PLoS ONE: Aberrant išraiška Cx43 yra susijęs su pilvaplėvės metastazių skrandžio vėžio ir Cx43 tarpininkaujant Gap Junction Pagerina Skrandžio vėžio ląstelių Diapedesis nuo peritoninės Mesothelium

Anotacija

ir pilvaplėvės metastazių procesas apima vidaus diapedesis -abdominal akytasis skrandžio vėžio ląsteles per mesothelial ląstelių monosluoksnių; Tačiau susiję molekulinius mechanizmus šiam procesui vis dar neaišku. Heterocellular atotrūkis-junctional tarpląstelinės komunikacijos (GJIC) tarp skrandžio vėžio ląsteles ir mesothelial ląstelių gali vaidinti aktyvų vaidmenį diapedesis metu. Šiame tyrime nustatėme, kad Connexin 43 (Cx43) pradinėse skrandžio vėžio audiniuose, pilvo akytasis vėžinių ląstelių ir suderintų metastazavusiu pilvaplėvės audinių išraiška. Mes nustatėme, kad Cx43 išraiška pirminės skrandžio vėžio audiniuose buvo gerokai sumažėjo; kad pilvo ertmės akytasis vėžinės ląstelės ir suderinti metastaziniai pilvaplėvės audiniai eksponuojami didėja raišką palyginti su pirminių skrandžio vėžio audiniuose. BGC-823 ir Tarybos generalinis sekretoriatas-7901 žmogaus skrandžio vėžio ląstelės buvo inžinerijos išreikšti Cx43 ar Cx43T154A (A mutantas baltymų, kad tik poros tarpas sankryžų, bet nesuteikia tarpląstelinį ryšį) ir buvo bendrai kultūringas žmogaus pilvaplėvės mesothelial ląstelių (HPMCs). Tirtos Heterocellular GJIC ir diapedesis per HPMC monosluoksnių apie Matrigel dengtos coverslips. Mes nustatėme, kad BGC-823 ir Tarybos generalinis sekretoriatas-7901 skrandžio vėžio ląstelės išreiškiantys Cx43 susiformavo funkciniai heterocellular atotrūkis sankryžas su HPMC monosluoksnių per vieną valandą. Reikšmingas padidėjimas diapedesis buvo pastebėtas inžinerijos Cx43 ekspresija ląstelių, lyginant su Cx43T154A ir kontrolinės grupės ląstelių, kurios teigė, kad pastebėtas ląstelę diapedesis į Cx43 ekspresija ląstelių reikalingas heterocellular GJIC. Daugiau tyrimas parodė, kad skrandžio vėžio ląstelės transmigrated per tarpląstelinėje erdvėje tarp mesothelial ląstelių per paracellular maršrutu. Mūsų rezultatai rodo, kad nenormalus išraiška Cx43 vaidina svarbų vaidmenį peritoninės metastazių ir kad Cx43 tarpininkaujant heterocellular GJIC tarp skrandžio vėžio ląsteles ir mesothelial ląstelių gali būti svarbus reguliavimo žingsnis metastazių metu. Galiausiai, mes nustatėme, kad akytasis skrandžio vėžio ląstelių diapedesis per mesothelial kliūčių yra perspektyvi būdas paracellular migracijos

nurodomoji dalis:. Tango B Peng Zh, J. PW, J. G Qian F Zeng Dz et Al. (2013) Aberrant išraiška Cx43 yra susijęs su pilvaplėvės metastazių skrandžio vėžio ir Cx43 tarpininkaujant Gap Junction Pagerina skrandžio vėžio ląstelių Diapedesis iš peritoninės mesothelium. PLoS ONE 8 (9): e74527. Doi: 10,1371 /journal.pone.0074527

redaktorius: Johanna M Brandner universiteto ligoninės Hamburgas-Eppendorf, Vokietija

Įstojo: sausio 19, 2013; Priimtas rugpjūčio 6, 2013 m Paskelbta rugsėjo 11, 2013

Visos teisės saugomos: © 2013 Tango et al., Tai atviros prieigos straipsnis platinama pagal Creative Commons Attribution licencija, kuri leidžia nevaržomai naudotis, paskirstymo ir dauginimąsi bet kokioje laikmenoje sąlygomis, su sąlyga, kad pirmasis autorius ir šaltinis įskaitomos

Finansavimas:. Šis darbas parėmė dotacijos kodas 30801097 ir Nr 81272366 iš nacionalinio Gamtos mokslo fondo Kinijos. Į finansuotojai neturėjo vaidmenį studijų dizainas, duomenų rinkimo ir analizės, sprendimų skelbti, ar ruošiant rankraštį

konkuruojančių interesų.. Autoriai pareiškė, kad nėra konkuruojantys interesai egzistuoja

