Plos ONE: Aberrant Izražanje Cx43 je povezan s peritonealno metastaze Rak želodca in Cx43-posredovano Gap Junction Izboljša želodca Cancer Cell diapedeze s peritonealno Mesothelium

Povzetek

Proces peritonealne metastaz vključuje diapedeze od znotraj -abdominal listasti želodca rakave celice skozi monosloje na mesothelial celic; Vendar pa s tem povezane molekularni mehanizmi za ta proces še vedno nejasna. Heterocellular vrzel plošcicnih intercelularno komunikacije (GJIC) med želodčne rakavih celic in mesothelial celic lahko igrajo aktivno vlogo pri diapedeze. V tej študiji smo zaznali izražanje connexin 43 (Cx43) v primarnih želodčnih tkivih raka, znotraj trebušne listasti rakavih celic in se ujemajo z metastatskim peritonealno tkiva. Ugotovili smo, da je bil izraz Cx43 v primarnih želodčnih tkivih rakom bistveno zmanjšal; so znotraj trebušne listasti rakave celice in se ujemajo metastatskim peritonealno tkiva razstavljena povečanje izražanja v primerjavi s primarnimi želodčnega tkiva raka. BGC-823 in SGC-7901 človeške želodčne rakave celice so zasnovana tako, da izrazijo Cx43 ali Cx43T154A (mutiran protein, da le parov vrzeli križiščih, vendar ne zagotavlja medcelično komunikacijo) in so co-kultiviramo s človeškimi peritonealno mesothelial celic (HPMCs). Heterocellular GJIC in diapedeze skozi HPMC monosloje on-Matrigel obložene coverslips so raziskovali. Ugotovili smo, da BGC-823 in SGC-7901 raka želodca celice, ki izražajo Cx43 oblikovane funkcionalne heterocellular vmesnih križiščih z HPMC monosloje v eni uri. Ugotovljeno je bilo pomembno povečanje diapedeze v inženirstva Cx43-izražajo celic v primerjavi z Cx43T154A in kontrolna skupina celic, ki kažejo, da je opazovana Povecanje diapedeze v Cx43-izražajo celic potrebna heterocellular GJIC. Nadaljnja študija je pokazala, da je v želodcu rakave celice transmigrated skozi medceličnem prostoru med mesothelial celic preko paracelični poti. Naši rezultati kažejo, da ima nenormalno izraz Cx43 pomembno vlogo v peritonealno metastaze in da Cx43 posredovano heterocellular GJIC med želodčne rakavih celic in mesothelial celic je lahko pomemben regulativni korak v metastaz. Na koncu smo ugotovili, da je diapedeze listasti želodčnih rakavih celic z mesothelial ovir izvedljiva pot paracelični migracije

Navedba. Tang B, Peng Zh, Yu PW, Yu G, Qian F, Zeng Dz, et al. (2013) Aberrant Izražanje Cx43 je povezan s peritonealno metastaze želodca raka in Cx43-posredovano Gap Junction Izboljša Rak želodca Cell diapedeze s peritonealno mesothelium. PLoS ONE 8 (9): e74527. doi: 10,1371 /journal.pone.0074527

Urednik: Johanna M Brandner, University Hospital Hamburg-Eppendorf, Nemčija

Prejeto: 19. januar 2013; Sprejeto: 6. avgust 2013; Objavljeno: 11. september 2013

Copyright: © 2013 Tang et al. To je odprtega dostopa članek razširja pod pogoji Creative Commons Attribution License, ki omogoča neomejeno uporabo, distribucijo in razmnoževanje v katerem koli mediju, pod pogojem, da prvotni avtor in vir knjižijo

Financiranje:. To delo je bila podprta z dodelitvi sredstev št 30801097 in št 81272366 od National Natural Science Foundation Kitajske. Blagajnami imel nobene vloge pri oblikovanju študije, zbiranje in analizo podatkov, sklep, da se objavi, ali pripravi rokopisa

nasprotujočimi si interesi.. Avtorji so izjavili, da ne obstajajo konkurenčni interesi

