PLOS ONE: expressão aberrante de Cx43 está associado com o Peritoneal metástase do câncer gástrico e celular Cx43-Mediated Gap junção Melhora câncer gástrico diapedese de Peritoneal Mesothelium

Abstract

O processo de metástase peritoneal envolve a diapedese de intra esfoliada células cancerosas gástricas -abdominal através das monocamadas de células mesoteliais; No entanto, os mecanismos moleculares relacionados para este processo ainda não são claras. Heterocelular comunicação intercelular gap-juncional (GJIC) entre células cancerosas gástricas e células mesoteliais podem desempenhar um papel activo durante a diapedese. Neste estudo detectou a expressão da conexina 43 (Cx43) em tecidos primários gástricos câncer, as células cancerosas esfoliada intra-abdominais, e combinou tecidos peritoneal metastáticos. Descobrimos que a expressão de Cx43 em tecidos de cancro gástrico primários foi significativamente diminuída; as células cancerosas esfoliadas intra-abdominais e combinados tecidos peritoneal metastáticos exibiu aumento da expressão em comparação com os tecidos de câncer gástrico primários. células cancerosas gástricas humanas SGC-7901 BGC-823 e foram projetados para expressar Cx43 ou Cx43T154A (uma proteína mutante que apenas casais junções comunicantes, mas não fornece nenhuma comunicação intercelular) e foram co-cultivados com células mesoteliais peritoneais humanos (HPMC). Heterocelular GJIC e diapedese através de monocamadas de HPMC em lamelas revestidas de Matrigel foram investigados. Descobrimos que as células cancerosas gástricas BGC-823 e SGC-7901 expressam Cx43 formado junções comunicantes heterocelulares funcionais com monocamadas HPMC dentro de uma hora. Um aumento significativo na diapedese foi observada em células manipuladas que expressam Cx43-em comparação com células Cx43T154A e do grupo de controlo, o que sugeria que a regulação positiva observada de diapedese em células que expressam Cx43-necessária CIJH heterocelular. Outras estudo revelou que as células de cancro gástrico transmigrou através do espaço intercelular entre as células mesoteliais por uma via paracelular. Os nossos resultados sugerem que a expressão anormal de Cx43 desempenha um papel essencial na metástase peritoneal e que Cx43 mediada CIJH heterocelular entre células cancerosas e células mesoteliais gástricas pode ser um passo regulador importante durante a metástase. Finalmente, observamos que a diapedese de células cancerosas gástricas esfoliada através de barreiras mesoteliais é uma rota viável de migração paracelular

Citation:. Tang B, Peng Zh, Yu PW, Yu G, Qian F, Zeng Dz, et ai. (2013) expressão aberrante de Cx43 está associado com o Peritoneal metástase do câncer gástrico e Cx43-Mediated Gap junção Melhora câncer gástrico celular diapedese de Peritoneal Mesothelium. PLoS ONE 8 (9): e74527. doi: 10.1371 /journal.pone.0074527

editor: Johanna M Brandner, Hospital Universitário de Hamburg-Eppendorf, Alemanha |

Recebido: 19 Janeiro, 2013; Aceito: 06 de agosto de 2013; Publicação: 11 de setembro de 2013

Direitos de autor: © 2013 Tang et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiada pela subvenção No. 30801097 e 81272366 No. da National Science Foundation Natural da China. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

