
<р> AGS и SGC7901 клетки, трансфицированные микроРНК-149 мимикой и ингибиторов показали значительно ниже и более высокие уровни пролиферации клеток, соответственно, чем NC или имитационной группами, как определено МТТ (рис 2B, F = 27,47, р &Лт;. 0,001;. рис 2E, F = 44,061, р &л; 0,001). Трансфекция AGS и SGC7901 клеток с микроРНК-149 имитирует приводит к значительному G1 фазе ареста по сравнению с NC и напускной управления ( р
&л; 0,05). Кроме того, лечение с микроРНК-149 ингибиторов привело к меньшему количеству AGS и SGC7901 клеток в G1 арестом по сравнению с NC и напускной управления ( р
&л; 0,05). (Рис 2С, F = 134,177, р
&л; 0,001;.. рис 2F, F = 58,792, р
= 0,003)

ZBTB2
является мишенью MIR-149
<р> Предыдущие данные свидетельствуют о том, что микроРНК-149 может быть супрессор роста GC клеток с помощью нацеливание генов, которые контролируют пролиферацию и прогрессию клеточного цикла (33-34) (38). Таким образом, мы искали дополнительных потенциальных мишеней микроРНК-149 из базы данных TargetScanHuman. Мы выявили многочисленные потенциальные целевые гены микроРНК-149, в том числе ZBTB2
, фактор ПОК семьи транскрипции и мощным репрессор АРФ-HDM2-p53-p21 пути (41). ZBTB2
было установлено, что мнимый микроРНК-149 сайтов связывания в пределах его 3'UTR (рис. 3, а). Люциферазы анализы были проведены для проверки ZBTB2
является ли прямой мишенью микроРНК-149 с использованием AGS и SGC7901 клеток. Мы котрансфицируют AGS и SGC7901 клеток соответственно с psiCHECK-2 вектором, содержащим либо 3'UTR для ZBTB2 или мутантный 3'UTR для ZBTB2 и миметики MIR-149 или ингибиторы микроРНК-149. Дикого типа и мутанта ZBTB2-3'UTR содержащие мнимые сайт связывания микроРНК-149, были клонированы в psiCHECK-2 вектора вниз по течению от гена люциферазы (рис. S1). Введение MIR-149 значительно снизило активность люциферазы репортера вектора ZBTB2 3'UTR (рис 3B-3C, р
&л;. 0,001), но не влияет на активность люциферазы с мутантным ZBTB2-3 "репортер вектор УТР. Эти данные свидетельствуют о том, что микроРНК-149 непосредственно регулирует ZBTB2
уровни экспрессии. Кроме того, не существует значительное снижение относительной активности люциферазы в клетках, совместно трансфицировали с ингибитором микроРНК-149 или 3'-UTR-ZBTB2 /вектор psiCHECK-2 (рис. 3В-3С). Это возможно из-за отсутствия взаимодействия между 3'UTR из ZBTB2 и эндогенных микроРНК-149, следовательно, снижение микроРНК-149 экспрессия не увеличивали активность люциферазы от ZBTB2-3'UTR вектора репортера. Эти результаты еще раз подтверждают, что микроРНК-149 подавляет экспрессию ZBTB2 путем ориентации 3'-UTR из ZBTB2
мРНК.

микроРНК-149 и экспрессия ZBTB2 отрицательно коррелирует в GC клетках и клинических образцах

