PLoS ONE: ekspresiji od Cx43 je povezana s peritonealne metastaze raka želuca i Cx43 posrednika Gap Junction Poboljšava rak želuca Cell dijapedezom iz peritonealnoj Mesothelium

Sažetak pregled

Proces peritonejsku metastaza uključuje dijapedezom odljuštenih stanica intraabdominalni rak želuca kroz staničnom sloju mesothelial; Međutim, molekularni mehanizmi za ovaj proces još uvijek nije jasno. Heterocellular praznina spojnog međustanična komunikacija (GJIC) između želuca stanica raka i mesothelial stanica može igrati aktivnu ulogu tijekom dijapedezom. U ovom istraživanju otkrili smo ekspresiju koneksini 43 (Cx43) u primarnim želučanih tkiva raka, unutar trbušne odljuštenih stanica raka, i odgovarajuće metastatskih peritonealnom tkiva. Otkrili smo da je izraz Cx43 u osnovnim želučanog tkiva raka bila je znatno smanjena; su unutar trbušne odljuštenih stanica raka i uskladiti metastatski peritonealne tkiva izlagao povećanje ekspresije u usporedbi s osnovnim želučanog tkiva raka. BGC-823 i SGC-7901 ljudske stanice raka želuca su projektirana kako bi izrazili Cx43 ili Cx43T154A (a mutirani protein da samo parovi gap čvorišta, ali ne daje međustanične komunikacije) i bili su ko-kultiviran s ljudskim peritonealnom mesothelial stanica (HPMCs). Heterocellular GJIC i dijapedezom kroz HPMC monoslojeva na Matrigel obložene pokrovnim ispitan. Otkrili smo da BGC-823 i SGC-7901 stanice raka želuca umnažaju Cx43 formiraju funkcionalne heterocellular razmak raskrižja s HPMC monoslojeva roku od jednog sata. Značajan porast dijapedezom zabilježeno je u projektirana Cx43-stanica koje eksprimiraju u usporedbi s Cx43T154A i kontrolna skupina stanica, koje je predložio da se promatrana uzlazni dijapedezom u Cx43-stanica koje eksprimiraju potrebno heterocellular GJIC. Daljnje studije su otkrile da su želučane stanice raka transmigrated kroz međustanični prostor između mesothelial stanica preko paracellular rute. Naši rezultati sugeriraju da je nenormalan izraz Cx43 igra bitnu ulogu u peritonealnoj metastaza, te da Cx43 posredovane heterocellular GJIC između želuca stanica raka i mesothelial stanica može biti važan regulatorni korak tijekom metastaza. Konačno, primijetili smo da je dijapedezom odljuštenih stanica raka želuca kroz mesothelial barijera je održiv način paracellular migracija pregled

Izvor:. Tang B, Peng Zh, Yu PW, Yu G, Qian F, Zeng DZ, et al. (2013) ekspresiji od Cx43 je povezana s peritonealne metastaze raka želuca i Cx43 posrednika Gap Junction Poboljšava raka želuca Cell dijapedezom od peritonealnoj Mesothelium. PLoS ONE 8 (9): e74527. doi: 10,1371 /journal.pone.0074527 pregled

Urednik: Johanna M Brandner, Klinička bolnica Hamburg-Eppendorf, Njemačka pregled

Primljeno: 19. siječnja 2013; Prihvaćeno: 6. kolovoz 2013; Objavljeno: 11. rujna 2013 pregled

Copyright: © 2013 Tang i sur. Ovo je otvorenog pristupa članak distribuirati pod uvjetima Creative Commons Imenovanje License, koja omogućuje neograničeno korištenje, distribuciju i reprodukciju u bilo kojem mediju, pod uvjetom da je izvorni autor i izvor su zaslužan

financiranja. Ovo djelo je podržan od strane grant br 30801097 i broj 81272366 od Nacionalne zaklade prirodoslovni Kine. U financijeri nisu imali ulogu u studiju dizajna, prikupljanja i analize podataka, Odluka o objavi, ili pripremu rukopisa pregled

U konkurenciji interese.. Autori su izjavili da ne postoje suprotstavljeni interesi pregled