Įvadas

skrandžio vėžio atvejų mažėja, tačiau išlieka pagrindinė priežastis, dėl vėžio susijusių mirčių visame pasaulyje. Dominuojantys funkcijos skrandžio vėžio ląstelių įtraukti jų invazinės ir metastazavusiu pajėgumus. Pilvaplėvės metastazės yra kritinė funkcija naviko progresavimo išplitusiu skrandžio vėžiu, [1]. peritoninės metastazių metu, skrandžio vėžio ląstelės sąveikauja intercellularly su keliais tipų ląstelių, o iš pilvo akytasis skrandžio vėžio ląsteles ir pilvaplėvės mesothelial ląstelių sąveika yra ypač svarbūs. Kaip nuolat žmogaus peritoninės mesothelial ląstelių (HPMC) monosluoksniai veikti kaip barjeras nuo pilvaplėvės metastazių, kai akytasis skrandžio vėžio ląstelių diapedesis per mesothelial ląstelių monosluoksnių atsitinka, gausus kraujo pritekėjimas į matricos apačioje mesothelium siūlys patogią aplinką metastazavusiu skrandžio vėžinės ląstelės ir skatinti jų kolonizaciją. Todėl diapedesis akytasis skrandžio vėžio ląsteles per mesothelial ląstelių monosluoksnio yra esminis žingsnis per pilvaplėvės metastazių. Tarp šių ląstelių sąveika lydi tarpląstelinės komunikacijos (IC), kuri yra daugiausia medijuojamų ląstelių-ląstelių trūkumo sankryžose [2]. Tarpo mazgai yra suformuotas plazminės membranos connexins, iš kurių kiekvienas yra sudarytas iš šešių connexins (CXS) [3]. Iki šiol, 20 skirtingų Connexin izoformų buvo žmogaus organizme nenustatyta. Cx43 yra bendras izoforma išreikštas daugelyje epitelinio audinio. Ankstesni tyrimai [4-6] nurodė, kad Cx43 išraiška sumažėjo Tumorigenesis metu, todėl buvo klasifikuojama kaip naviko slopintuvas. Tačiau yra vis daugiau įrodymų, kad connexins gali būti įtraukti į intravasation ir kraujo išsiliejimo vėžinių ląstelių ir vaidinti teigiamą vaidmenį metastazių [7,8] procese. Ar Cx43 tarpininkaujant atotrūkis sankryžos vaidina svarbų vaidmenį diapedesis skrandžio vėžio ląsteles per pilvaplėvės mesothelial barjeras lieka neaiškus. Spręsti hipotezę mes išnagrinėjo Cx43 išraišką pradinėse skrandžio vėžio audiniuose, akytasis skrandžio vėžio ląsteles, ir pilvaplėvės neišplitusios audinius. Mes sukonstravo Cx43 ekspresija vektorių ir Cx43T154A svetainės mutacijos vektorių. Tada mes naudojome dvi žmogaus skrandžio vėžio ląstelių linijas (BGC-823 ir Tarybos generalinis sekretoriatas-7901), kuris yra GJIC netobuli ir neišreiškia jokių žinomų connexins [9]. Kadangi mesothelial ląstelės gausiai išreikšti Cx43, mes inžinerijos skrandžio vėžio ląsteles išreikšti arba laukinio tipo Cx43 ar konkrečios svetainės mutantas nustatyti, ar skrandžio vėžio ląstelėse diapedesis per mesothelium potencialas būtų pakeisti pagal abu arba bet kurį iš šių sąlygų. Šiame tyrime mes parodome, kad Cx43 išraiška upregulates naviko ląstelių diapedesis per GJIC priklausomas mechanizmo

Medžiagos ir metodai

2.1. Reagentai ir Antikūnai

Anti-Connexin 43 polikloniniq antikūnas (Zymed, San Diego, CA, USA), Matrigel ( "Becton-Dikensono, Bedford, MA, JAV), 1, 1'-diocta-decilo-3, 3, 3 ', 3'-tetramethylindocarbocyanine percholate (Dil; Molekulinė zondai, Eugenijus, OR, JAV), chalceino-AM (Dojindo, Kumamoto, Japonija) ir FITC konjuguoto faloidinas buvo įsigytas iš Sigma (Sigma-Aldrich, St Louis, MO, JAV).

2.2 : Audinių mėginiai ir citologinis tyrimas

Visi dalyviai raštu pateikė pranešto sutikimo (iš jų globėjai kur būtina). Šis tyrimas buvo atliktas laikantis Helsinkio ir jos pakeitimus deklaracijoje principų ir buvo patvirtintas etikos komisijos Pietvakarių ligoninėje, trečioji Karo medicinos universitete. Tyrimas gyventojai sudarė 42 pacientų, kuriems buvo laikomas IV stadijos pagal septintą leidimas UICC TNM klasifikaciją piktybinių navikų. Clinicopathologic kintamieji yra išvardyti 1 lentelėje Visi pacientams, dalyvavusiems mūsų tyrime buvo atlikta paliatyviosios arba tiriamąją operaciją. Pirminis navikas ir metastazavusiu pilvaplėvės audiniai buvo surinkta iki operacijos pabaigos, o akytasis skrandžio vėžio ląstelės buvo surinktos pagal ascitu arba peritoninės lavažo skysčio centrifuguojant (jei neegzistuotų ascitas). Branduolį ląstelių sluoksnis buvo išteptas ant stiklelio ir tamsintas hematoksilinu ir eozinu (HE). Du patyrę cytopathologists atliko citologinis vertinimus. CEA buvo naudojamas kaip biologinis žymuo, siekiant padėti nustatyti adenokarcinomos ląstelių imr.rnofluorescencija su priverstinio dažymo. Bylos buvo pašalintas iš šio tyrimo, kai abi cytopathologists išvados nebuvo susitarusi
GROUP UAB Taškų
procentai (%)
Lytis male2764.0 female1536.0Age (metais). ≪ 501740,4 ≥502559.6Tumor vietą Antral2150.0 Body1228.6 Fundic911.4Pathological tipas Na differentiated24.7 Vidutiniškai differentiated49.5 Prastai differentiated3685.8Bormann rašyti I00 II12.4 III1228.5 IV2969.1Ascites Yes1535.7 No2764.3Surgical požiūris paliatyviosios gastrectomy2457.1 tiriamąją + biopsy1842.9Table 1. Klinikiniai ir patologiniai bruožai 42 atvejų pacientams, sergantiems skrandžio vėžiu
CSV Parsisiųsti CSV

