PLoS ONE: Аберрантная Выражение Cx43 связано с брюшную метастазирования рака желудка и Cx43-опосредованного щелевых Усиливает Желудочный Cancer Cell диапедез из перитонеального Mesothelium

Абстрактный
<р> Процесс перитонеального метастазирования включает диапедез внутри- -abdominal расслоенные клетки рака желудка через мезотелиальной монослоя клеток; Однако соответствующие молекулярные механизмы этого процесса пока не ясны. Разрыв-формирующийся или состоящий из клеток разного типа узловой межклеточной связи (GJIC) между клеток рака желудка и мезотелиальной клетки могут играть активную роль в процессе диапедез. В этом исследовании мы обнаружили экспрессию коннексина 43 (Сх43) в первичных раковых тканей желудка, интраабдоминальными слущенных раковых клеток, и совпадающим с метастатическим перитонеальных тканей. Мы обнаружили, что экспрессия Cx43 в первичных раковых тканей желудка значительно снизилась; внутрибрюшного отслоившейся раковые клетки и совпадающая с метастазами перитонеальные ткани выставлены увеличения экспрессии по сравнению с первичными желудочных раковых тканей. КУП-823 и SGC-7901 рака желудка человека клетки, сконструированные для экспрессии Сх43 или Cx43T154A (мутантный белок, который только пары ЩС, но не обеспечивает межклеточной коммуникации) и культивировали совместно с перитонеального мезотелиальной клеток человека (НРМС). GJIC и формирующийся или состоящий из клеток разного типа диапедез через ГПМЦ монослоев на Матригель покрытием покровные были исследованы. Мы обнаружили, что КУП-823 и SGC-7901 рак желудка клетки, экспрессирующие Сх43 образуются функциональные формирующийся или состоящий из клеток разного типа щелевые контакты с ГПМЦ монослоев в течение одного часа. Значительное увеличение диапедез наблюдалось в сконструированных Сх43-экспрессирующих клеток по сравнению с Cx43T154A и контрольной группы клеток, которые предположили, что наблюдаемая положительная регуляция диапедез в Сх43-экспрессирующих клеток требуется GJIC формирующийся или состоящий из клеток разного типа. Дальнейшие исследования показали, что клетки рака желудка переселилась через межклеточное пространство между мезотелиальной клеток через маршрут парацеллюлярной. Наши результаты свидетельствуют о том, что аномальная экспрессия Сх43 играет существенную роль в перитонеального метастазирования и что Сх43-опосредованной GJIC между формирующийся или состоящий из клеток разного типа клеток рака желудка и мезотелиальной клеток может быть важным регуляторным шагом в процессе метастазирования. И, наконец, мы наблюдали, что диапедез слущенных клеток рака желудка через мезотелиальной барьеров является жизнеспособным маршрутом миграции парацеллюлярной
<р> Образец цитирования:. Тан B, Пэн Ж., Ю. PW, Ю. G, F Цянь, Цзэн Dz, и др и др. (2013) Аберрантная Выражение Cx43 связано с брюшную метастазирования рака желудка и Cx43-опосредованного щелевых Усиливает рак желудка Cell диапедез от перитонеального мезотелия. PLoS ONE 8 (9): e74527. DOI: 10.1371 /journal.pone.0074527
<р> Редактор: Johanna M Бранднер, Университетская клиника Гамбург-Эппендорф, Германия
<р> Поступило: 19 января 2013 года; Принято: 6 августа 2013 года; Опубликовано: 11 сентября 2013
<р> Copyright: © 2013 Тан и др. Это статья с открытым доступом распространяется в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution, которая позволяет неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе, при условии, что оригинальный автор и источник кредитуются

Финансирование:. Эта работа был поддержан грант № 30801097 и № 81272366 от Национального фонда естественных наук Китая. Доноры не играет никакой роли в дизайн исследования, сбора и анализа данных, решение о публикации или подготовки рукописи
<р> Конкурирующие интересы:.. Авторы заявили, что не существует никаких конкурирующих интересов