Uvod

incidenca raka želodca se zmanjšuje, vendar je še vedno glavni vzrok smrti, povezanih z rakom po celem svetu. Prevladujoči značilnosti želodčnih rakavih celic vključujejo tudi invazivne in metastaznih zmogljivosti. Peritonealno metastaze je zelo pomemben element za napredovanje tumorjev pri napredovalim rakom želodca [1]. Med procesom peritonealno metastaze, želodčne rakave celice interakcijo intercellularly več različnih vrst celic, in interakcija znotraj trebušne listasti želodčne rakavih celic in peritonealno mesothelial celic je še posebej pomembno. Kot neprekinjeno prehrano peritonealno mesothelial celice (HPMC) plast deluje kot pregrada proti peritonealno metastaz, ko pride do diapedeze listasti želodčnih rakavih celic z mesothelial monosloje celic, bo bogat dotok krvi v matrici pod mesothelium nudijo prijetno okolje za metastatskega želodca rakave celice in spodbujajo njihovo kolonizacijo. Zato diapedeze od listasti želodčnih rakavih celic skozi celično monosloja mesothelial je pomemben korak v peritonealno metastaz. Interakcija med temi celicami spremlja medcelične komunikacije (IC), ki je pretežno posredovanega z križiščih vrzeli celica-celica [2]. Reže križišča tvorimo z plazemski membranski connexins, od katerih je vsak sestavljata šest connexins (CXS) [3]. Do danes je bilo 20 različnih connexin izooblike pri človeku. Cx43 je splošno izo-oblika izražena v večini epitelijskih celic. Prejšnje študije [4-6] je pokazala, da Cx43 izraz zmanjšala med tumorigeneze in je zato treba uvrstiti kot zaviralnih. Vendar pa je vse več dokazov, da se connexins lahko sodelujejo v intravazacijo in ekstravazacije rakavih celic in pozitivno vlogo v procesu metastaz [7,8]. Ali Cx43 posredovana vrzel junction igra pomembno vlogo pri diapedeze želodca rakavih celic skozi peritonealno mesothelial ovira ostaja nejasna. Za reševanje hipotezo smo preverjali izražanje Cx43 v osnovnih želodca tkiva raka, listasti želodčne rakave celice in peritonealno metastaznih tkiva. Zgradili smo Cx43-izraža vektor in mutacije vektor Cx43T154A stran. Nato smo uporabili dva človeka želodčni rak celičnih linij (BGC-823 in SGC-7901), ki je GJIC pomanjkljivi in ​​ne izražajo z vsemi znanimi connexins [9]. Ker mesothelial celice bogato izražanje Cx43 smo inženirstva želodčne rakave celice izraziti bodisi divjega tipa Cx43 ali site-specific mutant ugotoviti, ali bi potencial diapedeze želodca rakavih celic "skozi mesothelium spremeni v skladu s tako ali katerega izmed teh pogojev. V tej študiji smo pokazali, da Cx43 izraz upregulates tumorskih celic diapedeze preko GJIC odvisni mehanizma

Materiali in metode

2.1:. Reagentov in Protitelesa

Anti-connexin 43 poliklonska protitelesa (Zymed, San Diego, CA, ZDA) Študiie (Becton-Dickenson, Bedford, MA, USA), 1, 1 'diocta-decil-3, 3, 3', 3'-tetramethylindocarbocyanine percholate (Dil; Molecular sonde, Eugene, OR, ZDA), kalcein-AM (Dojindo, Kumamoto, Japonska), in FITC konjugiranih phalloidin so bile kupljene od Sigma (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, ZDA).

2.2 : vzorce tkiva in citološki Pregled

Vsi udeleženci zagotoviti pisna soglasja, (od svojih skrbnikov kjer je to potrebno). Ta študija je bila izvedena v skladu z načeli Helsinško deklaracijo in njegovih sprememb in ga je odobrila etični odbor Southwest bolnišnice, tretje vojaške Medical University. Populacija študije je sestavljalo 42 bolnikov, ki so razvrščene kot stadiju IV v skladu s sedmo izdajo UICC TNM klasifikacije malignih tumorjev. Clinicopathologic spremenljivke so navedene v tabeli 1. Vse bolnikov, vključenih v naši raziskavi je doživel paliativno ali raziskovalno operacijo. Primarni tumor in metastatskih peritonealno tkiva zberemo pred koncem kirurškega posega, in listasti želodčni rakave celice požanjemo s centrifugiranjem ascites ali peritonealno izpirku (če ne obstaja vodenice). Celica plast gručasto je zamazan na steklu in obarvali s hematoksilinom in eozinom (HE). Dve izkušeni cytopathologists izvedli citoloških ocene. CEA smo uporabili kot biomarker za pomoč pri identifikaciji adenokarcinom celicah z imunofluorescenco s pozitivnim obarvanjem. Primeri so bili izključeni iz te študije, če rezultati obeh cytopathologists niso bile v soglasju ABB Group
Število
odstotkov (%)
Sex male2764.0 female1536.0Age (let) <.; 501.740,4 ≥502559.6Tumor lokacija tip Antral2150.0 Body1228.6 Fundic911.4Pathological No differentiated24.7 Zmerno differentiated49.5 Slabo differentiated3685.8Bormann tipkanje I00 II12.4 III1228.5 IV2969.1Ascites Yes1535.7 No2764.3Surgical pristop paliativno gastrectomy2457.1 raziskovalna + biopsy1842.9Table 1. Klinične in patološke značilnosti 42 primerov bolnikov z rakom želodca
CSV prenos CSV