A incidência de câncer gástrico está a diminuir, mas continua a ser uma das principais causas de morte relacionada ao câncer em todo o mundo. As características predominantes das células cancerosas gástricas incluem as suas capacidades invasivos e metastáticos. metástase peritoneal é um recurso crítico para a progressão do tumor no câncer gástrico avançado [1]. Durante o processo de metástase peritoneal, células de cancro gástrico intercellularly interagir com vários tipos de células, e a interacção das células de cancro intra-abdominais esfoliadas gástricas e as células mesoteliais peritoneais é de particular importância. Como células de mesotélio peritoneal humana contínua (HPMC) monocamadas de actuar como uma barreira contra a metástase peritoneal, uma vez que a diapedese de células de cancro gástrico esfoliadas através de monocamadas de células mesoteliais ocorre, o fornecimento de sangue abundante na matriz abaixo do mesotélio oferecerá um ambiente confortável para gástrico metastático células cancerosas e promover a sua colonização. Portanto, diapedese de células gástricas cancerosas esfoliadas através da monocamada de células de mesotélio é um passo essencial durante a metástase peritoneal. A interacção entre estas células é acompanhada pela comunicação intercelular (IC), que é predominantemente mediada por junções de hiato célula-célula [2]. As junções de hiato são formados por conexinas membrana de plasma, cada um dos quais é composto por seis conexinas (CXS) [3]. Até à data, 20 isoformas de conexinas diferentes foram identificados nos seres humanos. Cx43 é uma isoforma geral expresso na maioria dos tecidos epiteliais. Estudos anteriores [4-6] indicaram que a expressão de Cx43 diminui durante a tumorigénese e, portanto, foi classificada como um supressor de tumor. No entanto, há um crescente corpo de evidência que conexinas podem estar envolvidos na intravasamento e extravasamento de células cancerosas e desempenhar um papel positivo no processo de metástase [7,8]. Se o junções de hiato de Cx43 mediada joga um papel importante na diapedese de células gástricas cancerosas através da barreira de mesotélio peritoneal permanece obscura. Para lidar com a hipótese de que examinaram a expressão de Cx43 em tecidos de cancro gástrico primários, células esfoliadas cancro gástrico, tecidos metastáticos e peritoneal. Construiu-se um vector de expressão de Cx43 e-uma mutação vetor local Cx43T154A. Em seguida, usamos duas linhas humanas gástricas celulares de cancro (BGC-823 e SGC-7901) que é GJIC deficiente e não expressam nenhum conexinas conhecidos [9]. Como as células mesoteliais abundantemente expressam Cx43, nós engenharia células cancerosas gástricas para expressar qualquer tipo selvagem Cx43 ou um mutante específica do local para determinar se o potencial de diapedese células cancerosas gástricas 'através do mesotélio mudaria sob ambas ou qualquer uma dessas condições. Neste estudo, mostramos que a expressão da Cx43 regula positivamente a diapedese de células tumorais através de um mecanismo GJIC dependente

Materiais e Métodos

2.1:. Reagentes e anticorpos

Anti-conexina 43 policlonal anticorpo (Zymed, San Diego, CA, EUA), de Matrigel (Becton-Dickenson, Bedford, MA, EUA), 1, 1 '-ciclo-diocta-decil-3, 3, 3', 3'-percholate tetramethylindocarbocyanine (Dil; Molecular Probes, Eugene, OR, EUA), calceína-AM (Dojindo, Kumamoto, Japão), e faloidina conjugada com FITC foram adquiridos à Sigma (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EUA).

2.2 : as amostras de tecido e citológica Exame

Todos os participantes forneceram consentimento informado por escrito (a partir de seus tutores quando necessário). Este estudo foi realizado em conformidade com os princípios da Declaração de Helsinki e suas alterações e foi aprovado pelo comitê de ética do hospital, Sudoeste, A Terceira Universidade Médica Militar. A população do estudo consistiu de 42 pacientes que foram classificados como estágio IV de acordo com a sétima edição do UICC TNM Classificação de tumores malignos. variáveis ​​clínico-patológicas estão listadas na Tabela 1. Todos os pacientes incluídos no estudo foram submetidos a cirurgia paliativa ou exploratória. O tumor primário e tecidos metastáticos peritoneais foram recolhidos antes do final da cirurgia, e esfoliada células gástricas cancerosas foram colhidas por centrifugação do fluido de ascite ou lavagem peritoneal (se não existir ascite). A camada de células nucleadas foi espalhada numa lâmina de vidro e corados com hematoxilina e eosina (HE). Dois citopatologistas experientes realizou as avaliações citológicas. CEA foi usado como um biomarcador para ajudar a identificar as células de adenocarcinoma por imunofluorescência com coloração positiva. Os casos foram excluídos do estudo, quando os resultados de ambos os citopatologistas não estavam de acordo
grupo
número
por cento (%) Sexo seguro male2764.0 female1536.0Age (anos). ≪ 501.740,4 ≥502559.6Tumor localização tipo Antral2150.0 Body1228.6 Fundic911.4Pathological Bem differentiated24.7 Moderadamente differentiated49.5 mal differentiated3685.8Bormann digitando abordagem I00 II12.4 III1228.5 IV2969.1Ascites Yes1535.7 No2764.3Surgical gastrectomy2457.1 paliativos exploratória + biopsy1842.9Table 1. As características clínicas e patológicas de 42 casos de pacientes com câncer gástrico
CSV Baixar CSV