2.3. imunohistocheminis

Parafinas audinio mėginiai pirminių auglių ir metastazių pilvaplėvės audiniuose buvo serijiniu suskirstyta , ir jis Dažymo patvirtino skrandžio vėžio buvimą. Iš eilės skyriai buvo deparaffinized, dehidratuoti, ir veikiamas antigeno paieškos iš eilės. Skyriai buvo inkubuojamos su triušio polikloninio anti-Cx43 antikūno 24 valandas, esant 4 ° C temperatūroje. Įrišimo vietos buvo ryškinamos 3, 3'-diamino-Benzidino (DAB) A 5 min reakcijos. Skyriai buvo counterstained su Mayer hematoksilinu, dehidratuoti, išvalytas ir sumontuoti. Praleidimas pirminio antikūno buvo naudojamas kaip neigiama kontrolė. Imunohistocheminį dažymo buvo įvertintas priskiriant rezultatą remiantis mastą ir intensyvumą reaktyvumas. Dažymo mastas buvo įvertintas semiquantitatively į citoplazmą ir membranos kaip neigiamas (0, < 5% ląstelės tamsintas), teigiamų 1 + (6-25% ląsteles tamsintas), teigiamų 2 + (26-50% ląstelių tamsintas) arba teigiamą 3 + ( > nudažomi 50% ląstelės). Dažymo intensyvumas buvo įmuštas kaip 0 (dažymo), 1 (silpnas dažymo, geltonos rudos spalvos), 2 (vidutinio dažymo, geltonos rudos spalvos) arba 3 (stiprus dažymo, rudos spalvos). . Imunodažymu rezultatai gavo kaip, kiek ir intensyvumo reaktyvumas suma, atsižvelgiant rezultatas ≥3 teigiamas ir balas "< 3 neigiamas

2.4: IMUNOFLUORESCENCIJOS

Cx43 išraiška pilvo akytasis skrandžio vėžio ląstelės buvo įvertintas naudojant iMUNOFLUORESCENCIJOS. Keturiasdešimt du atvejai buvo įtraukti į mūsų studiją. Į išteptas ant stiklo coverslips ląstelės buvo fiksuojamas 4% paraformaldehido ir nuplauti PBS su 0,5% KPP (skalavimo buferį). Po to ląstelės buvo inkubuojamos 24 valandas, esant 4 ° C su anti-Cx43 antikūno (1: 150). Kad coverslips buvo plaunamos ir inkubuojami su FITC konjuguoto ožkos anti-triušio antrinio antikūno. Branduolys buvo dažomi 10 mikrogramai /ml DAPI (Sigma-Aldrich, St Louis, MO, JAV). Į coverslips buvo nufotografuota naudojant fluorescencijos mikroskopijos (Siemens, Vokietija). Kontrolė (pirminiai antikūnai buvo pakeisti PBS) buvo neigiami visų eksperimentų (duomenys nerodomas)

2,5. Ląstelių kultūrų ir stabilus išraiška Cx43 ir Cx43 mutantų

Nonmalignant žmogaus įamžinta mesothelial ląstelių , Met-5A, buvo gauti iš ATCC. Šios ląstelės buvo prižiūrimi ir padauginti terpė 199, kuriame yra 1,5 g /l natrio hidrokarbonato, 10% vaisiaus jaučio serumo, 3.3 mM epidermio augimo faktoriaus (EGF), 400 Nm hidrokortizono, 870 mM cinko neapimta galvijų insuliną, 20 mM HEPES ir 3.87 g /L selenu (H2SeO3).

žmogaus skrandžio adenokarcinoma ląstelių linijos BGC-823 ir SGC-7901 buvo gauti iš Šanchajus instituto ląstelių banko, Kinijos mokslų akademijos. Cx43- ir Cx43T154A-išreiškiantys vektoriai buvo sukurta naudojant lentiviruso infekcija. PTA2-Cx43, kuris apėmė žmogaus Cx43-koduojančią seką, buvo pastatytas mūsų laboratorijoje. Cx43T154A svetainė mutacija vektorius statyba buvo atlikta naudojant Perdangos prailginimo PGR, kuris užkoduotas baltymą, kuris veikė kaip atotrūkis sankryžos be IC kaip aprašyta anksčiau [10]. Iš Cx43 ir Cx43T154A kDNR buvo įterptas į Lenti-GFP vektoriaus ir transfekuota į 293T Supakuojanti ląstelių linija. Lentiviruso supernatantas buvo surinkta po to, kai 48 h, filtruojamas per 0,45-mikronų filtrą ir naudojama užkrėsti bgc-823 ir SGC-7901 ląsteles. Vidutinės buvo pakeistas su RPMI1640 24 valandas po infekcijos, ir ląstelės buvo kultivuojamos reguliariai. Daugiau nei 90% vėžinių ląstelių išreikštų Cx43 ar Cx43T154A po trijų raundų virusinės infekcijos; Sėkmingai infekuotų ląstelių buvo renkami tėkmės citometrijos