2.3:. Imunohistokemija

vzorci parafinski tkiva primarnih tumorjev in metastatskih peritonealno tkiv so serijsko deljiva in HE obarvanje potrdila obstoj raka želodca. Zaporedne odseki so deparaffinized, dehidrirani, in izpostavi pridobivanje antigena v zaporedju. Oddelki inkubiramo z kunčje poliklonalno anti-Cx43 protitelesa za 24 ur pri 4 ° C. Vezavna mesta smo vizualizirali s 3, 3'-diamino-benzidinom (DAB) v 5-min reakcijo. Oddelki so jih nasprotno s hematoksilinom Mayer, dehidrirani, obračunavajo in nameščen. Opustitev primarno protitelo smo uporabili kot negativno kontrolo. Imunohistokemijsko je bila ocenjena z dodelitvijo točk, ki temelji na obsegu in intenzivnosti radioinkorporacijo. Obarvanje meri je bila ocenjena semiquantitatively v citoplazmi in membrane kot negativne (0, < 5% celic obarvajo), pozitivne 1 + (6-25% celic obarvajo), pozitivne 2 + (26-50% celic obarvajo) ali pozitivno 3 + ( > obarvajo 50% celic). Intenzivnost obarvanja je dosegel kot 0 (ni umazano), 1 (šibko barvanja, rumeno rjavo), 2 (zmeren barvanja, rumeno rjavo) ali 3 (močne barvanjem, rjavi). . Rezultati imunskim barvanjem je bilo doseženih kot vsota obsegu in intenzivnosti radioinkorporacijo, če upoštevamo rezultat ≥3 pozitiven in ocena < negativna

3 2.4: Imunofluorescenčni

Cx43 izraz v trebušnega listasti želodca rakave celice je bila ocenjena s pomočjo imunofluorescence. Ekipa dveh primerih je bilo vključenih v naši raziskavi. Celice zamazan na steklenih coverslips bila določena s 4% paraformaldehida in sprali s PBS, ki vsebuje 0,5% BSA (izpiranje pufra). Celice nato inkubiramo 24 ur pri 4 ° C s protitelesom proti Cx43 (1: 150). Je coverslips speremo in inkubirali s FITC konjugiranim kozjim anti-kunčjega sekundarnega protitelesa. Jedra smo obarvali z uporabo 10 ug /ml DAPI (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, ZDA). V coverslips so posneli s pomočjo fluorescence mikroskopom (Siemens, Nemčija). Kontrole (primarna protitelesa nadomestijo z PBS) so bili negativni za vse poskuse (podatki niso prikazani)

2.5. Celične kulture in stabilno izražanje Cx43 in Cx43 mutantov

nemaligna človek ovekovečena mesothelial celice , Met-5A, so bili pridobljeni iz ATCC. Te celice so se ohranili in se razmnožujejo v medij 199, ki vsebuje 1,5 g /l natrijevega bikarbonata, 10% fetalnega govejega seruma, 3,3 Nm za epidermalni rastni faktor (EGF), 400 Nm hidrokortizon, 870 nM cinka brez goveji insulin, 20 mM Hepes in 3,87 g /L selenasta kislina (H2SeO3).

človekovih želodca adenokarcinom celične linije BGC-823 in SGC-7901 so bili pridobljeni iz celične banke Shanghai Institute, kitajske akademije znanosti. Cx43- in Cx43T154A-izražajo vektorji so inženirstva s pomočjo lentivirusni okužbo. PTA2-Cx43, ki je vključevala človeško zaporedje Cx43-kodiranje, je bila zgrajena v našem laboratoriju. Mutacija Vektor konstrukcija Cx43T154A mestu smo izvedli s pomočjo prekrivanja podaljšek PCR, ki kodiran protein, ki deluje kot reže spoj brez IC kot je opisano predhodno [10]. CDNA za Cx43 in Cx43T154A bila vstavljena v Lenti-GFP vektorja in transfektiramo v 293T embalaža celične linije. Lentivirusni supernatant smo zbrali po 48 h, filtriramo skozi filter 0,45-im in se uporablja za okužbo BGC-823 in SGC-7901 celic. Medij je bil nadomeščen z RPMI1640 24 ur po okužbi in celice kultiviramo rutinsko. Več kot 90% tumorskih celic, izražena Cx43 ali Cx43T154A po treh krogih virusne infekcije; so uspešno okužene celice so bili zbrani s pretočno citometrijo