2.3:. imunohistoquímica

amostras de tecido parafina de tumores primários e tecidos peritoneal metastáticos foram seccionados e coloração HE confirmou a existência de câncer gástrico. secções consecutivas foram desparafinadas, desidratados, e submetida a recuperação de antigénios em sequência. As secções foram incubadas com um anticorpo anti-Cx43 policlonal de coelho durante 24 horas a 4 ° C. locais de ligação foram visualizados com 3, 3'-diamino-benzidina (DAB) numa reacção de 5-min. As secções foram contrastadas com hematoxilina de Mayer, desidratado, limpou e montado. A omissão do anticorpo primário foi usado como controlo negativo. coloração imuno-histoquímica foi avaliada através da atribuição de uma pontuação baseada na extensão e intensidade da imunorreactividade. medida coloração foi avaliada semiquantitativa no citoplasma e membrana como negativo (0, < células 5% corado), (células 6-25% corados) positivos 1 +, + (células de 26-50% corados) positivos 2 ou 3 + positiva ( > 50% de células coradas). A intensidade da coloração foi classificada como 0 (sem coloração), 1 (coloração fraca, marrom amarelo), 2 (moderada coloração, marrom amarelo) ou 3 (coloração forte, marrom). . Resultados imunocoloração foram marcados como a soma da extensão e intensidade da imunorreactividade, considerando uma pontuação ≥3 positiva e uma pontuação < 3 negativo

2.4: Expressão

Cx43 Imunofluorescência
no intra-abdominal células cancerosas gástricas esfoliadas foi avaliada através de imunofluorescência. Quarenta e dois casos foram incluídos em nosso estudo. As células manchadas em lamelas de vidro foram fixadas com paraformaldeído a 4% e lavou-se com PBS contendo 0,5% (tampão de lavagem) de BSA. As células foram então incubadas durante 24 horas a 4 ° C com um anticorpo anti-Cx43 (1: 150). As lamelas foram lavadas e incubadas com o anticorpo secundário anti-coelho de cabra conjugado com FITC. Os núcleos foram coradas utilizando 10 ug /mL de DAPI (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EUA). As lamelas foram fotografadas usando um microscópio de fluorescência (Siemens, Alemanha). Os controlos (anticorpos primários foram substituídos por PBS) foram negativos para todas as experiências (dados não apresentados)

2.5:. Cultura de Células e expressão estável de Cx43 e Cx43 mutantes

humano não-malignas imortalizadas células mesoteliais , reuniu-5A, foram obtidas de ATCC. Estas células foram mantidas e propagadas em meio 199 contendo 1,5 g /L de bicarbonato de sódio, 10% de soro fetal bovino, 3,3 nM de factor de crescimento epidérmico (EGF), 400 nM de hidrocortisona, 870 nM de insulina de bovino isenta de zinco, 20 mM de HEPES, e 3,87 g /L de ácido selenioso (H2SeO3).

as linhas de células adenocarcinoma gástrico humanos BGC-823 e SGC-7901 foram obtidos a partir do banco de células Shanghai Institute, da Academia chinesa de Ciências. Cx43- vectores e expressando-Cx43T154A foram manipuladas utilizando infecção por lentivírus. PTA2-Cx43, que inclui uma sequência de codificação de Cx43-humano, foi construída no nosso laboratório. O local de mutação Cx43T154A construção do vector foi realizada utilizando PCR de extensão de sobreposição, que codificava para uma proteína que funcionava como uma das junções de hiato sem IC como previamente descrito [10]. O ADNc de Cx43 e Cx43T154A foi inserido no vector de lenti-GFP e transfectado para a linha celular de empacotamento 293T. O sobrenadante foi recolhido depois de lentivírus 48 h, filtrada através de um filtro de 0,45 ^ m e utilizados para infectar BGC-823 e células SGC-7901. O meio foi substituído com RPMI1640 24 horas após a infecção, e as células foram cultivadas rotineiramente. Mais de 90% das células tumorais expressas Cx43 ou Cx43T154A depois de três ciclos de infecção virai; as células infectadas com sucesso foram recolhidos por citometria de fluxo