2.6. Baltymai gavybos ir Vakarų dėmė analizė

inžinerijos Cx43- ir Cx43T154A ekspresija BGC-823 ir Tarybos generalinis sekretoriatas-7901 skrandžio vėžio ląstelės buvo lizuoti , Baltymų (50 mikrogramų) iš kiekvienos ląstelių rūšį buvo atskirtos viena nuo 12% SDS-poliakrilamido gelio ir perkelti ant nitroceliuliozės membranos. Nitroceliuliozinių membranos buvo blokuotos 5% Nonfat sauso pieno ir tada buvo zonduotos į Cx43 baltymų naudojant polikloninio anti-Cx43 antikūną (1: 500). Immunoblots buvo tyrinėjo su atitinkamais krienų peroksidazės konjuguoto antrinių antikūnų (Sigma-Aldrich, St Louis, Misūrio valstija, JAV), esant 1: 10.000 praskiedimo. Baltymai buvo ryškinamos naudojant Supersignal Vakarų Piko cheminės liuminescencijos substrato (Pierce Chemical Co) ir immunoblots buvo veikiami Amersham Hyperfilm (Amersham biomokslų, Piscataway, NJ, USA) 30 s

2.7. Auglio ląstelių /mesothelial Mobilaus ryšio Sukibimas Analizės

mesothelial ląstelės buvo auginamos iki vienasluoksnę santakoje ant stiklo coverslips 24-duobučių lėkštelėse. Genetiškai modifikuotas Cx43- ir Cx43T154A išreiškiančias, iš skrandžio vėžio ląstelės buvo vadinamos su 10 mikrogramų /ml Dil tirpalui 15 min 37 ° C temperatūroje. Dil yra dažniausiai naudojamas fluorescencinis zondas, kuris rodo oranžiniai raudona fluorescencija membranose ir buvo naudojamas mūsų tyrime ženklinti skrandžio vėžio ląsteles. Šie paženklinti ląstelės tada buvo pridėta į mesothelial ląstelių monosluoksnių ir inkubuojami 1 h 37 ° C temperatūroje. Nonadherent ląstelės buvo pašalintas plovimo ir ląstelės buvo prisijungusios prie mesothelial ląstelių monosluoksnių fiksuota 4% paraformaldehido. Kultūriniai skaidres buvo montuojamas Mowiol (CalBiochem) ir tiriama naudojant fluorescencijos mikroskopijos ( "Leica" MPS "60)

2.8. Auglio ląstelių /mesothelial Mobilusis GJIC tyrimas

inžinerijos Cx43- ir Cx43T154A ekspresija BGC-823 ir Tarybos generalinis sekretoriatas-7901 skrandžio vėžio ląstelės buvo paženklinti 15 minučių 37 ° C temperatūroje su 2 ml Opti-MEM, kurių sudėtyje yra 10 mikrogramai /ml chalceino-am ir 10 mikrogramų /ml, Dil. Chalceino-AM yra fluorescencinė substratas, kuris yra suskaldyti į gyvybingų ląstelių membranos nelaidžios forma, kuri gali perduoti per funkcinių atotrūkis sankryžų, bet ne kitų plazminės membranos kanalų. Mesothelial ląstelių monomolekuliniuose sluoksniuose buvo išvalytos 4 h su 150μM karbenoksolonas (cbx) blokuoti Homotypic GJIC ir tada buvo gydomi 15 minučių, 10 mikrogramų /ml, chalceino-AM (molekulinė tūtos) į Opti-MEM tirpalu. Gerai paruošti paženklinti skrandžio vėžio ląstelės buvo įtraukta į Met-5A monosluoksnių dėl Matrigel ir buvo aptikta heterotipiniu GJIC tarp skrandžio vėžio ląsteles ir mesothelial ląsteles. Fluorescencinis atsigavimas balinti ląstelių įvyks tik tada, jei dažų eina per spragą sankryžų gretimi nebalintus skrandžio vėžio ląsteles. Individualūs mesothelial ląstelės greta skrandžio vėžio ląstelių buvo balinti maždaug 30 s naudojant Zeiss lazerio skenavimo mikroskopas ir argono lazerio 33% galios kiekvienam eksperimento sąlygomis. Vienviečiai mesothelial ląstelių, kurios negalėjo nustatyti GJIC buvo pasirinkta atlikti mrugnięcia akimi kaip kontrolės. Neapdorotas ląstelės buvo naudojamas kaip fono pakeisti ląstelių. Vidutinė fluorescencijos intensyvumas iš balintų /nebalintus ląstelių buvo matuojamas laikui bėgant naudojant Scion vaizdavimo programinę įrangą, o fluorescencijos panaudojimo norma buvo apskaičiuota kaip gerai (Kt = (IB-Ib0) /Iu × 100%, Kt: fluorescencija išieškojimo rodiklis metu t; ib: fluorescencijos intensyvumas balintos ląstelės metu t; Ib0: fluorescencijos intensyvumas balintos ląstelių laiko momentu t = 0; Iu:. fluorescencijos intensyvumas gretimame nebalintų pirminių ląstelių per laiką t) [11]