Uvod pregled

učestalost karcinoma želuca je u opadanju, ali i dalje je glavni uzrok raka povezanih smrti u svijetu. Dominantni značajke želučanih stanica raka uključuju i njihove invazivne i metastatskih kapacitete. Peritonejska metastaza je kritična značajka za napredovanje tumora u naprednim rakom želuca [1]. Tijekom procesa peritonealne metastaze, želučanih stanice raka interakciju intercellularly s više tipova stanica, a interakcija unutar trbušne odljuštenim želuca stanica raka i peritonealnim mezotelnih stanica je od posebne važnosti. Kao kontinuiranog ljudskog peritonejsku mesothelial stanice (HPMC) je sloj djeluje kao barijera protiv peritonejsku metastaze, kada dolazi do dijapedezom odljuštenih stanica raka želuca kroz mesothelial staničnom sloju, obilje krvi opskrbe u matrici ispod mesothelium će ponuditi ugodan okoliš za metastatskim želuca stanice raka i promicati njihovo naseljavanje. Dakle, dijapedezom odljuštenih stanica raka želuca kroz staničnog mesothelial je bitan korak u peritonealnoj metastaza. Interakcija ovih stanica je popraćeno međustanične komunikacije (IC), a uglavnom je posredovana međustanična pukotinskim spojevima [2]. Pukotinski spojevi se oblikuju membranskim plazma connexins, od kojih se sastoji od šest connexins (CXS) [3]. Do sada, 20 različitih koneksini izoformi su identificirane kod ljudi. Cx43 opći izoforma eksprimiraju kod većine epitelnih tkiva. Prethodne studije [4-6] naznačeno da Cx43 izraz smanjila tijekom tumorigenezi i zbog toga je klasificiran kao supresor tumora. Međutim, postoji sve više dokaza da connexins mogu biti uključeni u intravasation i izljeva kanceroznih stanica i igrati pozitivnu ulogu u procesu metastaziranja [7,8]. Da li je Cx43 posredovana propusna veza igra važnu ulogu u dijapedezom želučanih stanica raka kroz peritonejsku mesothelial barijere ostaje nejasno. Za rješavanje hipoteze ispitali smo ekspresiju Cx43 u osnovnim želučanog tkiva raka, piling želučane stanice raka i peritonealnih metastatskih tkiva. konstruirali smo Cx43-izražava vektora i mutaciju vektor Cx43T154A stranice. Zatim, koristili smo dva staničnih linija raka želučanog (BGC-823 i SGC-7901) koji je GJIC manjkava i ne izražavaju sve poznate connexins [9]. Zbog mesothelial stanica obilno izražavaju Cx43, projektirana smo želučane stanice raka izraziti bilo divlji tip Cx43 ili site-specific mutant kako bi se utvrdilo da li je potencijal dijapedezom želučane stanice raka 'kroz mesothelium će se promijeniti u oba ili bilo koji od ovih uvjeta. U ovom istraživanju smo pokazali da Cx43 izraz regulira povišenje tumorskih stanica dijapedezom preko GJIC-ovisnih mehanizma pregled

Materijali i metode pregled

2.1. Reagensi i antitijela

Anti-koneksini 43 poliklonalnog antitijela (Zymed, San Diego, CA, USA), Matrigel (Becton Dickenson, Bedford, MA, USA), 1, 1 'diocta-decil-3, 3, 3', 3'-tetramethylindocarbocyanine percholate (Dil Molecular sonde, Eugene, OR, USA), Kalccin-AM (Dojindo, Kumamoto, Japan) i FITC-konjugirani phalloidin nabavljena su od Sigme (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA). pregled

2.2 : uzorci tkiva i citološku pretragu pregled

Svi su sudionici pod uvjetom pismeni informirani pristanak (od skrbnika ako je potrebno). Ovo istraživanje provedeno je u skladu s načelima Deklaracije Helsinki i njegove izmjene i dopune te je odobren od strane Etičkog povjerenstva jugozapadne bolnice, treći Vojnomedicinsku Sveučilišta. Istraživanje populacija sastojala se od 42 pacijenata koji su bili klasificirani kao stadiju IV prema sedmom izdanju UICC TNM klasifikacije malignih tumora. Kliničko varijable navedene su u tablici 1. Svi pacijenti upisanih u našem istraživanju prošao palijativnu ili istraživačku operaciju. Primarni tumor i metastatski peritonealne tkiva se prikupe prije završetka operacije, a piling želučani stanice raka su skupljene centrifugiranjem ascitesa ili trbušnu iscjetku (ako ascites ne postoji). Stanični sloj nukleizirane je razmazana na staklenu pločicu i obojeni s hematoksilinom i eozinom (Nj). Dva iskusni cytopathologists obavlja citološke procjene. CEA je korišten kao biomarkera za pomoć identificirati stanice adenokarcinoma imunoflorescencijom s pozitivnim bojanjem. Slučajevi su isključeni iz ovog istraživanja kada su rezultati oba cytopathologists nisu bili u dogovoru pregled Group
Broj pregled posto (%)
Sex male2764.0 female1536.0Age (godine) <. 501.740,4 ≥502559.6Tumor lokacija tip Antral2150.0 Body1228.6 Fundic911.4Pathological Pa differentiated24.7 Umjereno differentiated49.5 Loše differentiated3685.8Bormann tipkanje I00 II12.4 III1228.5 IV2969.1Ascites Yes1535.7 No2764.3Surgical pristup palijativnoj gastrectomy2457.1 eksplorativna + biopsy1842.9Table 1. Kliničke i patološke karakteristike 42 slučajeva oboljelih od karcinoma želuca
CSV Preuzmite CSV