Введение
<р> заболеваемость раком желудка снижается, но остается одной из основных причин рака, связанных смерти во всем мире. Преобладающие особенности клеток рака желудка включают их инвазивных и метастатических потенциала. Перитонеальный метастаз является критическим признаком прогрессирования опухоли в пожилом рака желудка [1]. В процессе перитонеальные метастазы, желудочные раковые клетки взаимодействуют межклеточно с несколькими типами клеток, а также взаимодействие интраабдоминальное отслоившейся клеток рака желудка и перитонеальных мезотелиальных клеток имеет особенно важное значение. В непрерывной человеческой перитонеального мезотелиальной клетки (НРМС) монослоев выступать в качестве барьера против перитонеального метастазирования после того, как диапедез слущенных клеток рака желудка через мезотелиальной монослоя клеток происходит, обильное кровоснабжение в матрице под мезотелием предложит комфортные условия для метастатической желудка раковые клетки и способствуют их колонизацию. Поэтому диапедез слущенных клеток рака желудка через мезотелиальной монослоя клеток является важным шагом в процессе перитонеального метастазирования. Взаимодействие между этими клетками сопровождается межклеточной коммуникации (IC), который преимущественно опосредованного межклеточных щелевых контактов [2]. Щелевые соединения образуются плазматических мембран коннексинами, каждая из которых состоит из шести коннексинами (CXS) [3]. На сегодняшний день 20 различных коннексином изоформ были идентифицированы у человека. Cx43 является общей изоформы, выраженной в большинстве эпителиальных тканей. Предыдущие исследования [4-6] показали, что экспрессия Сх43 снизилась на онкогенеза и, следовательно, был классифицирован как подавитель опухоли. Тем не менее, есть все больше доказательств того, что коннексины могут быть вовлечены в intravasation и транссудации раковых клеток и играют положительную роль в процессе метастазирования [7,8]. Независимо от того, играет важную роль в диапедез желудка раковых клеток через брюшную мезотелиальной барьера Сх43 опосредованной щелевых остается неясным. Для решения этой гипотезы мы исследовали экспрессию Сх43 в первичных раковых тканей желудка, отслоившейся клеток рака желудка и брюшины метастатических тканей. Мы построили Сх43-выражающую вектор и вектор мутации Cx43T154A сайта. Затем мы использовали два желудка человеческих клеточных линий рака (КУП-823 и SGC-7901), который GJIC дефицитных и не выражает каких-либо известных коннексинов [9]. Поскольку мезотелиальной клетки обильно выразить Cx43, мы инженерии клеток рака желудка, чтобы выразить либо дикого типа Сх43 или сайт-специфического мутанта, чтобы определить, является ли потенциал диапедез клеток рака желудка "через мезотелием будет изменяться при обоих или одного из этих условий. В этом исследовании мы показали, что экспрессия Сх43 активирует опухолевых клеток диапедез через GJIC-зависимый механизм

Материалы и методы

2.1:. Реагенты и антитела

Анти-коннексина 43 поликлональные антитела (Zymed, Сан-Диего, Калифорния, США), Матригель (Becton-Дикинсон, Бедфорд, штат Массачусетс, США), 1, 1'-diocta-децил-3, 3, 3 ', 3'-tetramethylindocarbocyanine percholate (разб; Молекулярный зонды, Юджин, Орегон, США), Кальцеин-AM (Dojindo, Кумамото, Япония) и FITC-конъюгированный фаллоидином были приобретены у Sigma (Sigma-Aldrich, Сент-Луис, штат Миссури, США).

2.2 образцы ткани и цитологическое исследование
<р> Все участники дали письменное информированное согласие (от своих опекунов, если это необходимо). Данное исследование было проведено в соответствии с принципами Хельсинкской декларации и поправок к нему и был одобрен этическим комитетом больницы Юго-Западной, третий военный медицинский университет. Исследуемая популяция состояла из 42 пациентов, которые были классифицированы как стадия IV в соответствии с седьмым изданием UICC TNM классификации злокачественных опухолей. Клиникопатологическими переменные перечислены в таблице 1. Все пациенты, включенных в наше исследование подверглись паллиативное или разведочные операции. Первичная опухоль и метастатических перитонеальные ткани были собраны до конца операции, и вспученного рака желудка клетки собирали путем центрифугирования асцита или перитонеального лаважа (если асцит не существовало). Зарождаются слой клеток смазывается на предметное стекло и окрашивают гематоксилином и эозином (HE). Два опытных cytopathologists проводили цитологические оценки. СЕА была использована в качестве биомаркеров, чтобы помочь идентифицировать клетки аденокарциномы с помощью иммунофлуоресценции с положительным окрашиванием. Случаи были исключены из настоящего исследования, когда результаты обоих cytopathologists не были согласны
группе
Number
процент (%) Любительские секс male2764.0 female1536.0Age (лет) &лт. 501740,4 ≥502559.6Tumor расположение типа Antral2150.0 Body1228.6 Fundic911.4Pathological Ну differentiated24.7 Умеренно differentiated49.5 Плохо differentiated3685.8Bormann набрав I00 II12.4 III1228.5 IV2969.1Ascites Yes1535.7 No2764.3Surgical подход паллиативная gastrectomy2457.1 разведочную + biopsy1842.9Table 1. Клинические и патологические характеристики 42 случаев больных раком желудка
CSV Загрузить CSV