2.6. ekstrakcija beljakovine in Western blot analiza

smo lizirali inženirstva Cx43- in Cx43T154A izražajo BGC-823 in SGC-7901 želodčnih rakave celice . Beljakovine (50 mikrogramov) iz vsake vrste celic ločimo na 12% SDS-poliakrilamid gel in prenesli na nitrocelulozne membrane. Nitro Membrane smo blokirali s 5% nemastno mleko v prahu in nato preizkusimo za Cx43 proteina z uporabo poliklonsko anti-Cx43 protitelo (1: 500). Immunoblots bilo zaznati z ustreznimi s hrenovo peroksidazo konjugiranih sekundarnih protiteles (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, ZDA) v razredčenju 1: 10.000. Proteine ​​smo prikazali uporabo Supersignal West Pico kemiluminescenčni substrat (Pierce Chemical Co.) in immunoblots bili izpostavljeni Amersham Hyperfilm (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ, ZDA) 30 s

2.7. Tumor Cell /Mesothelial Mobilni Lepljenje Vsebnost

Mesothelial celice smo gojili do eni plasti sotočju na steklenih coverslips v 24 vdolbinami. Inženirstva Cx43- in Cx43T154A-izražanje želodca rakave celice so bile označene s 10 ug /ml Dil raztopino za 15 minut pri 37 ° C. Dil je pogosto uporablja fluorescence sonda, ki kaže oranžno-rdeče fluorescence v membranah in je bila uporabljena v naši raziskavi za označevanje želodčne rakavih celic. Te označene celice smo nato dodali mesothelial monosloje celic ter inkubiramo 1 uro pri 37 ° C. Nonadherent celice so bile odstranjene s spiranjem in celice, ki so oprijeti z mesothelial monosloje celic, so bile določene s 4% paraformaldehida. Diapozitivi kulture so bili nameščeni v Mowiol (Calbiochem) in pregledajo s pomočjo fluorescenčne mikroskopije (Leica MPS 60)

2.8. Tumor Cell /Mesothelial Cell GJIC test

inženirstva Cx43- in Cx43T154A izražajo BGC-823 in GSS-7901 želodca rakave celice so označeni za 15 minut pri 37 ° C z 2 ml Opti-MEM, ki vsebuje 10 ug /ml kalceina-AM in 10 ug /ml Dil. Kalcein-AM je fluorescentno substrat, ki se razcepi v živih celic na membransko neprepustno obliki, ki se lahko gredo skozi funkcionalnih spojih vrzeli, ne pa druga plazemska membranskih kanalov. Mesothelial plast celic so bili predhodno obdela 4 ure z 150μM karbenoksolona (CBX), da blokira homotypic GJIC in nato obdelujemo 15 minut z 10 g /ml kalcein-AM (molekularne sonde) v raztopini Opti-MEM. Dobro pripravljeni označene želodčnih rakave celice smo dodali Met-5A monosloje v Matrigel in predvideti, je bila odkrita heterotypic GJIC med želodčne rakavih celic in mesothelial celic. okrevanje fluorescence v beljene celic se bo zgodilo le, če barvilo prehaja skozi vrzel spojih sosednjih nebeljenih želodca rakavih celic. Posamezne mesothelial celice, ki mejijo na želodčnih rakave celice so beljene za približno 30 sekund z uporabo Zeiss laser konfokalna mikroskop in argona laser na 33% moči za vsako eksperimentalno stanju. Enotni mesothelial celice, ki ne bi mogel vzpostaviti GJIC so bili izbrani, da opravijo blenching kot kontrole. Neobdelane celice smo uporabili kot ozadja spreminjanje celic. Povprečni Intenzivnost fluorescence beljene /nebeljenih celic je bila izmerjena v času s Scion programsko opremo slikanje in stopnja izterjave fluorescence je bila izračunana kot tudi (Kt = (Ib-Ib0) /Iu × 100%, Kt: stopnja izterjave fluorescence v času t; Ib: intenziteta fluorescence v beljene celico v času t; Ib0: intenziteta fluorescence v beljene celico v času t = 0; Iu. intenziteta fluorescence v sosednji nebeljene celico v času t) [11]