2,9: Transmesothelial migracijos tyrimas

transmesothelial migracijos tyrimas buvo atliktas, kaip aprašyta anksčiau [12]. Trumpai tariant, 1 × 10 ^{5 MET-5A mesothelial ląstelės buvo pasėjamos į 12-mm stiklo coverslips, kurios buvo padengtos Matrigel (Becton-DICKENSON, JAV). Monosluoksnių pasiekė santakoje kaip nustatoma naudojant šviesos mikroskopu. Coverslips buvo perkeltas į 24 šulinėlių plokštelės ir buvo auginamos 48 h visuotinio akcininkų susirinkimo. Skrandžio vėžio ląstelės buvo padalytą iš tuščio vektorių grupės, Cx43 ekspresija grupė, Cx43T154A ekspresija grupės ir cbx gydytiems grupės (Cx43-išreiškiantys skrandžio vėžio ląstelės buvo išvalytos 4 h su 150μM karbenoksolonas (cbx) blokuoti Homotypic GJIC) ir paženklinti Dil , Maždaug 1 × 10 buvo pridėta 5 ląstelės mesothelial ląstelių monosluoksnius santykiu 1:10 (naviko ląstelių: mesothelial ląstelių). Ląstelės buvo bendrai kultivuojamos skirtingu laiku (1, 4, arba 7 h) išankstinis gyventi stebėti ar fiksavimo ir imunodažymu. Apakinti tyrėjai kiekybiškai diapedesis naudojant LSM, kaip aprašyta anksčiau [7]. Trumpai tariant, bendradarbiai kultūros buvo fiksuotas ir tamsintas už F-aktino. Diapedesis buvo įvertintas kaip naviko ląstelių, kad buvo sąlytyje su mesothelium skaičius ir suskirstyti į tris etapus atsižvelgiant į jų padėtį, palyginti su mesothelium: 1), suapvalinus - navikines ląsteles sferinės formos dėl viršūnės paviršiaus mesothelium; 2) migravimas - naviko ląstelės persunkęs per mesothelial ląstelių monosluoksnius mesothelial ląstelių sankryžų su ląstelių kūno dalį virš mesothelium ir ląstelės kūno plitimo dėl Matrigel po mesothelial ląstelių, F-aktino streso pluoštų dalį; ir 3) po - visas naviko ląstelės kūnas buvo mažesnis už mesothelial ląstelių streso pluoštų plokštumoje. Perėjimas o apačioje ląstelės buvo klasifikuojama kaip transmigrating. Maždaug 100 mesothelium-prilipusios ląstelės buvo registruojami ir skaičiuojami už dengiamąja, ir visi bandymai buvo kartojamas tris kartus su trijų dalių coverslips}

2,10. Statistinė analizė

Visos statistinė analizė atlikta naudojant SPSS programinę įrangą ( versija 13.0). Tikimybės P < 0,05 buvo laikomas statistiškai reikšmingas

Rezultatai

3.1. Cx43 išraiška pirminių navikų ir suderintų metastazavusiu pilvaplėvės audinių

keturiasdešimt du normalus epitelyje (100%), išreiškiamas Cx43 su tipiškas membraninis ir citoplazmos dažymo (1A pav.) Vienuolikos 42 pirminių navikų (26,2%) buvo teigiamas Cx43, kuri buvo žymiai sumažėjo, palyginti su gretimuose normaliuose epitelyje (p < 0,05). Cx43 išraiška buvo nevienalytė įvairių audinių pavyzdžių: gerai diferencijuotų skrandžio vėžio audiniuose, Cx43 išraiška parodė didelį mišri (citoplazmos ir membraninis) dažymo (1b paveikslas); vidutiniškai diferencijuotos skrandžio vėžio audiniai turėjo tik citoplazmos Cx43 išraišką (1c paveikslas); ir Cx43 buvo vos išreikšta blogai diferencijuotų skrandžio vėžio audiniuose (1d pav). Priešingai, Cx43 išraiška buvo gerokai padidėjo 29 iš 42 metastazavusiu pilvaplėvės audinių (69,0%) ir eksponuojami tipiškas citoplazmos ir membraninis dažymo (p < 0,05). (1E paveikslas) (2 lentelė)
Connexin 43
Pirminis skrandžio vėžio (bylos) (%)
gretimuose normaliuose audiniuose (atvejų) (%)
metastazavęs pilvaplėvės audinių (atvejai) (%)
Neigiamas (rezultatas < 3) 31 (73,8%) 0 (0 ) 13 (31,0%) Teigiamas (score≥3) 11 (26,2%) * 42 (100%) 29 (69,0%) † 2. Stalo imunohistocheminis rezultatai Connexin 43 išraiška pradinėse skrandžio vėžio audiniuose, šalia įprastų skrandžio audinių ir pilvaplėvės . metastaziniai audiniai (N = 42)
* Lyginant su gretimų normaliuose audiniuose, iš Connexin 43 išraiška žymiai sumažėjo (p < 0,05); † Lyginant su pirminių skrandžio vėžio audinių, taip pat iš Connexin 43 išraiška metastazių peritoninės audinio žymiai padidėjo (p < 0,05). CSV Atsisiųsti CSV