2.3. Immunohistochemistry
<р> образцы Парафин ткани первичных опухолей и метастатических перитонеального ткани серийно секционного и Его окрашивание подтвердили наличие рака желудка. Последовательные срезы депарафинировали, обезвоженной, и подвергали извлечения антигенов в последовательности. Срезы инкубировали с кроличьей поликлональной анти-Сх43 антителом в течение 24 часов при температуре 4 ° С. Участки связывания визуализируют с 3, 3'-диамино-бензидина (DAB) в 5-ти мин реакции. Срезы контрастировали гематоксилином Майера, обезвожены, очищены и установлены. Пропуски первичного антитела использовали в качестве отрицательного контроля. Иммуногистохимическое окрашивание оценивали путем присвоения баллов, основываясь на степени и интенсивности иммунореактивности. Окрашивание степени оценивали полуколичественно в цитоплазме и мембране в виде отрицательных (0, &ЛТ; 5% клеток, окрашенных), положительных 1 + (6-25% клеток окрашиваются), положительные 2 + (26-50% клеток окрашиваются) или положительный 3 + ( > 50% клеток, окрашенных). Интенсивность окрашивания оценивали как 0 (отсутствие окрашивания), 1 (слабое окрашивание, желто-коричневый), 2 (умеренное окрашивание, желто-коричневый) или 3 (сильное окрашивание, коричневый). . Результаты Иммуноокрашивание оценивались как сумма степени и интенсивности иммунореактивности, принимая во внимание оценку ≥3 положительным и оценка &л; 3 отрицательная

2.4: иммунофлуоресценции
выражение <р> Сх43 в внутрибрюшное расслоенные клетки рака желудка оценивали с помощью иммунофлюоресценции. Сорок два случая были зарегистрированы в нашем исследовании. Клетки смазанные на покровных стеклах, фиксировали 4% параформальдегидом и промывали PBS, содержащим 0,5% БСА (буфер полоскание). Затем клетки инкубировали в течение 24 часов при 4 ° С с антителом анти-Сх43 (1: 150). Покровные стекла промывали и инкубировали с ФИТЦ-конъюгированным козьим антителом против кроличьего вторичным антителом. Ядра окрашивали 10 мкг /мл DAPI (Sigma-Aldrich, Сент-Луис, штат Миссури, США). Покровные стекла визуализируют с помощью флуоресцентного микроскопа (Siemens, Германия). Элементы управления (первичные антитела были заменены PBS) были отрицательными для всех экспериментов (данные не показаны)

2.5:. Культура клеток и стабильной экспрессии Cx43 и Cx43 мутантов
<р> доброкачественных человек увековечен мезотелиальной клетки , Met-5A, были получены из АТСС. Эти клетки поддерживали и культивируют в среде 199, содержащей 1,5 г /л бикарбоната натрия, 10% фетальной бычьей сыворотки, 3,3 нм эпидермальный фактор роста (EGF), 400 нм гидрокортизон, длине волны 870 нм бесцинковой бычий инсулин, 20 мМ HEPES, и 3,87 мкг /л селенистая кислота (H2SeO3).
<р> желудочной аденокарциномы линии клеток человека BGC-823 и SGC-7901 были получены из банка клеток Шанхайского института китайской академии наук. Cx43- и Cx43T154A экспрессирующие векторы были сконструированы с использованием Lentiviral инфекции. PTA2-Сх43, который включал в себя последовательность человеческого Сх43-кодирования, был построен в нашей лаборатории. Мутация вектор строительства Cx43T154A сайта была выполнена с использованием Перекрытие расширения PCR, который кодирует белок, который функционирует в качестве щелевых контактов без IC, как описано ранее [10]. КДНК Сх43 и Cx43T154A был вставлен в вектор Ленти-GFP и трансфицировали в 293T упаковки клеточной линии. Лентивирусов супернатант собирали через 48 ч, фильтруют через фильтр с размером 0,45 мкм и использовали для инфицирования BGC-823 и СГК-7901 клетки. Среду заменяли RPMI1640 через 24 часа после заражения, и клетки культивировали в установленном порядке. Более чем 90% опухолевых клеток экспрессировали Сх43 или Cx43T154A после трех раундов вирусной инфекции; Успешно инфицированные клетки собирали с помощью проточной цитометрии