2.9: transmesothelial migracije test

migracija test transmesothelial je bila izvedena, kot je že [12] opisano. Na kratko, 1 x 10 ^{5 Met-5A mesothelial Celice smo zasejali v 12-mm steklene coverslips, ki so bile prevlečene s Matrigel (Becton-Dickenson, ZDA). Plast dosegla sotočje, kot je določena z uporabo svetlobnega mikroskopa. Coverslips smo prenesli v 24 vdolbinicami in gojili 48 ur na Egm. Želodčne rakave celice so bile razdeljene glede prazen vektor skupine, Cx43-izražanje skupine, Cx43T154A-izražanje skupine in CBX predhodno obdelani skupini (so Cx43-izražajo želodca rakave celice predhodno obdela 4 ure z 150μM karbenoksolona (CBX), da blokira homotypic GJIC) in označi z Dil . Približno 1 x 10 5 celice smo dodali mesothelial celic monoslojev pri razmerju 1:10 (tumorske celice: mesothelial celic). Celice so bile sočasno kultiviramo pri različnih časih (1, 4 ali 7 h) pred žive opazovanje ali snemanje in imunskim barvanjem. Zaslepljeni raziskovalci količinsko diapedeze uporabo LSM, kot je bilo prej [7] opisali. Na kratko, co-kulture fiksne in obarvamo za F-aktin. Diapedeze smo kvantificirali kot število tumorskih celic, ki so bile v stiku z mesothelium in razvrščeni v tri faze glede na njihov položaj glede na mesothelium: 1) zaokrožen - tumorske celice z okroglim oblike na apical površini mesothelium; 2) prehajajo - tumorske celice je prodrl skozi mesothelial monosloje celic na mesothelial križiščih celic z delom telesa, celic nad mesothelium in del širjenja mobilni telesa na Matrigel izpod F-aktinskih stresnih vlaken mesothelial celic; in 3) pod - celotna tumorskih celic telo je bilo pod ravnino mesothelial celica stresnih vlaken. Selitev in pod njim celice so bile razvrščene kot transmigrating. Približno 100 mesothelium sprijemanju celice zabeležijo in računajo po stekelcem, in vsi poskusi so bili ponovi trikrat s trojnih coverslips}

2.10. Statistična analiza

Vse statistične analize smo izvedli s pomočjo programa SPSS ( različica 13,0). Verjetnosti P < 0.05 so bile upoštevane statistično značilno

Rezultati

3.1. Cx43 izraz v primarnih tumorjev in izravnanih metastatskih peritonealno tkiv

Dvainštirideset normalno epitelij (100%), izražena Cx43 s tipično membranska in citoplazemskega obarvanje (slika 1A). Enajst od 42 primarnih tumorjev (26,2%) so bili pozitivni za Cx43, ki je bistveno zmanjšal v primerjavi s sosednjo normalni epitelij (p < 0,05). Cx43 izraz je heterogena v različnih vzorcih tkiva: v dobro diferenciranih želodčnih tkiv raka, Cx43 izraz pokazala velik mešani (citoplazme in membranska) obarvanje (slika 1B); zmerno diferencirani želodca z rakom tkiva imel samo citoplazemske Cx43 izraz (slika 1C); in Cx43 je komaj izraženi v slabo diferenciranih želodčnih tkiva raka (Slika 1D). V nasprotju s tem je Cx43 izraz znatno povečal v 29 od 42 metastatski peritonealno tkiv (69,0%) in razstavljena tipično citoplazemske in membranskih obarvanje (p < 0,05). (Slika 1E) (tabela 2)
Connexin 43
Primarna rak želodca (primeri) (%)
sosednjih zdravih tkivih (primeri) (%)
metastatski peritonealno tkivo (primeri) (%)
Negativno (ocena < 3), 31 (73,8%) 0 (0 ) 13 (31,0%) Pozitivna (score≥3) 11 (26,2%) * 42 (100%) 29 (69,0%) † Tabela 2. imunohistokemija rezultati za Connexin 43 izražanja v primarnih želodčnih tkivih z rakom, ki mejijo normalnih želodčnih tkiv in trebušni votlini . metastatskih tkiva (N = 42)
* V primerjavi s sosednjimi normalnih tkiv, izraz connexin 43 znatno zmanjšal (p &0.05); † primerjavi s primarnimi želodca tkiva z rakom, izraz connexin 43 v metastatskem peritonealno tkivu znatno povečal (p 0.05). CSV prenos CSV

3.2: Cx43 izraz v znotraj trebušne listasti raka želodca celic

listasti želodca rakave celice Večina intraabdominalnimi obstajajo kot večceličnih zrnc (slika 1F). Pozitivna Cx43 imunskim barvanjem smo zabeležili v 35 od 42 primerov znotraj trebušne listasti rakavih celic z mešanim citoplazme in membranskih barvanjem, in pozitivne stopnje je 83,3% (slika 1 G, H, I).