2.6:. A extração de proteínas e análise Western blot

As células cancerosas gástricas engenharia Cx43- e Cx43T154A expressando BGC-823 e SGC-7901 foram lisadas . A proteína (50 ug) de cada tipo de célula foi separada num gel de SDS-poliacrilamida a 12% e transferidas para membranas de nitrocelulose. membranas de nitrocelulose foram bloqueadas com leite seco sem gordura 5% e foram então sondadas para a proteína Cx43 utilizando um anticorpo anti-Cx43 policlonal (1: 500). As imunotransferências foram sondados com os anticorpos conjugados com peroxidase de rábano secundárias apropriadas (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EUA) a uma diluição de 1: 10.000. As proteínas foram visualizadas utilizando um substrato Supersignal West Pico Chemiluminescent (Pierce Chemical Co.) e imunotransferências foram expostas a Amersham Hyperfilm (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ, EUA) durante 30 s

2.7:. Tumor Cell /mesotelial a adesão celular Assay

As células mesoteliais foram cultivadas até confluência monocamada em lamelas de vidro em placas de 24 poços. O Cx43- engenharia e Cx43T154A-expressando células de cancro gástrico foram marcadas com uma solução /ml Dil 10 ug durante 15 min a 37 ° C. Dil é uma sonda fluorescente vulgarmente utilizados que mostra uma fluorescência laranja-vermelho em membranas e foi utilizado no nosso estudo para etiquetar células de cancro gástrico. Estas células marcadas foram então adicionados às monocamadas de células mesoteliais e incubadas durante 1 h a 37 ° C. As células não aderentes foram removidas por lavagem, e as células que tinham aderido às monocamadas de células mesoteliais foram fixadas com paraformaldeído a 4%. As lâminas de cultura foram montadas em Mowiol (Calbiochem) e examinadas através de microscopia de fluorescência (Leica MPS 60)

2.8:. Tumor Cell /mesotelial GJIC celular ensaio

O Cx43- projetado e Cx43T154A expressando células de cancro gástrico BGC SGC-7901-823 e foram marcadas durante 15 minutos a 37 ° C com 2 ml de Opti-MEM contendo 10 ug /ml de calceina-AM e 10 ng /ml Dil. Calceina-AM é um substrato fluorescente que é clivado em células viáveis ​​a uma forma de membrana impermeável que pode passar através de junções de hiato funcionais, mas não de outros canais de membrana de plasma. As monocamadas de células mesoteliais foram pré-tratadas durante 4 h com 150 um carbenoxolona (CBX) para bloquear homotípica CIJH e foram então tratadas durante 15 minutos com 10 ug /ml de calceina-AM (Molecular Probes) em uma solução de Opti-MEM. As células de cancro gástrico bem marcadas preparadas foram adicionados às monocamadas de Met-5A no Matrigel, e foi detectada a CIJH heterotípica entre as células cancerosas e as células gástricas mesoteliais. recuperação de fluorescência em células branqueados só ocorrerá se corante passa através das junções comunicantes de células cancerosas gástricas crus adjacentes. células mesoteliais individuais adjacentes às células cancerosas gástricas foram branqueada por aproximadamente 30 s usando um Zeiss de varredura a laser microscópio confocal e um laser de argônio com potência de 33% para cada condição experimental. Células individuais mesoteliais que não foi possível estabelecer CIJH foram escolhidos para sofrer blenching como controlos. células não tratadas foram usadas como fundo modificar células. A intensidade de fluorescência média de células branqueadas /não branqueada foi medida ao longo do tempo usando software de imagem Scion, e a taxa de recuperação de fluorescência foi calculada como bem (Kt = (Ib-IB0) /IU × 100%, Kt: taxa de recuperação de fluorescência no tempo t; Ib: a intensidade de fluorescência na célula branqueada no tempo t; IB0: a intensidade de fluorescência na célula branqueada no tempo t = 0; Iu:. a intensidade de fluorescência na célula não branqueada adjacente no momento t) [11]