2.6:. экстрагирования белка и Вестерн-блот-анализ
<р> сконструированные Cx43- и Cx43T154A экспрессирующих КУП-823 и СГК-7901 рака желудка клетки лизируют , Белок (50 мкг) от каждого типа клеток разделяли в 12% SDS-полиакриламидном геле и переносили на нитроцеллюлозные мембраны. Нитроцеллюлозные мембраны блокировали 5% обезжиренным сухим молоком, а затем зондировали для белка Сх43 с использованием поликлонального анти-Сх43 антитела (1: 500). Иммуноблоты зондировали соответствующими конъюгированного с пероксидазой хрена вторичных антител (Sigma-Aldrich, Сент-Луис, штат Миссури, США) при 1: 10000 разбавления. Белки были визуализированы с использованием субстрата SuperSignal Вест Пико хемилюминесцентные (Pierce Chemical Co.) и иммуноблоты подвергались Amersham Hyperfilm (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ, USA) в течение 30 с

2.7:. Опухоль Cell /Мезотелиальной Анализ клеточной адгезии
<р> мезотелиальной клетки выращивали до монослоя слияния на покровные стекла в 24-луночные планшеты. Инженерных Cx43- и Cx43T154A экспрессирующих Клетки рака желудка метили 10 мкг раствора /мл Дил в течение 15 мин при 37 ° С. Дил является широко используемым флуоресцентный зонд, который показывает оранжево-красную флуоресценцию в мембранах и использовали в нашем исследовании для маркировки клеток рака желудка. Эти меченые клетки затем добавляли к мезотелиальной монослоя клеток и инкубировали в течение 1 ч при 37 ° С. Неадгезивные клетки удаляли путем промывки, а клетки, которые приклеивают к мезотелиальной монослоя клеток фиксировали 4% параформальдегидом. Слайды культуры были установлены в Mowiol (Calbiochem) и исследовали с помощью флуоресцентной микроскопии (Leica МОБ 60)

2.8:. Опухоль Cell /Мезотелиальной Cell GJIC анализ
<р> Инженерных Cx43- и Cx43T154A-выражения КУП-823 и СГК-7901 клетки рака желудка метили в течение 15 минут при температуре 37 ° с с помощью 2 мл Opti-MEM, содержащей 10 мкг /мл кальцеином AM и 10 мкг /мл Дил. Кальцеин-АМ представляет собой флуоресцентный субстрат, который расщепляется в жизнеспособных клеток с мембраной непроницаемой для формы, которая может проходить через функциональных щелевых контактов, а не других каналов плазматических мембран. Мезотелиальной клеточные монослои были предварительно обрабатывают в течение 4 ч с 150 мкм карбеноксолон (CBX), чтобы блокировать гомотипическую GJIC, а затем обрабатывали в течение 15 минут с добавлением 10 мкг /мл кальцеин-АМ (Molecular Probes) в растворе OPTI-MEM. Хорошо подготовленные маркированные Клетки рака желудка были добавлены к МЕТ-5A монослоев на Матригель, и была обнаружена гетеротипические GJIC между клеток рака желудка и мезотелиальной клеток. восстановление флуоресценции в обесцвеченных клеток будет происходить только тогда, когда краситель проходит через щелевые контакты соприкасающихся небеленой клеток рака желудка. Отдельные мезотелиальные клетки примыкают к клеток рака желудка отбеливали в течение примерно 30 с при использовании Цейс лазерной сканирующей конфокальной микроскопии и аргонового лазера при 33% мощности для каждого условия эксперимента. Одиночные мезотелиальной клетки, которые не могли бы установить GJIC были выбраны, чтобы пройти blenching в качестве контроля. Необработанные клетки были использованы в качестве фона модификации клеток. Средняя интенсивность флуоресценции обесцвеченных /небеленой клеток измеряли в течение долгого времени, используя программное обеспечение обработки изображений Scion, и скорость восстановления флуоресценции вычисляли а (Кт = (Ib-IB0) /Iu × 100%, Кт: скорость восстановления флуоресценции в момент времени Т; Ib: интенсивность флуоресценции в обесцвеченной камере в момент времени Т; IB0: интенсивность флуоресценции в обесцвеченной ячейке в момент времени T = 0; Iu:. интенсивность флуоресценции в соседней ячейке небеленой в момент времени T) [11]