3.3 : izražanje eksogenega Cx43 v BGC-823 in SGC-7901 z rakom želodca celic

želodcu rakave celice so zasnovana tako, da izrazijo funkcionalno Cx43, Cx43T154A in prazno lentivirusni vektor kot kontrole, da razišče učinke Cx43 izražanja na biološka obnašanje teh celic. Cx43 izraz je bil odsoten v prazen vektor skupine, ampak druga dva inženirstva skupine so bile odkrite izraziti bodisi Cx43 ali Cx43T154A (slika 2A)

3.4. Lepljenje Lastnosti želodca celicami raka na Mesothelial celice

so raziskovali tudi učinek Cx43 na adhezijo želodčnih rakavih celic do mesothelial celic. Inženirstva želodca rakave celice, ki izražajo bodisi divjega tipa Cx43 ali Cx43T154A pokazal znatno povečanje v oprijema na mesothelial celice v primerjavi s praznim vektor skupino (P < 0,05). med Cx43- in Cx43T154A, ki izražajo skupin (P > 0,05) niso opazili bistvenih razlik v oprijema sposobnosti, kar pomeni, da Cx43 spodbuja želodčni rak celic oprijem, ki je neodvisna od GJIC (Slika 2B)

3,5: Engineered. Cx43-izražanje BGC-823 in SGC-7901 celice tvorijo funkcionalne vrzel priključne kanale z mesothelial monosloje celic

Sodelujemo kultivirani inženirstva Cx43- in Cx43T154A-izražanje želodčne rakave celice mesothelial monosloje celic preučiti sposobnost Cx43 -izražanje celic, da nastane vrzel spoje in vzpostaviti GJIC z mesothelial celic. Rezultati kažejo, da želodčnih rakave celice v obeh nov vektorski skupino ali skupino Cx43T154A uspelo ugotoviti GJIC s sosednjimi peritonealno mesothelial celic po laserskega beljenja, medtem ko je Cx43 izražajo skupina sposobna vzpostaviti GJIC s peritonealno mesothelial celicami uspešno. Intracelularni Intenziteta fluorescence je bila odkrita pred beljenje, v trenutku beljenje in bodisi 1 min, 2 min 3 min ali 4 min po beljenju. Rezultati kažejo, da Cx43 izražajo skupina, intracelularni intenziteta fluorescence beljene mesothelial celice hitro zmanjšala po beljenju. Intenziteta fluorescence nato postopoma vrniti zaradi barvanje prehod skozi vrzeli križiščih s sosednjimi nebeljene želodca rakavih celic in stopnja izterjave fluorescence povprečno na 4 min je bila 35,6 ± 0,9% in 39,4 ± 0,8% po blenching v BGC-823 in SGC-7901 celic, oziroma, ki je bila bistveno višja kot v Cx43T154A in prazno vetor skupini (p < 0,05). (slika 3, tabela 3)
Group
Povprečna stopnja izterjave fluorescence (%, x
± s ) (t=4min)
BGC-823Cx4335.6±0.9*BGC-823Cx43T154A12.1±0.6BGC-823v13.4±0.7SGC-7901Cx4339.4±0.8†SGC-7901Cx43T154A15.3±0.4SGC-7901v14.7±0.6Table 3. Primerjava stopnje izterjave, povprečna fluorescence po beljenje v BGC-823 in SGC-7901 želodčnih rakavih celic (intenzitete fluorescence, x
± s)
CSV prenos CSV