Для дальнейшего изучения взаимосвязи между микроРНК-149 и ZBTB2, мы исследовали экспрессию ZBTB2 в GC клеток с использованием Вестерн-блоттинга и в GC тканях с помощью иммуногистохимии. Было установлено, что GC клетки имеют значительно более высокий уровень экспрессии ZBTB2 чем обычный желудочной эпителиальной клетки, ГЭС-1 (рис 4A A-B F = 167,843, <ЕМ> р
≪. 0,001). ZBTB2 выражение отрицательно коррелирует со степенью дифференциации GC клеток; слабо дифференцированной ткани GC показали значительное более высокий уровень экспрессии ZBTB2 чем хорошо дифференцированных тканей GC и совпадающим нормальных тканей желудка (рис S2A-B, F = 117,280, р
&л;. 0.001). ZBTB2
уровни экспрессии мРНК совпадают с уровнями белка (фиг.4В а, F = 283,355, р
&л;. 0.001). Кроме того, экспрессия микроРНК-149 и ZBTB2 обратно коррелирует (рис. 4В б, р
= 0,033, R = -0,908). Затем мы измерили уровни экспрессии микроРНК-149 и ZBTB2
с использованием количественной ОТ-ПЦР в 5 клеточных линиях GC (MKN45, GC9811, AGS, SGC7901 и MKN28) (рис. 4C а) и 18 GC клиническая образцы (6 плохо, 6 умеренно, и 6 хорошо дифференцированные образцов) (рис. 4C б). Результаты подтверждают, что уровень мРНК ZBTB2
отрицательно коррелирует с микроРНК-149 выражении (рис 4C а, р
= 0,033, R = -0,847;.. Рис 4C б, р
&л; 0,001, R = -0,908). Кроме того, АГС (рис. 4D) и SGC7901 клетки (рис. 4E) трансфицировали микроРНК-149 мимике значительно уменьшилось экспрессию ZBTB2 на уровне белка (панели A-B) и уровней мРНК (панель С) по сравнению с фиктивный или NC клетки ( р
&л; 0,001). Наши результаты показывают, что микроРНК-149 может непосредственно регулировать экспрессию ZBTB2
.

микроРНК-149 подавляет развитие пролиферации клеток и клеточного цикла GC таргетинг ZBTB2

<р> Далее мы подтвердили, что микроРНК-149-опосредованного ингибирования пролиферации и индукции остановки клеточного цикла в клетках GC требует адресности ZBTB2
. ZBTB2
выражение разобранном с помощью миРНК в AGS и SGC7901 клеток. Вестерн-блоттинга (фиг. 5А, а-в) и количественный ПЦР-анализ показал, что истощение <ЕМ> ZBTB2 Ру по миРНК трансфекции может быть значительно компенсировано ингибитором микроРНК-149 и заметное увеличение ZBTB2 наблюдалась в клетках, трансфицированных ингибиторы микроРНК-149 (рис 5B, р
&л;. 0.001). МТТ показывает, что пролиферацию клеток, трансфицированных миРНК-ZBTB2 было подавлено и пролиферацию клеток, трансфецированных с ингибиторами микроРНК-149 значительно увеличилась по сравнению с клетками, трансфицированных миРНК-NC (контроль) и миРНК-ZBTB2 + MIR-149 (рис. 5C ). Кроме того, ингибирование ZBTB2
выражение способствует G0 /G1 арест и подавляет остановку клеточного цикла G0 /G1, индуцированный микроРНК-149 в лечении ингибитором AGS и SGC7901 клеток по сравнению с контрольными клетками NC (рис. 5D-5E, р
&л; 0,001). Наши результаты показывают, что микроРНК-149 ингибирует пролиферацию GC клеток и прогрессию клеточного цикла путем ингибирования ZBTB2
выражение.