2.9: migração transmesothelial ensaio

O ensaio de migração transmesothelial foi realizada, como descrito anteriormente [12]. Resumidamente, 1 × 10 ^{5 células mesoteliais-5A conhecemos foram semeadas em lamelas de vidro de 12 mm que foram revestidas com Matrigel (Becton-Dickenson, EUA). As monocamadas atingiram a confluência, tal como determinado usando microscopia de luz. As lamelas foram transferidas para uma placa de 24 cavidades e foram cultivadas durante 48 h em AGE. células cancerosas gástricas foram divididos por faixa vector vazio, grupo Cx43-expressando, o grupo eo grupo pré-tratado CBX Cx43T154A expressando (Cx43-expressando células cancerosas gástricas foram pré-tratados durante 4 h com 150 um carbenoxolona (CBX) para bloquear homot�ica GJIC) e marcadas com Dil . Cerca de 1 × 10 5 células foram adicionados a monocamadas de células mesoteliais, na proporção de 1:10 (células de tumor: células mesoteliais). As células foram co-cultivados em diferentes tempos (1, 4 ou 7 h) antes de viver observação ou fixação e imunocoloração. investigadores cegos diapedese quantificada usando LSM, como descrito anteriormente [7]. Resumidamente, as co-culturas foram fixadas e coradas para F-actina. Diapedese foi quantificada como o número de células tumorais que estavam em contacto com o mesotélio e classificados em três fases de acordo com a sua posição em relação ao mesotélio: 1) arredondado - células tumorais com uma forma esférica na superfície apical do mesotélio; 2) Migração - células tumorais tinham penetrado através das monocamadas de células mesoteliais em junções de células mesoteliais com uma porção do corpo da célula acima do mesotélio e uma porção de corpo a propagação de células em Matrigel por baixo das células mesoteliais fibras de stress de actina F; e 3) por baixo - o corpo da célula tumoral inteira estava abaixo do plano das fibras de stress de células de mesotélio. Migrando e células embaixo foram classificados como transmigrando. Cerca de 100 células mesotélio-aderente foram registrados e contados por lamela, e todas as experiências foram repetidas três vezes com lamelas em triplicado}

2.10:. A análise estatística

Toda a análise estatística foi realizada utilizando o software SPSS ( versão 13.0). Probabilidades de P < 0,05 foram considerados estatisticamente significativos

Resultados

3.1:. Expressão Cx43 em tumores primários e combinados tecidos peritoneal metastáticos

Quarenta e dois epitélios normal (100%) expressa Cx43 com a típica a coloração das membranas e do citoplasma (Figura 1A). Onze dos 42 tumores primários (26,2%) foram positivas para Cx43, o que foi significativamente diminuída em comparação com o epitélio normal adjacente (p < 0,05). expressão de Cx43 era heterogéneo em amostras de tecido diferentes: em tecidos de cancro gástrico bem diferenciados, a expressão de Cx43 mostrou uma coloração mista principal (citoplasmática e membranosa) (Figura 1B); moderadamente diferenciadas tecidos de câncer gástrico tinha expressão Cx43 única citoplasmática (Figura 1C); e Cx43 mal foi expresso em tecidos com câncer gástrico pouco diferenciados (Figura 1D). Em contraste, a expressão de Cx43 foi significativamente aumentado em 29 dos 42 tecidos peritoneais metastáticas (69,0%) e exibiram coloração citoplasmática e membranosa típico (p < 0,05). (Figura 1E) (Tabela 2)
conexina 43
primária câncer gástrico (casos) (%)
tecido normal adjacente (casos) (%)
tecido metastático peritoneal (casos) (%)
Negative (score < 3) 31 (73,8%) 0 (0 ) 13 (31,0%) positivo (score≥3) 11 (26,2%) * 42 (100%) 29 (69,0%) † Tabela 2. resultados de imunohistoquímica para conexina 43 expressão em tecidos de câncer gástrico primários, tecidos gástricos normais adjacentes e peritoneal . tecidos metastáticos (N = 42)
* em comparação com tecidos normais adjacentes, a expressão de conexina 43 diminuiu significativamente (p < 0,05); † Em comparação com tecidos de cancro gástrico primário, a expressão de conexina 43 em tecido metastático peritoneal aumentou significativamente (P < 0,05). CSV Baixar

3.2 CSV: expressão da Cx43 em células de câncer gástrico esfoliadas intra-abdominais
existem

células cancerosas gástricas esfoliadas maioria intra-abdominal como esferóides multicelulares (Figura 1F). Cx43 imunocoloração positiva foi observada em 35 dos 42 casos de cancro de células esfoliadas intra-abdominais com citoplasmática misturados e a coloração das membranas, e a taxa positiva é de 83,3% (Figura 1 G, H e I).