3.6. Morfološka ocena tumorske celice diapedeze

Ugotovili smo tudi in vitro
sistema na sliki je transmesothelial migracije želodčnih rakavih celic raziskati mehanizem in pot diapedeze. Test posnema vidike žilne stene in je bil že uporabljen za analizo levkocitov diapedeze [11]. Dil-označene tumorske celice smo zadetka glede na njihovo morfologijo in lokacijo glede na mesothelium. Opredelili smo tri različne stopnje migracije uporabe konfokalno mikroskopijo: zaokroži (slika 4A); selijo (slika 4E); in pod (slika 4I). Tumorske celice na vrhu mesothelium pred diapedeze razstavljen krog ali ovular obliko, in to obliko je ohranila iz koničnem (slika 4B) na bazalno površino (slika 4C, D). Se selijo tumorske celice, ki potekajo med sosednjimi mesothelial celicami spremenjeno obliko iz ovular z dolgo vreteno z intracelularno F-aktin montiranim v aktinskih žarilno snope (Slika 4F, G, H). Tumorske celice, ki so izpolnili diapedeze so se nahajala v celoti pod mesothelium. Oblika celica postopoma spremenila iz dolge vretena na obliko vsestranski in medcelična F-aktin filamenti postopoma razširila in so redko razporejeni med filamenti (slika 4J, K, L). Naša raziskava je pokazala, da diapedeze želodca rakave celice "prišlo preko paracelični poti

3.7. Cx43 posredovano GJIC okrepljeno želodca rakave celice diapedeze

co-kultivirani smo Cx43-, Cx43T154A izražajo rak gasric celice in CBX obdelamo Cx43-celice, ki izražajo s mesothelial celic za 1, 4 in 7 ur primerja njihovo diapedeze učinkovitost [1,2]. Te celice so bile dosegel s pomočjo opisanih meril za migracije. Odstotek selitve Cx43T154A in CBX zdravljene celice niso bistveno drugačni od praznih vektor skupine celic po 7 urah co-kulture (p > 0,05), vendar pa se učinkovitost diapedeze od Cx43-izražajo celic v skupini je bila bistveno višja kot v drugih treh skupinah (p <0,05) (slika 5). Ti rezultati kažejo, da prisotnost proteina Cx43 samo v celici tumorja ni odgovoren za opaženo povečanje diapedeze, temveč je potrebno, da heterocellular GJIC med tumorskih celicah in mesothelial celic za bogatenje učinkovitosti diapedeze za želodčnih rakavih celic. Ti rezultati kažejo, da Cx43 omogoča GJIC-odvisno tumorskih celic diapedeze.

Pogovor

Gap križišč in connexin podenoti navzdol reguliranih v različnih rakavih obolenj [4,13,1,4]. Vendar pa je najnovejša poročila kažejo, da je izraz connexins "ni vedno na znižalo ravni med napredovanja tumorja; nasprotno, so lahko prisotni v kasnejših fazah rakotvornosti, povečanje zmogljivosti migracije invazivnih celic [2,15-11,7]. Ta ponovni pojav connexins je pri napredovanju človeškega raka na dojki, kjer Cx26- in Cx43-negativni primarni tumorji razvitem Cx26- in Cx43 pozitivne metastaz v bezgavkah [18,1,9] jasno opaziti. Podobni rezultati so bili doseženi tudi v miške karcinogeneze kože; Cx26 izraz se zmanjša v zgodnjih fazah rakotvornosti vendar je obnovljena v metastatskih bezgavk [20]. Te študije kažejo, da connexins različne vloge v procesu karcinogeneze. Naša študija je bilo prvič, da preuči izražanje Cx43 v različnih fazah želodca napredovanja raka (primarnih želodčnih rakavih tkiv, listasti želodčnih rakavih celic v trebušni votlini in se ujemajo z metastatskim peritonealno tkiva). Rezultati kažejo znatno zmanjšanje Cx43 izražanja v primarnih želodčnega tkiva raka v primerjavi s sosednjimi normalnih želodčnega tkiva (p < 0,05). V nasprotju s tem je Cx43 izraz v znotraj trebušne listasti želodčne rakavih celic in metastatskih peritonealno tkiv znatno povečal. Ti rezultati kažejo, da Cx43 najverjetneje igra pomembno vlogo pri peritonealno metastaz.