3.2: Cx43 išraišką pilvo akytasis skrandžio vėžio ląstelių

Daugelis pilvo ertmės akytasis skrandžio vėžio ląstelės egzistuoja kaip daugialąsčių sferoidų (1f pav). Teigiamas Cx43 imunodažymu buvo stebimas 35 42 atvejais pilvo akytasis vėžinių ląstelių mišraus citoplazmos ir membraninis dažymo ir teigiamo norma yra 83,3% (1 pav G, H, ir aš).

3.3 : išraiška egzogeninės Cx43 į BGC-823 ir Tarybos generalinis sekretoriatas-7901 skrandžio vėžio ląstelių

skrandžio vėžio ląstelės buvo inžinerijos išreikšti funkcinę Cx43, Cx43T154A ir tuščią lentiviruso vektorių kaip kontrolės ištirti Cx43 išraiškos poveikis biologinės savybės gali iš šių ląstelių. Cx43 išraiška buvo išvykęs į tuščią vektorių grupės, tačiau kitos dvi inžinerijos grupės buvo aptikta išreikšti arba Cx43 ar Cx43T154A (2A pav)

3,4. Sukibimo savybėmis skrandžio vėžio ląsteles mesothelial ląstelių

taip pat buvo tiriamas nuo Cx43 poveikis skrandžio vėžio ląstelių mesothelial ląstelių sukibimą. Inžinerijos skrandžio vėžio ląstelės išreiškiantys arba laukinio tipo Cx43 ar Cx43T154A eksponuojami reikšmingą padidėjimą sukibimo su mesothelial ląsteles, palyginti su tuščiu vektorių grupės (p < 0,05). nebuvo pastebėta jokių reikšmingų skirtumų sukibimo gebėjimas tarp Cx43- ir Cx43T154A ekspresija grupių (P > 0,05), o tai rodo, kad Cx43 skatina skrandžio vėžio ląstelių sukibimą, kuris yra nepriklausomas nuo GJIC (2b pav)

3.5: Inžinerijos. Cx43 ekspresija BGC-823 ir Tarybos generalinis sekretoriatas-7901 ląstelės formuoja funkcinius atotrūkis sandūros kanalus su mesothelial ląstelių monosluoksnių

Mes bendradarbiaujame išauginti inžinerijos Cx43- ir Cx43T154A ekspresija skrandžio vėžio ląsteles mesothelial ląstelių monosluoksnių išnagrinėti Cx43 galimybę -expressing ląsteles formuoti atotrūkis sankryžas ir nustatyti GJIC su mesothelial ląsteles. Rezultatai rodo, kad skrandžio vėžio ląstelės arba tuščią vektorių grupės ar Cx43T154A grupės nenustatė GJIC su gretimų pilvaplėvės mesothelial ląstelių po lazerio balinimas, o Cx43 ekspresija grupė galėjo nustatyti GJIC peritoninės mesothelial ląstelių sėkmingai. Intraląstelinis fluorescencija intensyvumas buvo nustatytas iki balinimui, tuo balinimo akimirksniu, ir arba 1 minutės, 2 minutės, 3 minutės arba 4 minutės po to, kai balinimui. Rezultatai rodo, kad Cx43 ekspresija grupę, ląstelėse fluorescencijos intensyvumas balintos mesothelial ląstelės sparčiai sumažėjo po balinimo. Fluorescencijos intensyvumas palaipsniui atsigavo dėl dažų pereiti per gap sankryžų su gretimomis nebalintus skrandžio vėžio ląsteles, o vidutinis fluorescencijos panaudojimo norma buvo 35,6 ± 0,9% ir 39,4 ± 0,8%, esant 4 min po mrugnięcia akimi į BGC-823 ir Tarybos generalinis sekretoriatas-7901 ląstelių, atitinkamai, kuris buvo gerokai didesnis nei kad Cx43T154A ir tušti vetor grupėje (p < 0,05). (3 pav, 3 lentelė)
GROUP UAB Vidutinis fluorescencija išieškojimo rodiklis (% x
± s ) (t=4min)
BGC-823Cx4335.6±0.9*BGC-823Cx43T154A12.1±0.6BGC-823v13.4±0.7SGC-7901Cx4339.4±0.8†SGC-7901Cx43T154A15.3±0.4SGC-7901v14.7±0.6Table 3. palyginimas vidutinis fluorescencijos regeneravimo laipsnį po balinimo BGC-823 ir Tarybos generalinis sekretoriatas-7901 skrandžio vėžio ląstelių (fluorescencijos intensyvumas X
± s)
CSV Parsisiųsti CSV