2.3. Imunohistokem pregled

uzorci Parafin tkiva primarnih tumora i metastatskih peritonealna tkiva su serijski prerezani i on bojenjem potvrdio postojanje karcinoma želuca. Uzastopnih sekcije su deparafmizirani, dehidriran i podvrgnut dohvat antigena u nizu. Sekcije su inkubirane s anti-zečjim poliklonskim protutijelom Cx43 tijekom 24 sata na 4 ° C. Vezna mjesta su vizualizirani s 3, 3'-diamino-benzidina (DAB) na 5-minutne reakcije. Sekcije su Mayerovim hematoksilinom, dehidrirana, očišćena i montiran. Izostavljanje primarnog antitijela korištena je kao negativna kontrola. Imunohistokemijska bojanja je ocijenjena dodjeljivanjem bodova na temelju opsega i intenziteta imunoreaktivnost. Bojenje koliko je procijenjena semikvantitativno u citoplazmi i membranu kao negativan (0, < 5% stanica obojeni), pozitivne 1 + (6-25% stanica obojeno), pozitivne 2 + (26-50% stanica obojenih) ili pozitivan 3 + ( > 50% stanica koje su obojene). Intenzitet bojenja je ocijenjen kao 0 (nema bojanje), 1 (slabo obojenje, žuto smeđe), 2 (umjereno obojenje, žuto smeđa) ili 3 (jakim obojenjem, smeđa). . Rezultati imunobojanja zabio kao zbroj opsegu i intenzitetu imunog, s obzirom na rezultat ≥3 pozitivno i rezultat < negativna pregled

3 2.4: imunofluorescencija pregled

Cx43 izraz u intraabdominalni odljuštenih želučane stanice raka procijenjena je metodom imunofluorescencije. Četrdeset i dva slučaja su upisani u našem istraživanju. Stanice premazani na pokrovnim stakalcima su fiksirane s 4% -tnim paraformaldehidom i isprane s PBS koji sadrži 0,5% BSA (za ispiranje pufer). Stanice su zatim inkubirane 24 sata na 4 ° C s anti-Cx43 protutijelom (1: 150). Pokrovna stakalca su isprane i inkubirane s FITC-konjugiranim kozjim antizečjim sekundarnim antitijelom. Jezgre su obojene s 10 ug /ml DAPI (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA). Pokrovna stakalca su snimio pomoću fluorescentnim mikroskopom (Siemens, Njemačka). Kontrola (Primarna antitijela su zamijenjeni s PBS-u) bila negativna za sve pokuse (podaci nisu prikazani)

2.5. Stanična kultura i Stabilna ekspresija Cx43 i Cx43 mutanata pregled

nemaligno humani imortaliziranih mezotelnih stanica , Met-5A, dobiveni su od ATCC. Te stanice održavane su i umnožavane u mediju 199 koji sadrži 1,5 g /l natrijevog bikarbonata, 10% fetalnog telećeg seruma, 3.3 nM faktora rasta epiderma (EGF), 400 nM hidrokortizon, 870 nM cink bez goveđeg inzulina, 20 mM HEPES, i 3.87 ug /L selenious kiselina (H2SeO3). pregled

ljudskog želučanog adenokarcinoma stanične linije BGC-823 i SGC-7901 dobiveni su iz banke stanica Shanghai Institute, kineske akademije znanosti. Cx43- i Cx43T154A-izražavanje vektori su konstruirani pomoću lentivirusnog infekcije. PTA2-Cx43, koji je uključivao slijed Cx43 kodira ljudski, izgrađen je u našem laboratoriju. Cx43T154A stranica mutacija vektor konstrukcija se izvodi pomoću overlap extension PCR, koji kodira protein koji djeluje kao čvorište jaz bez IC kao što je prethodno opisano [10]. CDNA Cx43 i Cx43T154A umetnuta u Lenti-GFP vektor i transfektirani u 293 pakiranja stanične linije. Lentivirusnog supernatant je sakupljen nakon 48 sata, filtrirana kroz 0.45 um filter-a koristi se za infekciju BGC-823 i SGC-7901 stanice. Medij je zamijenjen s RPMI1640 24 sata nakon infekcije, i stanice su kultivirane rutinski. Više od 90% tumorskih stanica izraženih Cx43 ili Cx43T154A nakon tri kruga virusne infekcije; uspješno inficirane stanice se sakupe protočnom citometrijom pregled