Введение MIR-149 изменили экспрессию ZBTB2 и клеточного цикла связанных белков
<р> ZBTB2 сообщалось, является сильным репрессором АРФ-HDM2-p53-p21 пути, который играет важную роль в регуляции клеточного цикла (41). Для того, чтобы исследовать регулирование этих белков с помощью микроРНК-149 в GC клетках, мы трансфецировали AGS и SGC7901 клеток с микроРНК-149 мимике или MIR-NC и проводили ОТ-ПЦР и Вестерн-блоттинга анализ для ZBTB2 генов-мишеней. Как показано на фигуре 6А-6В, эктопическая экспрессия микроРНК-149 подавляет экспрессию ZBTB и HDM2, а также повышает экспрессию АРФ, p53, p21 и ( р
&л; 0,001). Эти данные согласуются с функцией ZBTB2 в подавлении транскрипции ARF, p53, p21 и и активации экспрессии HDM2 (41). Кроме того, эктопическая экспрессия ZBTB2 трансфекцией отменила микроРНК-149-опосредованное снижение экспрессии HDM2 и увеличение АРФ, p53, p21 и выражения в AGS и SGC7901 клетки (рис. 6А-В). . Эктопическая экспрессия ZBTB2 была подтверждена в трансфицированных AGS и SGC7901 клеток (рис S3, SGC7901 клетки, F = 806,365, р
&л; 0,001; AGS клетки, F = 1436,300, р
&л; 0,001). АРФ, р53 и р21 способствуют прогрессии клеточного цикла, следовательно, их понижающей регуляции путем экспрессии микроРНК-149 подражает объясняет фазовый арест G0 /G1 в AGS и SGC7901 клетки.

Обсуждение
<р> все больше доказательств позволяет предположить, что микроРНК играют решающую роль в процессе канцерогенеза и прогрессии рака [21]. Altered уровни экспрессии микроРНК участвуют в инициации и развитии опухолей; модуляция микроРНК, которые функционируют как негативные регуляторы онкогенов или супрессоров опухолей приводит к продвижению пролиферации раковых клеток и роста [28] - [32]. Предыдущие исследования показали, что роль микроРНК-149 в прогрессировании различных типов опухолей является спорным [33] - [36], [38]. Структура и цели микроРНК-149 выражения различаются в различных типах опухолей. выражение микроРНК-149 в некоторых подавлена ​​опухолей, функционирует как подавитель опухоли путем ориентации онкогенов в некоторых видов рака. Например, в ясную карциному почечно-клеточного микроРНК-149 подавляются и его вероятные цели были определены как KCNMA1 и LOX (35). Кроме того, микроРНК-149 также подавляются в клетки глиобластомы и было предложено, чтобы выступать в качестве супрессора опухоли путем ориентации RAP1B, CD47, CCN1 и NXF1 [36]. В противоположность этому, микроРНК-149 может также функционировать в качестве супрессора опухоли путем ориентации определенных онкогенов. Обнаружение профилей экспрессии микроРНК в различных клинических стадиях рака носоглотки (NPC) и NPC метастазов в лимфатических узлах показывает, что экспрессия микроРНК-149 усиливает свою активность в NPC и экспрессия его гена-мишени, Smad2
, уменьшается с прогрессирование NPC [38]. Подобная онкогенными роль микроРНК-149 была также замечена в меланому, в котором повышающая регуляция микроРНК-149 вызывает понижающей регуляции GSK3-альфа и повышающей регуляции MCL-1, что приводит к апоптотической сопротивления [34]. До сих пор мало известно о роли микроРНК-149 при раке желудка. Мы сообщаем, что экспрессия микроРНК-149 заметно сокращается в нескольких желудочных линий раковых клеток и клинических образцах по сравнению с нормальной желудочной эпителиальной клетки и совпадающим соседних нормальных тканей, соответственно. Важно отметить, что уровень экспрессии микроРНК-149 связано со степенью дифференцировки GC клеток и образцов; плохо дифференцированные клетки GC или образцы имеют более низкую экспрессию микроРНК-149 по сравнению с хорошо дифференцированной образцов. Эктопическая экспрессия микроРНК-149 ингибирует пролиферацию клеток и прогрессию клеточного цикла таргетинга ZBTB2
в AGS и SGC7901 клеток. микроРНК-149 и экспрессия ZBTB2 имеют отрицательную корреляцию в GC клетках и клинических образцах, а избыточная экспрессия микроРНК-149 вызывает понижающей регуляции ZBTB2
. Истощение ZBTB2 приводит к торможению AGS и SGC7901 пролиферации клеток и клеточного цикла. В совокупности эти результаты показывают, в первый раз, что ZBTB2 может функционировать как онкоген в онкогенеза рака желудка.
<Р> Наши данные показывают, что введение MIR-149 в GC клетки индуцирует остановку клеточного цикла, предполагая, что микроРНК-149 цели могут быть вовлечены в регуляции клеточного цикла. ZBTB2 является ПОК фактор транскрипции семьи, который может подавлять ARF-HDM2-p53-p21 пути [41]. АРФ, супрессор опухоли [42], может быть вызвано длительной митогенной стимуляции и играет ключевую роль в активации р53 независимо друг от друга и контролировать стабильность р53 за счет взаимодействия с HDM2 [43], является важным регулятором p53. Опухолевого супрессора р53 играет важную роль в поддержании клеточного гомеостаза путем индуцирующего остановки клеточного цикла и апоптоза, когда клетки подвергаются воздействию стрессовых факторов, таких как гипоксия, повреждение ДНК и теломеров дисфункции [44]. p21, целевой ген р53, посредничает фазы клеточного цикла G1 арест путем связывания и ингибирования активности циклин-CDK2 или CDK1 комплексов [45]. ZBTB2 может подавлять транскрипцию ARF, p53, p21 и, и индуцируют экспрессию HDM2 [41]. Для того, чтобы проверить ли эффекты клеточного цикла, индуцированные экспрессии микроРНК-149 опосредуется ZBTB2 потери, мы исследовали экспрессию HDM2, ARF, р53 и р21 из AGS и SGC7901 клеток, трансфицированных микроРНК-149 мимике. Мы обнаружили, что эктопическая экспрессия микроРНК-149 приводит к повышению экспрессии ARF, p53, p21 и и уменьшение экспрессии HDM2 и ZBTB2. Эти результаты подтверждают идею, что микроРНК-149 проявляет свою роль ингибирования GC клеток пролиферации и прогрессию клеточного цикла таргетинга ZBTB2
таким образом модулировать экспрессию нисходящих регуляторов клеточного цикла.