3,6. Morfologinis vertinimas naviko ląstelės diapedesis

Mes sukūrėme in vitro
sistemą vaizdas į transmesothelial migracijos skrandžio vėžio ląstelių ištirti mechanizmą ir būdas diapedesis. Šis tyrimas imituoja aspektai indo sienelių ir buvo naudojamas anksčiau analizuoti leukocitų diapedesis [11]. Dil-paženklinti naviko ląstelės pelnė pagal jų morfologiją ir vietos atžvilgiu mesothelium. Mes nustatėme tris etapus migracijos naudojant confocal mikroskopu: suapvalinti (4a paveikslas); migruoja (4E paveikslą); ir po (4I pav.) Naviko ląstelės ant mesothelium prieš diapedesis eksponuojami apvalios arba ovular formą ir ši forma buvo palaikomas nuo viršūninio (4B paveiksle) su baziniu paviršiaus (4c paveikslas, D). Migruojantys naviko ląstelės asocijuotas tarp gretimų mesothelial ląstelių pasikeitė formą iš ovular į ilgą veleno su ląstelėje F-aktino nesurišti į aktino gijų ryšulius (pav 4F, G, H). Naviko ląstelių, kad baigę diapedesis buvo įsikūręs visiškai po mesothelium. Ląstelių formos palaipsniui pasikeitė nuo ilgo veleno prie Universaliojo formos, ir ląstelėje, F-Aktinis gijos palaipsniui išplėstas ir buvo retai išdėstyti tarp gijų (4J pav, K, L). Mūsų tyrimas parodė, kad skrandžio vėžio ląstelėse diapedesis įvyko per paracellular maršrutu

3,7. Cx43 tarpininkaujant GJIC sustiprintas skrandžio vėžio ląstelės diapedesis

Mes bendradarbiaujame kultūringas Cx43-, Cx43T154A ekspresija gasric vėžys ląstelės ir CBX išvalytos Cx43 ekspresija ląsteles mesothelial ląstelių už 1, 4 ir 7 val palyginti savo diapedesis efektyvumą [1,2]. Šios ląstelės buvo pelnyti naudojant aprašytus kriterijus migracija. Migruojančių Cx43T154A ir CBX gydytiems ląsteles procentas buvo reikšmingai skiriasi nuo tuščių vektorius grupės ląstelėse po 7 h nuo bendro kultūros (p > 0,05), tačiau diapedesis efektyvumas Cx43 ekspresija grupės ląstelėse buvo gerokai didesnis nei kitų trijų grupių (p < 0,05) (5 pav). Šie rezultatai rodo, kad Cx43 baltymo vien naviko ląstelių buvimas neatsako už padidėjusį diapedesis, bet heterocellular GJIC tarp vėžinių ląstelių ir mesothelial ląstelių turi padidinti iš diapedesis efektyvumą skrandžio vėžio ląsteles. Šie rezultatai rodo, kad Cx43 palengvina GJIC priklausomas naviko ląstelių diapedesis.

Diskusijos

Gap sankryžos ir Connexin ruožai downregulated įvairių vėžio [4,13,1,4]. Tačiau naujausi pranešimai rodo, kad connexins raiška ne visada išlaikomas lygis sumažėjo per naviko progresavimo; Priešingai, jie gali būti per vėlesniuose etapuose kancerogenezėje, didinti migracijos pajėgumus invazinių ląstelių [2,15-11,7]. Tai pakartotinio atsiradimo connexins yra aiškiai pastebimas žmogaus krūties vėžio progresavimą, kur Cx26- ir Cx43 neigiami pirminius navikus išvystyta Cx26- ir Cx43 teigiamų metastazėms limfmazgiuose [18,1,9]. Panašių rezultatų taip pat buvo gautas pelių odos kancerogenezėje; Cx26 išraiška mažinama ankstyvosiose stadijose kancerogenezėje bet atkuriama metastazių limfmazgiuose [20]. Šie tyrimai leidžia manyti, kad connexins žaisti skirtingus vaidmenis iš kancerogenezėje proceso metu. Mūsų tyrimas pirmą kartą išnagrinėti Cx43 išraišką per skirtingus etapus skrandžio vėžio progresavimo (pirminis navikas audinių, intraabdominalinius akytasis skrandžio vėžio ląsteles ir suderintų metastazavusiu pilvaplėvės audinių). Rezultatai rodo, kad reikšmingai sumažėjo Cx43 išraiškos pradinėse skrandžio vėžio audiniuose, palyginti su gretimų normaliomis skrandžio audinių (p < 0,05). Priešingai, Cx43 išraiška pilvo akytasis skrandžio vėžio ląsteles ir metastazavusiu pilvaplėvės audiniuose buvo žymiai padidėjęs. Šie rezultatai rodo, kad Cx43 greičiausiai vaidina svarbų vaidmenį peritoninės metastazių.