2.6. ekstrakcija proteina i Western blot analiza pregled

konstruirati Cx43- i Cx43T154A koje eksprimiraju BGC-823 i SGC-7901 želučanih stanice raka su lizirane , Protein (50 ug) iz svakog tipa stanica se odvoji na 12% SDS-poliakrilamid gelu i preneseni na nitroceluloznue membrane. Nitrocelulozne membrane su blokirani s 5% nemasnim suhim mlijekom i zatim su ispitane na Cx43 proteina pomoću poliklonskog anti-Cx43 antitijelo (1: 500). Imunoblot istraživani s odgovarajućim peroksidaza-konjugiranog sekundarnog antitijela (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) u omjeru 1: 10,000. Proteini su vizualizirani korištenjem SuperSignal West Pico kemiluminiscentnom podlogom (Pierce Chemical Co.) i imunoblot bili izloženi Amersham Hyperfilm (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ, USA) 30 s pregled

2,7. Tumorske stanične /mezotelnih stanične adhezije pregled

mezotelnih stanice su rasle do konfluencije monosloja na pokrovnim stakalcima u 24 jažica. Preobražene Cx43- i Cx43T154A-izražavanje želučanih stanice raka su označene s 10 ug /ml DiI otopinu tijekom 15 minuta na 37 ° C. Dil je uobičajeno fluorescentne probe koja pokazuje narančasto-crvene fluorescencije u membranama i upotrijebljen je u našem istraživanju za označavanje želučanih stanice raka. Te označene stanice su zatim dodana u staničnom sloju mesothelial i inkubira 1 h na 37 ° C. Nonadherent stanice uklonjene ispiranjem i stanice koje su pričvršćene na staničnom sloju mesothelial su fiksirane s 4% paraformaldehidom. Snimci kulture su bile postavljene u Mowiol (calbiochem) i ispitana je pomoću fluorescentne mikroskopije (Leica MPS 60) pregled

2,8. Tumor stanica /mesothelial Cell GJIC Test pregled

projektirana Cx43- i Cx43T154A-izražavanje BGC-823 i SGC-7901 želučanih stanice raka su obilježavane 15 minuta pri 37 ° C sa 2 ml Opti-MEM koji sadrži 10 ug /ml Calcein-AM i 10 ug /ml razr. Kalccin-AM je fluorescentna supstrat koji se cijepa u živih stanica u obliku membrane nepropustan za koje mogu proći kroz funkcionalne jaz čvorišta, ali ne i drugih plazma membrane kanala. Mezotelijalno slojevi stanica su tretirani tijekom 4 sata uz 150μM Karbenoksolona (CBX) za blokiranje homotipičnu GJIC i zatim su tretirane 15 minuta s 10 ug /ml kalceina-AM (Molecular Probes) u Opti-MEM otopine. I pored obilježeni želučanih stanice raka su dodani u Met-5A monoslojeva na Matrigel i heterotypic GJIC između želuca stanica i mesothelial stanica je otkriven. Fluorescentna oporavak izbijeljeni stanicama će se dogoditi samo ako se boja prolazi kroz otvor čvorišta iz susjednih nebijeljene stanica raka želuca. Pojedinačne mezotelnih stanica susjedna želuca stanice raka su izbijeljeni otprilike 30 s pomoću Zeiss laserskog skenirajućeg mikroskopa konfokalnog i argonskim laserom na 33% snage za svako eksperimentalno stanje. Pojedinačne mesothelial stanica koje se ne može utvrditi GJIC su odlučili proći blenching kao kontrole. Netretirane stanice su korištene kao pozadinske modificiranje stanica. Srednja intenzitet fluorescencije bijeljene /nebijeljene stanica izmjerena tijekom vremena koristeći potomak obrada slike softver, a stopa fluorescencija oporavak je izračunata kao (Kt = (lb-Ib0) /lu × 100%, Kt: fluorescencija oporavak stopa u trenutku t; Ib: intenzitet fluorescencije u bijeljene stanici u trenutku t, Ib0: intenzitet fluorescencije u izbijeljene stanici u trenutku t = 0; lu. intenzitet fluorescencije u susjednoj nebijeljene stanici u vremenu t) [11] pregled