2.9: transmesothelial анализа миграции
<р> transmesothelial анализ миграции проводили, как описано ранее [12]. Вкратце, 1 × 10 ^{5 Met-5A мезотелиальной клетки высевали на покровные стекла 12 мм, которые были покрыты Матригель (Becton-Dickenson, США). Монослоев достигли сплошности, как определено с использованием световой микроскопии. Покровные переносили на 24-луночный планшет и культивировали в течение 48 ч в ВОС. Клетки рака желудка были разделены пустым вектором группы, Cx43-экспрессирующих группу, Cx43T154A-экспрессирующие группы и CBX предварительно обработанной группы (Сх43-выражающие желудочные раковые клетки предварительно обрабатывают в течение 4 ч при 150 мкм карбеноксолон (CBX), чтобы заблокировать однотипны GJIC) и метили Диль , Приблизительно 1 × 10 5 клеток добавляли в Мезотелиальной монослоев клеток в соотношении 1:10 (опухолевой клетки: мезотелиальной клетки). Клетки культивировали в течение различного времени (1, 4, или 7 ч) перед жить наблюдение или фиксацию и иммунное окрашивание. Ослепленные исследователи количественно диапедез с помощью LSM, как описано ранее [7]. Если коротко, то со-культуры фиксировали и окрашивали для F-актина. Диапедез количественно оценивали как количество опухолевых клеток, которые были в контакте с мезотелием и классифицированы на три стадии в соответствии с их положением относительно мезотелием: 1) закругленный - опухолевые клетки со сферической формой на апикальной поверхности мезотелием; 2) мигрирующий - опухолевые клетки проникли через мезотелиальной монослоя клеток в мезотелиальной соединений элементов с частью тела клетки над мезотелием и частью распространения тела клетки на Матригель под мезотелиальных клеток F-актина стрессовых волокон; и 3) под - все тело опухолевых клеток была ниже плоскости мезотелиальной клеток стрессовых волокон. Перенастройка и под клетки были классифицированы как переселяется. Примерно 100 мезотелия-адгезивные клетки были записаны и подсчитаны на покровное, и все эксперименты были повторены три раза в трех повторах покровные}

2,10:. Статистический анализ
<р> Весь статистический анализ проводили с использованием программного обеспечения SPSS ( версия 13.0). Вероятности P < 0,05 считались статистически значимыми

Результаты

3.1. Выражение Сх43 в первичных опухолях и совпадающим с метастатическим перитонеальных тканей
<р> Сорок два нормальным эпителием (100%), выраженная Сх43 с типичным перепончатые и окрашивание цитоплазмы (рис 1А). Одиннадцать из 42 первичных опухолей (26,2%) были положительными для Сх43, который был значительно снизился по сравнению с соседней нормальным эпителием (р &л; 0,05). Выражение Сх43 было неоднородным в различных образцах тканей: в хорошо дифференцированной желудка раковых тканей, экспрессия Сх43 показали значительное смешанное (цитоплазматический и перепончатые) окрашивание (Фигура 1В); умеренно дифференцированные раковые ткани желудка были только цитоплазматическую экспрессию Сх43 (рис 1C); и Cx43 был едва выражен в малодифференцированных желудочных раковых тканей (рис 1D). В противоположность этому, экспрессия Сх43 была значительно увеличена на 29 из 42 метастатических перитонеальных тканей (69,0%) и выставлены типичные цитоплазматическую и мембранную окрашивание (р ≪ 0,05). (Рис 1д) (таблица 2)
коннексина 43
Primary рак желудка (случаи) (%)
соседнему нормальная ткань (случаи) (%)
Метастатическим перитонеальный ткани (случаи) (%)
Отрицательный (оценка &л; 3) 31 (73,8%) 0 (0 ) 13 (31,0%) Положительный (score≥3) 11 (26,2%) * 42 (100%) 29 (69,0%) † Таблица 2. результаты иммуногистохимии для выявления коннексина 43 экспрессии в первичных желудочных раковых тканей, прилегающих нормальных тканях желудка и перитонеальный . метастатические ткани (N = 42)
* по сравнению с соседними нормальными тканями, экспрессия коннексина 43 значительно снизилась (р ≪ 0,05); † По сравнению с первичной желудочной раковых тканей, экспрессия коннексина 43 в метастатической перитонеального ткани значительно увеличилось (р ≪ 0,05). CSV Загрузить

3.2 CSV: выражение Сх43 в интраабдоминальными отслоившейся рака желудка клетки

Наиболее интраабдоминальной отслоившейся Клетки рака желудка существуют в виде многоклеточных сфероидов (рис 1F). Положительная Сх43 иммунное наблюдалась в 35 из 42 случаев внутрибрюшного отслоившейся раковых клеток со смешанным цитоплазматических и мембранным окрашивания, а также положительной скорости составляет 83,3% (рис 1 G, H и I).