3.3 : expressão de Cx43 exógeno em células de câncer gástrico SGC-7901 BGC-823 e

células cancerosas gástricas foram modificados para expressar Cx43 funcional, Cx43T154A e um vector lentiviral vazio como um controle para investigar os efeitos da expressão da Cx43 na comportamento biológico destas células. expressão Cx43 estava ausente no grupo de vector vazio, mas os outros dois grupos de engenharia foram detectados para expressar tanto Cx43 ou Cx43T154A (Figura 2A)

3.4:. Adesão propriedades das células de câncer gástrico para mesothelial células

o efeito de Cx43 sobre a adesão de células de cancro gástrico para as células mesoteliais também foi investigada. células de cancro gástrico modificadas que expressam quer de tipo selvagem ou Cx43 Cx43T154A exibiram um aumento significativo na adesão de células mesoteliais comparado com o grupo vector vazio (P < 0,05). Não foram observadas diferenças significativas na capacidade de adesão entre Cx43- e grupos Cx43T154A expressando (P > 0,05), sugerindo que a Cx43 promove a adesão de células de câncer gástrico, que é independente da GJIC (Figura 2B)

3.5: Projetada. células Cx43 expressando BGC-823 e SGC-7901 formam canais de junções de hiato funcionais com monocamadas de células mesoteliais

Nós co-cultivadas engenharia Cx43- e Cx43T154A-expressando células cancerosas gástricas com monocamadas de células mesoteliais para examinar a capacidade de Cx43 células -expressing para formar junções comunicantes e estabelecer GJIC com células mesoteliais. Os resultados mostram que as células de cancro gástrico em qualquer um do grupo de vector vazio ou o grupo Cx43T154A não conseguiram estabelecer a CIJH com células mesoteliais peritoneais adjacentes após o branqueamento a laser, enquanto que o grupo de Cx43-expressando foi capaz de estabelecer CIJH com células mesoteliais peritoneais com sucesso. A intensidade de fluorescência intracelular foi detectado antes do branqueamento, no instante de branqueamento, e ou 1 min, 2 min, 3 min e 4 min após o branqueamento. Os resultados mostram que, no grupo que expressam Cx43, a intensidade de fluorescência intracelular de células de mesotélio branqueada decresce rapidamente depois do branqueamento. A intensidade da fluorescência, em seguida, recuperou gradualmente devido ao tingir passagem através de junções com as células cancerosas gástricas crus adjacentes, ea taxa de recuperação de fluorescência média foi de 35,6 ± 0,9% e 39,4 ± 0,8% a 4 minutos após blenching no BGC-823 e as células SGC-7901, respectivamente, o que foi significativamente mais elevado do que no grupo vazio e Cx43T154A Vetor (p < 0,05). (Figura 3, Tabela 3)
grupo
a velocidade média de recuperação de fluorescência (%, x ± s
) (t=4min)
BGC-823Cx4335.6±0.9*BGC-823Cx43T154A12.1±0.6BGC-823v13.4±0.7SGC-7901Cx4339.4±0.8†SGC-7901Cx43T154A15.3±0.4SGC-7901v14.7±0.6Table 3. A comparação das taxas de recuperação média de fluorescência após o clareamento em células SGC-7901 câncer gástrico (intensidade de fluorescência, x
± s) BGC-823 e
CSV Baixar CSV