В заключение Наши данные указывают на то, что микроРНК-149 может функционировать как опухолевый супрессор в желудочном раковых клеток и играет важную роль в ингибировании <ЕМ> ZBTB2
. Таким образом, подавление микроРНК-149 способствует пролиферации клеток ГХ и прогрессию клеточного цикла. Более того, наши результаты показывают, что ZBTB2 может функционировать как онкоген в развитии рака желудка. Однако, учитывая тот факт, что каждая микроРНК может регулировать множество генов-мишеней, которые могут повлиять на канцерогенез по-разному, необходимы дальнейшие исследования, чтобы исследовать другие микроРНК-149 цели, которые могут иметь решающую роль в GC онкогенеза. В настоящем исследовании также относится к новым представление о роли микроРНК-149 в прогрессии рака желудка человека и указывает на то, что микроРНК-149 может служить в качестве терапевтической мишени для лечения рака желудка.

Материалы и методы
<Н3> Этика Заявление
<р> Для образцов ткани, письменное информированное согласие было получено от пациентов. Процедуры, используемые в данном исследовании, были одобрены Институциональным наблюдательным советом Четвертого военного медицинского университета и соответствовал Хельсинкской декларации, и местному законодательству.

Клеточные линии и условия культивирования
<р> Желудочный линий рака АГС, MKN28, MKN45 были куплены у AGCC и клеточные линии GC9811 и SGC7901 были получены из Пекинского института онкологии. Все клеточные линии поддерживали в нашем институте в соответствии с рекомендованными протоколами. Клетки культивировали в среде RPMI-1640 (Invitrogen, Carlsbad, CA, США) с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS) (Invitrogen, Carlsbad, CA, США) при 37 ° С в 5% СО а <к югу> 2 инкубаторе .