3.3 Экспрессия экзогенного Сх43 в BGC-823 и SGC-7901 рака желудка клетки
<р> желудочные раковые клетки были сконструированы для экспрессии функционального Сх43, Cx43T154A и пустой лентивирусов вектор в качестве контроля, чтобы исследовать влияние экспрессии Сх43 по маршруту биологическое поведение этих клеток. Выражение Сх43 отсутствовал в пустой векторной группы, но две другие сконструированные группы были обнаружены, чтобы выразить либо Сх43 или Cx43T154A (Рисунок 2A)

3.4. Адгезия свойства клеток рака желудка в мезотелиальной клетки
<р> влияние Cx43 на адгезию клеток рака желудка в мезотелиальной клеток также была исследована. Engineered Клетки рака желудка экспрессирующие либо дикого типа Cx43 или Cx43T154A наблюдалось значительное увеличение адгезии к Мезотелиальной клеток по сравнению с пустым вектором группы (Р &ЛТ; 0,05). Не было обнаружено существенных различий в способности адгезии между Cx43- и Cx43T154A экспрессирующих групп (P > 0,05), предполагая, что Сх43 способствует желудочной раковых клеток адгезии, которая не зависит от GJIC (рис 2В)

3.5: Engineered. Cx43-экспрессирующих BGC-823 и SGC-7901 клетки образуют функциональные щелевых каналов с мезотелиальной монослоя клеток
<р> Мы культивировали совместно инженерии Cx43- и Cx43T154A-экспрессирующих клеток рака желудка с мезотелиальной монослоя клеток для изучения способности Сх43 -expressing клетки образуют щелевые контакты и установить GJIC с мезотелиальной клеток. Результаты показывают, что раковые клетки желудка либо в пустой векторной группы или группы Cx43T154A не удалось установить GJIC с соседними перитонеальных мезотелиальной клеток после лазерного отбеливания, в то время как Сх43-экспрессирующих группа смогла установить GJIC с перитонеальных мезотелиальными клетками успешно. Интенсивность флуоресценции внутриклеточного был обнаружен до отбеливания, в момент отбеливания, и либо 1 мин, 2 мин, 3 мин или 4 мин после отбеливания. Результаты показывают, что, в Сх43-экспрессирующих группу, внутриклеточный интенсивность флуоресценции обесцвеченного мезотелиальной клетки быстро уменьшалось после отбеливания. Интенсивность флуоресценции затем постепенно восстанавливается за счет красителя при прохождении через щелевые контакты с примыкающими небеленой клеток рака желудка, а средняя скорость восстановления флуоресценция 35,6 ± 0,9% и 39,4 ± 0,8% в 4 мин после blenching в BGC-823 и SGC-7901 клеток, соответственно, что значительно выше, чем в Cx43T154A и пустой VETOR группе (р &ЛТ; 0,05). (Рисунок 3, таблица 3)
Группа
Средняя скорость восстановления флуоресценции (%, х
± s ) (t=4min)
BGC-823Cx4335.6±0.9*BGC-823Cx43T154A12.1±0.6BGC-823v13.4±0.7SGC-7901Cx4339.4±0.8†SGC-7901Cx43T154A15.3±0.4SGC-7901v14.7±0.6Table 3. Сравнение скоростей восстановления средней флуоресценции после отбеливания в BGC-823 и SGC-7901 клеток рака желудка (интенсивность флуоресценции, х
± с)
CSV Загрузить CSV