2,9: transmesothelial migracija test pregled

transmesothelial migracija Ispitivanje je provedeno, kao što je ranije [12] što je opisano. Ukratko, 1 × 10 ^{5 Met-5A mezotelnih stanica su nasađene na 12-mm staklenu pokrovnicu koje su obložene Matrigel (Becton Dickenson-a, USA). Monoslojevi dostigli konfluenciju određen svjetlosnim mikroskopom. Pokrovna stakalca su prenesene u 24-jažične ploče je i uzgajane su 48 sata u EGM. Želučani stanice raka su podijeljena praznim vektorom skupine Cx43 koje eksprimiraju skupina, Cx43T154A koje eksprimiraju skupina i CBX prethodno tretiranih skupinom (Cx43-eksprimiraju želučanih stanice raka su tretirani tijekom 4 sata uz 150μM Karbenoksolona (CBX) za blokiranje homotipičnu GJIC) označena Dil , Približno 1 × 10 5 stanice se dodaju mezotelnih staničnim kulturama u omjeru 1:10 (tumorske stanice: Mezotelijalno stanica). Stanice su ko-kultivirane različitim vremenima (1, 4, ili 7H), prije žive promatranje ili fiksaciju i imunobojenja. Zaslijepljeni istražitelji kvantificirati dijapedezom pomoću LSM, kao što je ranije [7] opisano. Ukratko, ko-kulture su fiksirane i obojene za F-aktin. Dijapedezom određena je kao broj tumorskih stanica koje su u kontaktu s mezotelijumu i klasificirani u tri stupnja prema njihovom položaju u odnosu na mezotelijumu: 1) zaobljen - tumorske stanice sa sfernog oblika na apikalnu površinu mezotelijumu; 2) migrirajuće - tumorske stanice prodrlo kroz mesothelial staničnih monoslojeva na mezotelnih stanica križanja s dijelom tijela stanica, iznad mezotelijumu i dijela tijela stanica proširila na Matrigel ispod mezotelijalno stanica F-aktina stresnih vlakna; i 3) ispod - cijelo tijelo tumorskih stanica bila je ispod ravnine mesothelial stanica stresa vlakana. I prebacivanje ispod stanice su klasificirani kao seleći. Približno 100 Mezotelijum prianjanja stanice su zabilježene i broje na stakalce, a svi eksperimenti su ponovljeni tri puta s trostrukim pokrovnim pregled}

2,10. Statistička analiza pregled

Sve statistička analiza je provedena pomoću SPSS softver ( verzija 13.0). Vjerojatnost P < 0,05 smatrane su statistički značajne pregled

Rezultati pregled

3.1. Izraz Cx43 u primarnim tumorima i odgovarajuće metastatskih peritonealna tkiva pregled

Četrdeset i dva normalna sluznica (100%) izrazio Cx43 s tipičnom membranski i citoplazmatski bojenje (Slika 1A). Jedanaest od 42 primarnih tumora (26,2%) bili su pozitivni za Cx43 koji je značajno smanjen u odnosu na susjedne normalne sluznice (p < 0.05). Cx43 ekspresija bila heterogena u različitim uzorcima tkiva: u dobro diferencirana tkiva želuca raka Cx43 izraz pokazuje veliki miješane (citoplazmatski i membranski) bojanje (Slika 1B); umjereno diferencirani želučani tkiva raka imao je samo u citoplazmi Cx43 izraz (slika 1C); i Cx43 jedva je izražen u loše diferenciranim želučanog tkiva raka (Slika 1D). Za razliku od toga, Cx43 ekspresija značajno je povećana u 29 od 42 metastatskih peritonealna tkiva (69,0%), te su pokazali tipičnu citoplazmi i membranskom bojenje (p < 0,05). (Slika 1E) (Tablica 2)
koneksini 43
Primarno rak želuca (slučajevi) (%)
susjedstvu normalno tkivo (slučajevi) (%)
Metastatski peritonejsku tkiva (slučajevi) (%) pregled Negativna (ocjena < 3) 31 (73,8%) 0 (0 ) 13 (31,0%) Pozitivna (score≥3) 11 (26,2%) * 42 (100%) 29 (69,0%) † Tablica 2. Rezultati imunohistokemijski na koneksini 43 izražavanja u osnovnoj želučanog tkiva raka, susjedna normalnim želučanog tkiva i peritonealnoj . metastatski tkiva (N = 42) pregled * u usporedbi sa susjednim normalnim tkivima, ekspresija koneksini 43 značajno smanjen (p < 0,05); † usporedbi s primarnim želučane tkiva raka, ekspresija koneksini 43 u metastatskom peritonealnoj tkivu značajno povećana (p 0,05). CSV Preuzmite CSV