Человеческие особи
<р> Все экспериментальные процедуры были одобрены Институциональным наблюдательным советом Четвертого военного медицинского университета. Письменное информированное согласие было получено для всех пациентов образцов рака желудка samples.Human (n = 44) и совпадающим соседних образцов неопухолевыми в Xijing больнице болезней пищеварительного тракта были получены от пациентов, Четвертый военный медицинский университет, с информированного согласия от каждого пациента.

очистки РНК, синтеза кДНК, и количественный ПЦР в реальном времени (QRT-PCR),
<р> Суммарную РНК из культивируемых клеток экстрагировали реагентом TRIzol (Invitrogen, Carlsbad, CA, США) в соответствии с протокол и РНК-изготовителя хранили при -80 ° С перед анализом QRT-PCR. Выражение Зрелые микроРНК-149 был обнаружен с помощью Mirvana TM QRT-PCR микроРНК Detection Kit (Амбион Inc. Остин, штат Техас), с U6 в качестве внутреннего контроля. ZBTB2 экспрессия была обнаружена с помощью праймеров F: 5'ACTCGGGCGAGATCCACGGC 3 ', R': 5 'ACGCAGGCTGCTCATCGGAG 3', и GAPDH, был использован в качестве внутреннего контроля. Продукты ПЦР разделяли на бромидом окрашивали 1,5% -ном агарозном геле этидия и визуализировали с помощью УФ-излучения.

трансфекции клеток
<р> человеческой микроРНК-149 дуплексного имитируют и ингибитор (MIR-149) и отрицательный контроль олигонуклеотидный дуплекс имитируют (MIR-NC) были разработаны и предоставлены Ribobio (Гуанчжоу, провинция Гуандун, Китай). Малых интерферирующих РНК (миРНК) для ZBTB2 и отрицательная РНК-контроль (миРНК-NC) были синтезированы и очищены Genepharma (Шанхай, Китай). микроРНК, миРНК и ZBTB2 кДНК плазмиду (FulenGen Co. Китай) были трансфицированы LipofectamineTM 2000 реагента (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) в соответствии с протоколом производителя. ZBTB2 миРНК последовательность: F: 5 'GCUGGCUUCUUUCCAAGUU dTdT 3', R: 5 'AACUUGGAAAGAAGCCAGC 3'; Последовательность NC миРНК: F: 5'-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT -3 ', R: 5'-ACGUGACACGUUCGGAGAATT -3'

микроРНК целевой прогноз

Для того, чтобы найти потенциальных генов-мишеней микроРНК, сайт TargetScanHuman (. http://www.targetscan.org/) использовали, был подсчитан связывания свободной энергии и выжидать сайты были проанализированы с использованием http://bibiserv.techfak.uni-bielefeld.de/rnahybrid~~HEAD=dobj веб-сайт.