3.6:. Морфологические оценка опухолевой клетки диапедез

Мы установили в пробирке
системы для изображения transmesothelial миграцию клеток рака желудка исследовать механизм и пути диапедез. Указанный анализ имитирует аспекты стенки сосуда и использовалась ранее для анализа лейкоцитарного диапедез [11]. Гомотетия меченные опухолевые клетки оценивали в соответствии с их морфологии и расположения по отношению к мезотелием. Мы определили три различные стадии миграции с помощью конфокальной микроскопии: закругленные (рис 4а); миграции (рис 4Е); и снизу (Рисунок 4I). Опухолевые клетки в верхней части мезотелием до начала диапедез выставлены круглые или овулярный форму, и эта форма поддерживалась от апикальной (фиг.4В) к базальной поверхности (фиг.4С, D). Мигрирующие клетки опухоли, проходящие между соседними мезотелиальными клетками изменили форму от овулярный к длинному штоку с внутриклеточным F-актина в собранном актиновые пучки филаментов (рис 4F, G, Н). Опухолевые клетки, которые завершили диапедез находились полностью под мезотелием. Форма ячейки постепенно изменяется от длинного шпинделя до формы круглее, и внутриклеточные F-актиновые филаменты постепенно расширяется и были слабо организованы между нитями (рис 4J, K, L). Наше исследование показало, что диапедез клеток рака желудка "произошло через парацеллюлярной маршрут

3.7:. Сх43-опосредованной GJIC усиливается Клетки рака желудка диапедез
<р> Мы совместно культивируют Cx43-, Cx43T154A экспрессирующих gasric рак клетки и CBX предварительно обработанные Сх43-экспрессирующих клеток с мезотелиальными клетками в течение 1, 4 и 7 ч, чтобы сравнить их эффективность диапедез [1,2]. Эти клетки оценивали с использованием описанных критериев для миграции. Процент миграции Cx43T154A и CBX предварительно обработанных клеток существенно не отличается от пустых ячеек вектор группы через 7 ч после совместного культивирования (р > 0,05), но эффективность диапедез Сх43-экспрессирующих клеток группы была значительно выше, чем в других трех группах (р &л; 0,05) (рисунок 5). Эти результаты свидетельствуют о том, что присутствие белка Сх43 в опухолевой клетке, сама по себе не несет ответственности за наблюдаемое увеличение диапедез, но что формирующийся или состоящий из клеток разного типа GJIC между опухолевыми клетками и клетками мезотелиальной требуется для увеличения эффективности диапедез для клеток рака желудка. Эти результаты свидетельствуют о том, что Сх43 облегчает GJIC-зависимую опухолевых клеток диапедез.