3.2: Cx43 izraz u intraabdominalni odljuštenih stanica raka želuca pregled

Većina intraabdominalni odljuštene želučane stanice raka postoje kao višestaničnih sferoida (Slika 1 f). Pozitivna Cx43 imunološko zabilježeno je u 35 od ukupno 42 slučajeva intra-abdominalnih odljuštenim stanicama raka miješanog citoplazmi i membranske bojenje, i pozitivnu stopu je 83,3% (slika 1 G, H i I). Pregled

3.3 Ekspresija egzogenog Cx43 u BGC-823 i SGC-7901 stanica raka želuca pregled

želučani stanice raka su projektirana kako bi izrazili funkcionalnu Cx43, Cx43T154A i praznu lentivirusnog vektor kao kontrola bi istražili učinke Cx43 izražavanja na biološko ponašanje tih stanica. Cx43 izraz bio odsutan u prazan vektor grupi, ali su ostale dvije projektirana grupe otkrivene su izraziti bilo Cx43 ili Cx43T154A (slika 2A) pregled

3.4. Prionljivost želučane stanica raka na mesothelial stanica pregled

učinak Cx43 na adheziju stanica raka na želuca mesothelial stanica isto tako je istražena. Projektirana želučane stanice raka koje eksprimiraju divlji tip Cx43 ili Cx43T154A pokazuju značajan porast u adhezije na mesothelial stanica u usporedbi s praznim vektorom (p < 0,05). Opaženo je da nema značajne razlike u sposobnosti adhezije između Cx43- i Cx43T154A eksprimiraju skupina (p > 0,05), što ukazuje da Cx43 potiče želučane raka stanične adhezije, koja je neovisna o GJIC (slika 2b) pregled

3.5: Konstruiran. Cx43-izražavanje BGC-823 i SGC-7901 stanice formiraju funkcionalne propusna veza kanala sa mesothelial staničnom sloju pregled

ko-kultiviranih projektirana Cx43- i Cx43T154A-izražavanje želučane stanice raka s mesothelial staničnom sloju ispitati sposobnost Cx43 -eksprimirajući stanice u obliku raspora čvorišta i uspostaviti GJIC s mesothelial stanica. Rezultati pokazuju da je želučani stanice raka u bilo praznim vektorom skupine ili skupine nije Cx43T154A utvrditi GJIC sa susjednim peritonealnim mezotelnih stanica nakon laserskog izbjeljivanje, a Cx43 eksprimirajuće grupa mogla uspostaviti GJIC u peritonealnim mezotelnih stanica uspješno. Intracelularni intenzitet fluorescencije otkrivena prije izbjeljivanje, u trenutku bijeljenje, a svaki od 1 min, 2 min, 3 ili 4 min min nakon izbjeljivanja. Rezultati pokazuju da je u Cx43 koje eksprimiraju grupu, intracelularni intenzitet fluorescencije izbijeljene mesothelial stanice brzo smanjila nakon izbjeljivanja. Intenzitet fluorescencije postupno oporavila nakon dye prolaz kroz pukotinskim spojevima sa susjednim neizbijeljen stanica raka želuca, a srednja brzina fluorescencija ponovno na 4 min bio je 35,6 ± 0,9% i 39,4 ± 0,8% nakon blenching u BGC-823 i SGC-7901 stanice, odnosno, što je znatno veći nego u Cx43T154A i prazan vetor skupini (p < 0,05). (Slika 3, Tablica 3)
Grupa
Srednje stopa fluorescencija oporavak (%, x pregled ± e ) (t=4min)
BGC-823Cx4335.6±0.9*BGC-823Cx43T154A12.1±0.6BGC-823v13.4±0.7SGC-7901Cx4339.4±0.8†SGC-7901Cx43T154A15.3±0.4SGC-7901v14.7±0.6Table 3. Usporedba stope povrata srednja fluorescencije nakon izbjeljivanja u BGC-823 i SGC-7901 želučanih stanica raka (intenziteta fluorescencije, X pregled ± a)
CSV Preuzmite CSV