Jei ištirti, ar Cx43 išraiška turi įtakos peritoninės metastazių poveikį, Cx43 buvo pernešta į BGC-823 ir Tarybos generalinis sekretoriatas-7901 skrandžio vėžio ląsteles, o Cx43T154A svetainė mutacija buvo pastatytas siekiant nustatyti atotrūkis junctional komunikacijos vaidmenį peritoninės metastazių procese. Sukibimas ir diapedesis naviko ląstelių į mesothelial ląstelių monosluoksnių yra du kritiniai žingsniai į pilvaplėvės metastazių susidarymą. An in vitro
ląstelių sukibimą tyrimas atskleidė, kad Cx43- ir Cx43T154A ekspresija BGC-823 ir Tarybos generalinis sekretoriatas-7901 ląstelių eksponuojami efektyvesnį sukibimą su mesothelial ląstelių monosluoksnių nei tuščių vektoriaus ląstelių ir kad sukibimas efektyvumas Cx43T154A ekspresija auglio ląstelės buvo panašus į Cx43-ekspresuojančių ląstelių. Šie rezultatai rodo, kad Cx43 skatina skrandžio vėžio ląstelių sukibimą su mesothelial ląsteles, kuris yra nepriklausomas nuo tarpas sandūros komunikacijos. Atsižvelgiant į jos susijusios mechanizmą, mūsų Ankstesnis tyrimas nurodė, kad Cx43 gali sąveikauti su ląstelių adhezijos susijusių baltymų, pavyzdžiui, E-cad, dalyvaujantis sukibimo [21], galintis pasiūlyti teigiamą vaidmenį Cx43 išraiška didėja ląstelių sukibimą.

skrandžio vėžio ląstelių diapedesis per mesothelial ląstelių monosluoksnių in vitro
buvo toliau tiriama mūsų eksperimentams. Mūsų tyrimas parodė, kad Cx43 ekspresija skrandžio ląsteles diapedesis buvo daug didesnis, palyginti su Cx43T154A ekspresija ląstelių, o tai rodo, kad Cx43 išraiška įtakos ląstelių judrumą, kuri buvo suderinta su keliomis ankstesnėmis ataskaitomis [2, 14, 22 ir 23]. Tačiau tai dar reikia išsiaiškinti, ar Cx43 išraiška buvo susijęs su tarpląstelinės komunikacijos. tada mes ištirti, ar GJIC vaidina svarbų vaidmenį diapedesis. Pirma, mes išnagrinėjo tarp skrandžio vėžio ląsteles ir pilvaplėvės mesothelial ląstelių GJIC. Rezultatai parodė, kad Cx43 ekspresija skrandžio vėžio ląsteles įsteigė veiksmingą heterotipiniu GJIC peritoninės mesothelial ląstelių; Tačiau Cx43T154A-išreiškiantys ląstelės nenustatė GJIC, kaip buvo manoma anksčiau [10].

Cx43- ir Cx43T154A ekspresija skrandžio ląstelės buvo įtraukta į mesothelial ląstelių monosluoksnių ir bendro kultūringas per naktį (ne ilgiau nei 12 valandų ) toliau patvirtina GJIC vaidmenį skrandžio vėžio ląstelių transmigraciją per pilvaplėvės mesothelial ląstelių monosluoksnių. Skrandžio vėžio ląstelių diapedesis buvo tiriama naudojant lazerio skanavimo confocal mikroskopu. Mūsų rezultatai parodė, kad Cx43 ekspresija skrandžio vėžio ląsteles eksponuojami efektyvesnį migracijos per mesothelial ląstelių monosluoksnių nei Cx43T154A ir tuščių vektorius grupės ląstelių, o diapedesis efektyvumas vėžinių ląstelių pastarųjų dviejų grupių reikšmingai nesiskyrė, o tai rodo, kad heterocellular GJIC tarp naviko ir mesothelial ląstelės būtina stiprinti diapedesis. Norėdami suprasti esminį GJIC į skrandžio vėžio ląstelių diapedesis per mesothelial ląstelių sluoksnių, mes pažvelgė į ankstesnių tyrimų, kurie nušvietė mechanizmus dalyvaujančių vėžinių ląstelių diapedesis per endotelio ląstelių sluoksnių. Šie tyrimai parodė, kad vėžinių ląstelių gali siųsti signalus į endotelį, pavyzdžiui, inozitolis trifosfato (IP3), per tarpą sankryžų reguliuoti ląstelėje kalcio kiekį. Padidėjęs ląstelėje kalcio laikinai fosforilinti į miozino lengvosios grandinės padidinti endotelio pralaidumas. Endotelio ląstelės taip pat gali siųsti signalus į vėžinių ląstelių per tarpą sankryžų į upregulate ląstelių judrumas baltymų, pavyzdžiui, Rho GTPases, baltymų kinazės C ir phosphoinositide-3 kinazės [24-22,7]. Šie rezultatai gali padėti išsiaiškinti, kaip GJIC vaidina svarbų vaidmenį diapedesis skrandžio vėžio ląstelių metu mechanizmą.

Atsižvelgiant į šio tyrimo ir neseniai išvados rezultatus, mes rekomenduojame, kad Cx43 tarpininkaujant atotrūkis sankryžos vaidina aktyvus vaidmuo pilvaplėvės metastazių skrandžio vėžio ląsteles. Mūsų rezultatai patvirtina hipotezę, kad heterocellular gap-junctional movas tarp skrandžio vėžio ląsteles ir mesothelium reguliuoja skrandžio vėžio ląstelių transmigracija į pilvaplėvės mesothelial ląstelių monosluoksnių. Skrandžio vėžio ląstelių "persikėlimas per mesothelial barjerą įvyko per paracellular migracija.

• PLoS Genetics: onkogeniniam kelią Deriniai Spėkite Clinical prognozė skrandžio vėžio
• PLoS ONE: Naviko turinys diagrama-Assisted HER2 /CEP17 Skaitmeninis PGR analizė skrandžio vėžio biopsijos mėginių