3.6:. Avaliação morfológica das células tumorais diapedese

Nós estabelecemos um in vitro
sistema para a imagem da migração transmesothelial de células cancerosas gástricas para investigar o mecanismo e via de diapedese. Este ensaio mimetiza os aspectos da parede do vaso e tem sido usado previamente para analisar diapedese de leucócitos [11]. células tumorais Dil-marcadas foram pontuados de acordo com a sua morfologia e localização com respeito ao mesotélio. Definimos três fases distintas de migração usando microscopia confocal: arredondados (Figura 4A); migrando (Figura 4E); e por baixo (Figura 4I). As células tumorais em cima do mesotélio antes diapedese exibiu uma forma redonda ou ovular, e essa forma foi mantida do lado apical (Figura 4B) para a superfície basal (Figura 4C, D). A migração de células tumorais que passam entre as células mesoteliais adjacentes mudou de forma ovular para um longo do eixo com intracelular de F-actina reunidos em feixes de filamentos de actina (Figura 4F, G, H). As células tumorais que foram cumpridos diapedese localizada completamente debaixo do mesotélio. A forma das células mudou gradualmente a partir do eixo longo para a forma redonda, e os filamentos intracelulares F-actina foram gradualmente estendida e uma baixa densidade disposta entre filamentos (Figura 4J, k, l). Nosso estudo revelou que diapedese células cancerosas gástricas 'ocorreu por uma via paracelular

3.7:. Cx43 mediada GJIC reforçada células cancerosas gástricas diapedese

Nós co-cultivadas Cx43-, Cx43T154A-cancro que expressa gasric As células pré-tratadas e CBX células que expressam Cx43 com células mesoteliais durante 1, 4 e 7 horas para se comparar a sua eficiência diapedese [1,2]. Estas células foram registados com os critérios descritos para a migração. A percentagem de migração de células Cx43T154A e CBX pré-tratados não foram significativamente diferentes para as células do grupo vector vazio após 7 horas de co-cultura (p > 0,05), mas a eficiência diapedese de células grupo Cx43-expressam foi significativamente mais elevada do que outros três grupos (p < 0,05) (Figura 5). Estes resultados sugerem que a presença da proteína Cx43 na célula de tumor por si só não é responsável pelo aumento observado na diapedese, mas que CIJH heterocelular entre células tumorais e células mesoteliais é necessário para aumentar a eficiência de diapedese de células de cancro gástrico. Estes resultados sugerem que Cx43 facilita diapedese de células tumorais GJIC-dependente.

Discussão

As junções de hiato e subunidades de conexina são reprimidos em vários tipos de câncer [4,13,1,4]. No entanto, relatórios recentes indicam que a expressão 'conexinas nem sempre é mantida em níveis diminuiu durante a progressão do tumor; Por outro lado, eles podem estar presentes durante as fases posteriores da carcinogénese, o aumento da capacidade de migração de células invasivas [2,15-11,7]. Esta re-aparecimento das conexinas é claramente observado durante a progressão do cancro da mama humano, em que os tumores primários e Cx43 Cx26--negativas desenvolvido Cx26- e metástases Cx43-positivas em nódulos linfáticos [18,1,9]. Resultados semelhantes também foram obtidos em rato carcinogênese de pele; Cx26 expressão é reduzida durante as primeiras fases da carcinogénese, mas é restaurado em linfonodos metastáticos [20]. Estes estudos implicam que conexinas desempenham papéis diferentes durante o processo de carcinogênese. Nosso estudo foi o primeiro tempo para examinar a expressão de Cx43 durante as diferentes fases de progressão do cancro gástrico (tecidos com cancro gástrico primários, as células cancerosas gástricas esfoliadas intra-abdominal e combinados tecidos peritoneal metastáticos). Os resultados mostram uma diminuição significativa na expressão de Cx43 em tecidos de cancro gástrico primários em comparação com os tecidos normais adjacentes gástricas (p < 0,05). Em contraste, a expressão de Cx43 em células de cancro intra-abdominais esfoliadas gástricas e tecidos peritoneais metastáticos foi significativamente aumentada. Estes resultados sugerem que Cx43 provavelmente desempenha um papel importante na metástase peritoneal.