3.6. Morfološka procjena tumorske stanice dijapedezom pregled

Utvrdili smo se in vitro
sustav za sliku u transmesothelial migraciju želučanih stanica raka istražiti mehanizam i način dijapedezom. Ovim testom oponaša aspekte stijenke krvnih žila i prije je korišten za analizu leukocita dijapedezom [11]. Dil obilježeni tumorske stanice su na osnovi njihove morfologije i položaj s obzirom na mezotelijumu. Definirali smo tri različite faze migracije pomoću konfokalne mikroskopije: zaobljeni (slika 4a); migracije (slika 4E); a ispod (Slika 4I). Tumorske stanice na vrhu mesothelium prije dijapedezom izložena okrugli ili ovular oblik, a taj oblik se održava od apikalni (slika 4b) na donju površinu (slika 4c, D). Migraciju tumorskih stanica koje prolaze između susjednih mesothelial stanica mijenjati oblik iz ovular do dugo vreteno s unutarstanični F-aktin kao sastavni aktina žarnom niti snopove (Slika 4f, G, H). Tumorske stanice koji su završili dijapedezom se nalazi u potpunosti ispod mezotelijumu. Oblik stanica postupno mijenja od duge osovine na zaobljeniji oblik i unutarstanični F-aktin vlakna postupno proširena te su rijetko raspoređeni između vlakana (slika 4J, K, L). Naša je studija otkrila da dijapedezom želučane stanice raka 'dogodio preko paracellular ruti pregled

3.7. Cx43 posredovane GJIC pojačan želučane stanice raka dijapedezom pregled

co-kulturan Mi Cx43-, Cx43T154A-izražavanje raka gasric stanice i CBX prethodno tretirane Cx43-izražavanje stanice s mesothelial stanica za 1, 4 i 7 sati usporediti svoju dijapedezom učinkovitost [1,2]. Te stanice su postignuto korištenjem opisane kriterije za premještanje. Postotak migriraju Cx43T154A i CBX prethodno primili stanice nisu bile značajno razlikuje od praznih vektor grupe stanica nakon 7 sati u ko-kulturi (p > 0,05), ali je dijapedezom učinkovitost Cx43-stanica koje eksprimiraju skupina bila je značajno viša od ostalih triju skupina (p <0,05) (Slika 5). Ovi rezultati ukazuju da je prisutnost Cx43 proteina u samo tumorske stanice ne odgovara za promatrane povećanje dijapedezom, ali to heterocellular GJIC između tumorskih stanica i mezotelnih stanica je potreban za povećanje učinkovitosti dijapedezom za želuca stanica raka. Ovi rezultati sugeriraju da Cx43 olakšava GJIC ovisnu o tumorskih stanica dijapedezom. Pregled

Rasprava pregled

Gap čvorišta i koneksini podjedinice su regulirani u različitim oblicima raka [4,13,1,4]. No, nedavna izvješća ukazuju da je ekspresija connexins 'nije uvijek održava na manje vrijednosti za vrijeme progresije tumora; s druge strane, oni mogu biti prisutni u kasnijim fazama karcinogeneze, povećanje migracijsku sposobnost invazivnih stanica [2,15-11,7]. Ovo ponovno pojavljivanje connexins jasno uočeno tijekom napredovanja raku dojke, gdje Cx26- i Cx43-negativnim primarnih tumora razvijen Cx26- i Cx43 pozitivne metastaze u limfnim čvorovima [18,1,9]. Slični rezultati dobiveni su u mišjim kože karcinogenezi; Cx26 izraz je smanjen tijekom ranih faza karcinogeneze, ali je obnovljena u metastatskih limfnih čvorova [20]. Ove studije upućuju da connexins imati različite uloge u procesu karcinogeneze. Naše istraživanje je prvi put ispitati ekspresiju Cx43 u različitim fazama želučanog raka progresije (primarna želučanog tkiva raka, odljuštenim stanica želuca intra-abdominalni raka i uskladiti metastatskih peritonealna tkiva). Rezultati pokazuju značajno smanjenje u Cx43 ekspresiju u primarnim želučanom tkivu raka u odnosu na susjedne normalnim želučanog tkiva (p < 0.05). Za razliku od toga, Cx43 izraz u intraabdominalni odljuštenim želučanih stanica raka i metastatskih peritonealnom tkivima znatno je povećana. Ovi rezultati ukazuju na to da Cx43 najvjerojatnije igra važnu ulogu u peritonealnoj metastaza. Pregled