Вектор конструкции и люциферазы анализа
<р> Для построения ZBTB2-3'UTR плазмиды, дикого типа, 3'-UTR фрагмент мРНК человеческого ZBTB2 (1238-1244 нуклеотида, GenBank, нет. NM_020861.1) содержащие мнимые микроРНК-7 фиксирующей последовательности амплифицировали с помощью оТ-ПЦР и клонировали в сайт между Xho I и Not I ниже по потоку от гена-репортера люциферазы вектора psiCHECK ™ (Promega, США). Мутант из одного сайта микроРНК-7 связывания (5'- GAGCCAG-3 '5'- ACCGCGC-3') в 3'-UTR из ZBTB2 включен сайт-направленного мутагенеза Kit (SBS Genetech, Пекин, Китай ). Дикий и мутантные типы векторов pmirGLO-ZBTB2-UTR были подтверждены с помощью секвенирования ДНК
<р> нуклеотидные последовательности праймеров для ZBTB2-3'UTR (MT) Клон: mutZBTB2F: 5'GGCCTCACAAGACAAAACAGACCGCGCAAGTAAGGACTGAAGGAGAA 3 'mutZBTB2R: 5'. TTCTCCTTCAGTCCTTACTTGCGCGGTCTGTTTTGTCTTGTGAGGCC 3 '
<р> нуклеотидные последовательности праймеров для ZBTB2-3'UTR (WT) клона: ZBTB2XhoIF: 5'CCGCTCGAG ATGTCACTTATCTTTTTAAAAAACTCTCA 3' ZBTB2NotIR: 5'ATAAGAATGCGGCCGC TACTCATTTAATTAAACGTTTATTC 3 'ZBTB2XhoIF2: 5'CCGCTCGAGATGTCACTTATCTTTTTAAAAAACTCTCATTTTTACAAAGACTATC 3' ZBTB2F3: 5'CCGCTCGAG CTGTAGTTCTCCATGGCATGATAC 3 '.
<р> Клетки трансфицировали с микроРНК-149 мимика, NC и pmirGLO плазмиды в 24-луночные планшеты с использованием липофектамина ™ 2000 (Invitrogen) в соответствии с инструкциями. 48 ч спустя клетки собирали и анализировали на активность люциферазы с использованием двойного люциферазы репортерной системы анализа (Promega, США) и определяется системой обнаружения GloMaxTM 20/20 (E5331, Promega).

вестерн-блоттинга
<р> Общий белок из культивируемых клеток лизируют лизирующего буфера, содержащего PMSF на льду. Затем белок подвергали электрофорезу через 12% полиакриламидном геле, а затем переносили на PVDF мембрану (Millipore). Мембраны блокировали 5% обезжиренным сухим молоком при комнатной температуре в течение 1 ч и инкубировали в течение ночи с первичными антителами. Мембраны инкубировали с вторичными антителами, меченными пероксидазой хрена в течение 1 ч при комнатной температуре, после того, как три 10-минутных промывок в TBS-T (triethanolaminebuffered солевой раствор с Tween). И, наконец, сигналы были обнаружены с использованием ECL набора (Pierce Biotech., Rockford, IL, USA) и мембраны были просмотрены и проанализированы с использованием системы визуализации + Bio-Rad ChemiDoc XRS с программным обеспечением обработки изображений (версия 1) количество. Экспрессии белка нормализовалось к эндогенному ссылки (актин) и по сравнению с контролем. Spectra многоцветной широкого диапазона белка лестницы (Ферментас) был использован в качестве молекулярного маркера. Все антитела, используемые в западном блот, перечислены в таблице S1.

иммуногистохимии и иммуногистохимическое скоринг
<р> парафиновых срезах, 4-мкм в толщину, обжигали в течение 2 ч при 65 ° С и депарафинировали , Антиген поиска проводили с использованием цитратного буфера натрия (рН 7,2) при 95 ° С в течение 15 минут, а затем Срезы охлаждают при комнатной температуре в течение 30 минут. После обработки 3% раствором перекиси водорода в течение 15 минут, чтобы блокировать эндогенной пероксидазы срезы обрабатывали нормальной козьей сыворотки удерживающего жидкость в течение 30 минут, чтобы уменьшить неспецифическое связывание и затем кроличьи поликлональные анти-ZBTB2 (1:500, Биосс Co . Китай) инкубировали секции в течение 12 ч при 4 ° C.After согревания в течение 1 ч и промывки в течение 5 раз, срезы инкубировали с вторичными антителами в течение 30 минут при комнатной температуре. Диаминобензидин (ДАБ) использовали для цветных реакций. Последующее иммуногистохимическое окрашивание оценивали, как описано ранее [46].

МТТ
<р> Клетки трансфицировали 100 нМ ингибитора микроРНК-149 (Genepharma, Шанхай, Китай), подражает (Ribobio, Гуанчжоу, Гуандун, Китай) или 100 нМ миРНК-ZBTB2 (Genepharma) .Twenty-четыре позже, клетки высевали в 96-луночные планшеты (2 × 103 /лунку). Жизнеспособность клеток исследовали с помощью МТТ (3-2, 5-дифенил тетразолия бромид) анализа (Sigma, США) в день в течение 6 дней.