Če želite raziskati, ali ima Cx43 izraz vpliva na peritonealno metastaze, je Cx43 transfektirali v BGC-823 in SGC-7901 želodčnih rakavih celic ter dodatno Cx43T154A stran mutacija je bila zgrajena za določitev vloge vrzel plošcicnih komuniciranja v procesu peritonealno metastaz. Oprijema in diapedeze tumorskih celic do mesothelial monosloje celic sta kritični korake za tvorbo peritonealno metastaz. in vitro
celične adhezije testa so pokazali, da Cx43- in Cx43T154A izražajo BGC-823 in SGC-7901 celice razstavljene učinkovitejši oprijem na monosloje mesothelial celic kot praznih vektorske celice in da je učinkovitost oprijem Cx43T154A izražajo tumorske celice bil podoben Cx43-izražajo celic. Ti rezultati kažejo, da Cx43 spodbuja oprijem želodčnih rakavih celic mesothelial celice, ki je neodvisna od sporočilu o vrzel križišča. V zvezi z njegovim povezanim mehanizma, je naša Prejšnja študija je pokazala, da lahko Cx43 interakcijo z oprijemljivostjo povezano proteinov celic, kot so E-kadherina, ki sodelujejo v procesu oprijema [21], ki lahko predlaga pozitivno vlogo Cx43 izražanja v povečanju celične adhezije.

diapedeze želodčnih rakavih celic z mesothelial monosloje celic in vitro
je nadalje raziskan v naših poskusih. Naša raziskava je pokazala, da je diapedeze od Cx43-izražanje želodčnih celic znatno povečala v primerjavi z Cx43T154A-izražajo celic, kar kaže, da Cx43 izraz vpliva na celično gibljivost, ki je bila v skladu z nekaterimi prejšnjimi poročili [2, 14, 22 in 23]. Vendar pa je še vedno ni pojasnjen, ali je Cx43 izraz povezan z medcelični komunikaciji. Nato smo raziskali, ali GJIC igra osrednjo vlogo pri diapedeze. Najprej smo pregledali GJIC med želodca rakavih celic in peritonealno mesothelial celic. Rezultati so pokazali, da Cx43-izražanje želodčne rakave celice vzpostavila učinkovit heterotypic GJIC s peritonealno mesothelial celic; Vendar Cx43T154A-izražajo celice ni dokazala GJIC, kot je štelo pred [10].

Cx43- in Cx43T154A izražajo smo dodali želodčnih celic mesothelial enoslojnih kulturah celic in co-kultivirani čez noč (ne več kot 12 ur ), da še dodatno potrjujejo vlogo GJIC v preseljevanja želodčnih rakavih celic s peritonealno mesothelial monoslojev celic. Rak želodca celica diapedeze je pregledajo s pomočjo laserskega skeniranja konfokalnim mikroskopom. Naši rezultati so pokazali, da Cx43-izražanje želodčne rakave celice razstavljene učinkovitejšo migracije skozi monosloje mesothelial celic kot Cx43T154A in praznih vektor skupine celic, medtem ko učinkovitost diapedeze tumorskih celic v zadnjih dveh skupinah ni bistveno drugačen, kar kaže, da je heterocellular GJIC med tumor in mesothelial celice je treba okrepiti diapedeze. Da bi razumeli ključno vlogo GJIC v diapedeze želodca rakavih celic skozi plasti mesothelial celic, smo pogledali na prejšnje študije, ki so se izriše mehanizme, ki sodelujejo pri diapedeze tumorskih celic preko endotelijskih plasti celic. Te študije so pokazale, da lahko tumorske celice pošiljajo signale na endotelij, kot inozitol trifosfat (IP3), skozi vrzeli križiščih urediti znotrajcelično koncentracijo kalcija. Povišane ravni intraceličnega kalcija prehodno fosforilacije v miozina lahke verige za povečanje endotelnih prepustnost. Endotelne celice lahko pošlje tudi signale tumorskih celic skozi špranje križiščih do upregulate celične motilitete proteine, kot so Rho GTPases, protein kinaza C ter fosfoinozitidnih-3 kinaze [24-22,7]. Ti rezultati lahko pomagajo osvetliti mehanizem, kako GJIC igra osrednjo vlogo v diapedeze želodca rakavih celic.

Ob upoštevanju rezultatov te študije in nedavne ugotovitve, vam predlagamo, da Cx43 induciranih vrzeli spoji igrajo aktivna vloga v peritonealno metastaz želodčnih rakavih celic. Naši rezultati podpirajo hipotezo, da heterocellular gap-plošcicnih sklopke med želodčnih rakavih celic in mesothelium ureja transmigracijo želodčnih rakavih celic na peritonealno mesothelial monoslojev celic. Transmigracije želodčnih rakave celice "skozi mesothelial pregrado prišlo po paracelični migracij.

• Plos Genetics: onkogeni Pathway Kombinacije Napovedati Klinični prognozo želodčnega raka
• Plos ONE: Tumor Content Graf-Assisted HER2 /CEP17 Digitalni PCR analiza želodca Rak biopsijo