Kako bi istražili da li Cx43 izraz ima utjecaj na peritonealnoj metastaza, Cx43 bilo je ubačeno u BGC-823 i SGC-7901 želučanih stanica raka, a A Cx43T154A stranica je mutacija kako bi se utvrdilo ulogu jaz spojnog komunikacije u procesu peritonealnoj metastaze. Adhezija i dijapedezom tumorskih stanica do staničnih monoslojeva mesothelial dva kritični koraci za formiranje peritoneal metastaza. In vitro ispitivanje pregled stanična adhezija je otkrio da Cx43- i Cx43T154A-izražavanje BGC-823 i SGC-7901 stanice pokazivale su učinkovitije prianjanje na mesothelial staničnom sloju od praznih vektora stanice i da je učinkovitost prianjanje Cx43T154A-izražavanje tumorske stanice bio je sličan Cx43-ekspresijskih stanica. Ovi rezultati sugeriraju da Cx43 potiče adheziju želuca stanice raka mezotelnih stanica, koja je neovisna o jaz spojne komunikaciju. S obzirom na, u vezi mehanizma, naša ranija istraživanja su pokazala da Cx43 mogu komunicirati s staničnih proteina adhezije povezane, kao što su E-kadherina, sudjeluje u procesu adhezije [21], koji može predložiti pozitivnu ulogu Cx43 izražavanja u porastu stanične adhezije. pregled

dijapedezom želučanih stanica raka kroz mesothelial staničnom sloju in vitro
je dodatno istražiti u našim eksperimentima. Rezultati istraživanja pokazali su da je dijapedezom od Cx43 koje eksprimiraju želučanih stanica značajno je poboljšana u usporedbi s Cx43T154A-ekspresijskih stanica, sugerirajući da ekspresija Cx43 utjecati staničnu pokretljivost, što je u skladu s prethodnim izvještajima nekoliko [2, 14, 22 i 23]. Međutim, ostaje da se razjasni da li Cx43 ekspresija je povezana s međustanične komunikacije. Zatim smo istražiti je li GJIC igra ključnu ulogu u dijapedezom. Prvo, ispitali smo GJIC između želuca stanica raka i peritonealnim mezotelnih stanica. Rezultati su pokazali da Cx43-izražavanje želučane stanice raka uspostavila učinkovit heterotypic GJIC s peritonealnom mesothelial stanica; Međutim, Cx43T154A-stanica na propustio utvrditi GJIC, jer se smatralo prije [10]. pregled

Cx43- i Cx43T154A-izražavanje želučane stanice su dodani mesothelial staničnim kulturama i ko-kultivirane preko noći (ne duže od 12 sati ) dodatno potvrđuje ulogu GJIC u transmigracije želučanih stanica raka kroz peritonealnim mesothelial staničnom sloju. Rak želuca stanica dijapedezom je ispitan pomoću konfokalnog laserskog skenirajućeg mikroskopa. Naši rezultati su otkrili da Cx43-izražavanje želučane stanice raka izlagao učinkovitije migracije kroz mesothelial staničnom sloju od Cx43T154A i prazne vektor grupe stanica, dok je dijapedezom učinkovitost tumorskih stanica u tih skupina nije bila značajno različita, što ukazuje da je heterocellular GJIC između tumora i mesothelial stanica je potrebno kako bi se poboljšala dijapedezom. Da bismo razumjeli ključnu ulogu GJIC u dijapedezom želučanih stanica raka kroz mesothelial slojeva stanica, gledali smo na prethodne studije koje su opisali mehanizama uključenih u dijapedezom tumorskih stanica kroz endotelne staničnih slojeva. Ove studije su pokazali da tumorske stanice mogu slati signale na endotel, kao što je inozitol trifosfat (IP3), preko pukotinskim spojevima regulirati unutarstanične razine kalcija. Povišene razine intracelularnog kalcija prolazno fosforiliraju miozina lakog lanca za povećanje propusnosti endotela. Endotelne stanice također može slati signale na tumorske stanice preko pukotinskim spojevima u povećanju proteine ​​stanične pokretljivosti, kao što su Rho GTPaze, protein kinaze C, te fosfoinozitid-3-kinaze [24-22,7]. Ovi rezultati mogu pomoći u rasvjetljavanju mehanizma kako GJIC igra ključnu ulogu tijekom dijapedezom želučanih stanica raka. Pregled

S obzirom na rezultate ovog istraživanja i nedavnim nalazima, predlažemo da Cx43-om gap čvorišta igraju aktivna uloga u peritonealnoj metastaza želučanih stanica raka. Naši rezultati podupiru hipotezu da heterocellular praznina spojnog spojke između želuca stanica raka i Mesothelium regulira transmigracijom želučanih stanica raka do peritonealne mesothelial staničnom sloju. Seoba želučane stanice raka 'kroz mesothelial barijeru dogodila preko paracellular migracije.

• PloS Genetics: Onkogeni stazu Kombinacije predvidjeti kliničkom prognozom u želučanom Cancer
• PLoS ONE: Tumor Sadržaj Chart-Assisted HER2 /CEP17 Digitalni PCR analiza raka želuca biopsija Specimens