Para explorar se a expressão de Cx43 tem um efeito sobre a metástase peritoneal, Cx43 foi transfectado em células de cancro gástrico BGC SGC-7901 823-e, e um Cx43T154A mutação no local foi construído de modo a determinar o papel da comunicação por junções de hiato no processo de metástase peritoneal. A adesão e a diapedese de células tumorais para as monocamadas de células mesoteliais são dois passos críticos para a formação de metástases peritoneais. Um in vitro ensaio
adesão celular revelaram que as células Cx43- e Cx43T154A expressando BGC-823 e SGC-7901 exibiram adesão mais eficiente para as monocamadas de células mesoteliais que as células vetor vazios e que a eficiência adesão de Cx43T154A expressando células de tumor foi semelhante para as células que expressam Cx43-. Estes resultados sugerem que Cx43 promove a adesão de células de cancro gástrico para células mesoteliais, que é independente da comunicação por junções de hiato. No que diz respeito ao seu mecanismo relacionado, o nosso estudo anterior tinha indicado que Cx43 podem interagir com proteínas associadas à adesão celular, tais como E-caderina, participando no processo de adesão [21], que poderá propor um papel positivo de expressão Cx43 no aumento adesão celular.

A diapedese de células cancerosas gástricas através de monocamadas de células mesoteliais in vitro
foi investigado em nossos experimentos. O nosso estudo revelou que a diapedese de Cx43-expressando células gástricas foi significativamente aumentada em comparação com células que expressam Cx43T154A, sugerindo que a expressão de Cx43 afectada a motilidade celular, o que foi consistente com vários relatórios anteriores [2, 14, 22, e 23]. No entanto, ele continua a ser elucidado se a expressão da Cx43 foi associada a comunicação intercelular. Em seguida, explorou se GJIC desempenha um papel fundamental na diapedese. Primeiro, examinamos a GJIC entre células cancerosas gástricas e células mesoteliais peritoneais. Os resultados demonstraram que células que expressam Cx43-cancro gástrico estabelecida uma CIJH heterotípica eficaz com as células mesoteliais peritoneais; No entanto, as células que expressam Cx43T154A não conseguiram estabelecer a CIJH, tal como foi considerado antes [10].

e Cx43- Cx43T154A-expressando células gástricas foram adicionados a monocamadas de células mesoteliais e co-cultivadas durante a noite (não superior a 12 horas ) para confirmar adicionalmente o papel de CIJH na transmigração de células gástricas cancerosas através das monocamadas de células mesoteliais peritoneais. diapedese célula cancerosa gástrica foi examinada utilizando varrimento a laser microscopia confocal. Os resultados revelaram que Cx43-expressando células de cancro gástrico exibiu migração mais eficiente através das monocamadas de células mesoteliais que Cx43T154A e células grupo vector vazio, ao passo que a eficiência diapedese de células tumorais em últimos dois grupos não era significativamente diferentes, sugerindo que a CIJH heterocelular entre tumoral e células mesoteliais é necessário reforçar a diapedese. Para entender o papel central da GJIC na diapedese de células cancerosas gástricas através das camadas de células mesoteliais, nós olhamos para estudos anteriores que elucidados os mecanismos envolvidos na diapedese de células tumorais através de camadas de células endoteliais. Estes estudos indicaram que as células tumorais podem enviar sinais para o endotélio, tal como trifosfato de inositol (IP3), através de junções de hiato para regular os níveis de cálcio intracelulares. Os níveis elevados de cálcio intracelular transiente fosforila a cadeia leve da miosina para aumentar a permeabilidade endotelial. As células endoteliais podem também enviar sinais para as células tumorais através de junções de hiato para regular positivamente a motilidade proteínas celulares, tais como Rho GTPases, proteína quinase C, e fosfoinositida 3-quinase [24-22,7]. Estes resultados podem ajudar a elucidar o mecanismo de como GJIC desempenha um papel fundamental durante a diapedese de células cancerosas gástricas.

Tendo em conta os resultados deste estudo e descobertas recentes, sugerimos que junções de hiato Cx43 mediadas desempenhar um papel activo na metástase peritoneal de células de cancro gástrico. Os resultados suportam a hipótese de que heterocelular acoplamentos GAP-juncional entre células cancerosas gástricas e mesotélio regula a transmigração das células cancerosas gástricas às monocamadas de células mesoteliais peritoneais. transmigração células cancerosas gástricas 'através da barreira mesotelial ocorreu via migração paracelular.

• PLoS Genetics: oncogênicos Caminho Combinações predizer o prognóstico clínico em Câncer Gástrico
• PLOS ONE: Tumor Content Chart-Assisted HER2 /CEP17 Digital Análise por PCR de câncer gástrico Biópsia amostras