Анализ клеточного цикла методом проточной цитометрии
<р> Рак желудка клеточные линии, АГС и SGC7901 выращивали в среде RPMI-1640 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), дополненной 10% FBS в 6-луночные планшеты. Трансфекция были выполнены, когда клетки достигали 80 %% - 90% слитности. Затем клетки собирали, дважды промывали с помощью PBS и фиксировали в 70% -ном этаноле при температуре 4 ° С в течение ночи. Затем клетки инкубировали с пропидийиодидом при комнатной температуре в течение 1 ч и анализировали с помощью проточной цитометрии с использованием проточного цитометра FACScan (BD Biosciences, Mountain View, CA). Эти данные были проанализированы с помощью Flowjo (Flowjo).

Статистический анализ
<р> Данные были выражены как среднее ± SEM трех независимых экспериментов. Для статистических тестов, SPSS статистического программного обеспечения пакета, version17.0 (SPSS, Чикаго, Иллинойс, США) был использован. Т-тест студента, ANOVA и двухсторонняя тест ANOVA односторонний были проведены для МТТ анализов, количественной ПЦР и опухолевого роста кривой. Корреляция между микроРНК-149 и ZBTB2 анализировали с Спирмена ранговой корреляции. Значения Р &л; 0,05 считались статистически значимыми

Поддержка Информация
Рисунок S1..
дикого типа и мутанта ZBTB2
-3'UTR, содержащий предполагаемый сайт связывания микроРНК-149 были клонированы в psiCHECK-2 вектора. А. ZBTB2
-3'UTR амплифицировали из геномной ДНК AGS. B. Lane 1,3, 5: рекомбинантные плазмиды ZBTB2-1, ZBTB2-2, ZBTB2-3
соответственно; полоса 2,4,6: Результаты ферментативного расщепления рекомбинантных плазмид ZBTB2-1, ZBTB2-2, ZBTB2-3
соответственно. Результаты показали, что ZBTB2
-1/2/3 были успешно вставлены в векторы (M1:. DL2000 маркерной ДНК; M2: DL1 кб ДНК-маркер; ZTBT2-1 /2/3 полосы: 1406 пар оснований; Векторы полосы: 6.1 Kb). C. M1: 1 кб ДНК Ladder Marker. Дорожка 1: усиление Мут ZBTB2
F1 /R1 (отрицательный контроль без Taq фермента); Дорожка 2: усиление Мут ZBTB2
F1 /R1. Одна группа Мут ZBTB2
(7.6 Kb) продемонстрировали успешное ПЦР-амплификации мутанта. D. Результаты секвенирования <вес EM> ZBTB2
и MT - ZBTB2

DOI:. 10,1371 /journal.pone.0041693.s001
(TIF) Рисунок S2
,
выражение ZBTB2 в желудочном образцов рака человека и совпавших соседних нормальных тканей. A. Представительные изображения показаны положительные иммуногистохимическое окрашивание ZBTB2 в желудочном образцов рака человека (б-в) и совпадающим соседних нормальных тканей (а) (увеличение 200 ×). В. Иммуногистохимическое окрашивание оценивали, как описано ранее [46]; Статистический анализ данных о разнице экспрессии ZBTB2 между желудочных образцов рака человека и подобранных смежных нераковых тканей (односторонний анализ ANOVA, F = 117,280, *** р
&л; 0,001).

• PLoS ONE: CYP2E1 RsaI /PstI полиморфизма и рака желудка Восприимчивость: Мета-анализ на основе 24 исследований случай-конт…
• PLoS ONE: генетическая предрасположенность факторов на гены, участвующие в стероидных гормонов и биосинтеза рец…