Обсуждение
<р> Щелевые контакты и коннексином субъединиц подавляются в различных видов рака [4,13,1,4]. Однако недавние сообщения свидетельствуют о том, что выражение "коннексинов не всегда поддерживается на пониженных уровней во время прогрессирования опухоли; наоборот, они могут присутствовать на поздних стадиях канцерогенеза, увеличение пропускной способности миграции инвазивных клеток [2,15-11,7]. Это повторное появление коннексинов отчетливо наблюдается во время прогрессирования рака молочной железы человека, где Cx26- и Cx43-негативные первичные опухоли развитой Cx26- и Сх43-положительные метастазы в лимфатических узлах [18,1,9]. Аналогичные результаты были получены и в мышиной канцерогенеза кожи; Выражение Cx26 уменьшается на ранних стадиях канцерогенеза, но восстанавливается в метастатических лимфатических узлов [20]. Эти исследования предполагают, что коннексины играют различные роли в процессе канцерогенеза. Наше исследование было впервые, чтобы исследовать экспрессию Сх43 на разных стадиях прогрессии рака желудка (первичных раковых тканей желудка, интраабдоминальными отслоившейся клеток рака желудка и совпавших с метастатическим перитонеальных тканей). Результаты показывают значительное снижение экспрессии Сх43 в первичных раковых тканей желудка по сравнению с соседними нормальными тканями желудка (р &л; 0,05). В противоположность этому, экспрессия Сх43 внутрибрюшного отслоившейся клеток рака желудка и метастатических перитонеальных тканей была значительно увеличена. Эти результаты свидетельствуют о том, что Сх43, скорее всего, играет важную роль в брюшную метастаз.
<Р> Чтобы исследовать, имеет ли выражение Сх43 эффект на перитонеальный метастаз, Сх43 трансфицировали в BGC-823 и СГК-7901 клеток рака желудка, а также мутации сайта Cx43T154A была построена, чтобы определить роль разрыва связи в соединительного процессе перитонеального метастазирования. Адгезия и диапедез опухолевых клеток к мезотелиальной монослоя клеток являются два важных шага для формирования перитонеального метастазирования. в пробирке анализа
адгезию клеток показало, что Cx43- и Cx43T154A экспрессирующих BGC-823 и SGC-7901 клетки выставлены более эффективную адгезию к мезотелиальной монослоя клеток, чем пустой векторных клеток и что эффективность адгезии Cx43T154A-выражения опухолевые клетки были похожи на Сх43-экспрессирующих клеток. Эти результаты свидетельствуют о том, что Сх43 способствует адгезии клеток рака желудка в мезотелиальной клетки, которая не зависит от щелевых связи. Что касается его соответствующего механизма, наше предыдущее исследование было указано, что Сх43 может взаимодействовать с клеточной адгезии-ассоциированных белков, таких как Е-кадгерина, участвующих в процессе адгезии [21], что может предложить позитивную роль экспрессии Сх43 в увеличении клеточной адгезии.
<р> диапедез желудка раковых клеток через мезотелиальной монослоя клеток в пробирке
был исследован в наших экспериментах. Наше исследование показало, что диапедез Сх43-экспрессирующих клетках желудка была значительно выше по сравнению с Cx43T154A-экспрессирующих клеток, предполагая, что экспрессия Сх43 влияет клеточную подвижность, которая согласуется с несколькими предыдущими сообщениями [2, 14, 22 и 23]. Тем не менее, это еще предстоит выяснить, была ли экспрессия Cx43 связано с межклеточной коммуникации. Затем мы исследовали, играет ли GJIC решающую роль в диапедез. Во-первых, мы исследовали GJIC между клеток рака желудка и брюшины мезотелиальной клеток. Результаты показали, что Сх43-экспрессирующих клеток рака желудка создан эффективный гетеротипические GJIC перитонеальным мезотелиальными клетками; Тем не менее, Cx43T154A-клетки, экспрессирующие не удалось установить GJIC, как считалось ранее [10].
<р> Cx43- и Cx43T154A экспрессирующие клетки желудка были добавлены к мезотелиальной монослоя клеток и совместно культивировали в течение ночи (не более 12 часов ) для дальнейшего подтверждения роли GJIC в переселении клеток рака желудка через перитонеального мезотелиальной монослоя клеток. Желудочный раковых клеток диапедез исследовали с помощью лазерной сканирующей конфокальной микроскопии. Наши результаты показали, что Сх43-экспрессирующих клеток рака желудка выставлены более эффективную миграцию через мезотелиальной монослоя клеток, чем Cx43T154A и клеток пустой вектор группы, в то время как эффективность диапедез опухолевых клеток в последних двух группах достоверно не отличалась, предполагая, что формирующийся или состоящий из клеток разного типа GJIC между опухолью и мезотелиальной клетки необходимо усилить диапедез. Чтобы понять ключевую роль GJIC в диапедез желудка раковых клеток через мезотелиальной клеточных слоев, мы смотрели на предыдущие исследования, которые разъяснили механизмы, участвующие в диапедез опухолевых клеток через слои эндотелиальных клеток. Эти исследования показали, что опухолевые клетки могут посылать сигналы к эндотелию, такие как инозитолтрифосфат (IP3), через щелевые контакты, чтобы регулировать уровни внутриклеточного кальция. Повышенные уровни внутриклеточного кальция скоротечно фосфорилировать легкой цепи миозина для увеличения проницаемости эндотелия. Эндотелиальные клетки могут также посылать сигналы к опухолевым клеткам через щелевые контакты с апрегулируются клеточных белков моторики, такие как Rho GTPases, протеинкиназа С, и фосфоинозитидного-3-киназы [24-22,7]. Эти результаты могут помочь выяснить механизм того, как GJIC играет ключевую роль в процессе диапедез клеток рака желудка.
<Р> Принимая во внимание результаты этого исследования и последних результатов, мы полагаем, что Сх43-опосредованные щелевые контакты играют активная роль в брюшную метастазирование клеток рака желудка. Полученные результаты подтверждают гипотезу о том, что гэп-формирующийся или состоящий из клеток разного типа узловой соединения между клеток рака желудка и Мезотелия регулирует трансмиграции клеток рака желудка в перитонеальных мезотелиальными монослоев клеток. трансмиграция клеток рака желудка "через мезотелиальной барьер произошел путем миграции парацеллюлярной.

• PLoS Genetics: Онкогенные Комбинации Pathway Предсказать клинический прогноз в рака желудка
• PLoS ONE: Опухоль Содержание Chart-Assisted HER2 /CEP17 цифровой ПЦР анализ рака желудка биоптатах