PLoS ONE: aberrant espressione di Cx43 è associato con il peritoneale Metastasi del cancro gastrico e Cx43-Mediated Gap Junction migliora cancro gastrico delle cellule diapedesi da peritoneale Mesothelium

Estratto

Il processo di metastasi peritoneale comporta la diapedesi di intra le cellule tumorali Kin-addominale esfoliate gastrico attraverso i monostrati di cellule mesoteliali; tuttavia, i relativi meccanismi molecolari di questo processo sono ancora chiare. Heterocellular gap-giunzionale comunicazione intercellulare (GJIC) tra le cellule di cancro gastrico e cellule mesoteliali può svolgere un ruolo attivo durante la diapedesi. In questo studio abbiamo rilevato l'espressione della connessina 43 (Cx43), in primari tessuti gastrici tumorali, le cellule tumorali esfoliate intra-addominali, e tessuti peritoneali metastatici abbinati. Abbiamo scoperto che l'espressione di Cx43 in tessuti di cancro gastrico primario era significativamente diminuita; le cellule tumorali espansa intra-addominali e tessuti peritoneali metastatici abbinati esposte crescente espressione rispetto ai tessuti di cancro gastrico primarie. BGC-823 e le cellule di cancro gastrico umano SGC-7901 sono stati progettati per esprimere Cx43 o Cx43T154A (una proteina mutante che solo le coppie gap giunzioni ma fornisce nessuna comunicazione intercellulare) e sono stati co-coltura con cellule umane mesoteliali peritoneali (HPMCs). Heterocellular GJIC e diapedesi attraverso monostrati HPMC su vetrini Matrigel rivestite sono stati studiati. Abbiamo scoperto che le cellule tumorali gastrica BGC-823 e SGC-7901 che esprimono Cx43 formate funzionali giunzioni heterocellular con monostrati HPMC entro un'ora. Un aumento significativo diapedesi è stato osservato in cellule ingegnerizzate Cx43-esprimono rispetto alle cellule Cx43T154A e gruppo di controllo, che ha suggerito che l'up-regolazione osservato di diapedesi nelle cellule che esprimono Cx43-richiesto GJIC heterocellular. Ulteriori studi hanno rivelato che le cellule di cancro gastrico trasmigrato attraverso lo spazio intercellulare tra le cellule mesoteliali attraverso un percorso paracellulare. I nostri risultati suggeriscono che l'espressione anormale di Cx43 svolge un ruolo essenziale nella metastasi peritoneale e che Cx43 mediata GJIC heterocellular tra le cellule di cancro gastrico e le cellule mesoteliali può essere un passo importante regolamentare durante la metastasi. Infine, abbiamo osservato che la diapedesi delle cellule di cancro gastrico esfoliate attraverso le barriere mesothelial è un percorso praticabile della migrazione paracellular

Visto:. Tang B, Peng Zh, Yu PW, Yu G, Qian F, Zeng Dz, et al. (2013) Espressione aberrante di Cx43 è associato con il peritoneale Metastasi del cancro gastrico e Cx43-Mediated Gap Junction Migliora cancro gastrico delle cellule diapedesi da peritoneale mesotelio. PLoS ONE 8 (9): e74527. doi: 10.1371 /journal.pone.0074527

Editor: Johanna M Brandner, University Hospital di Amburgo-Eppendorf, Germania |

Ricevuto: 19 gennaio 2013; Accettato: 6 agosto 2013; Pubblicato: 11 settembre 2013

Copyright: © 2013 Tang et al. Questo è un articolo ad accesso libero distribuito sotto i termini della Creative Commons Attribution License, che permette l'uso senza restrizioni, la distribuzione e la riproduzione con qualsiasi mezzo, a condizione che l'autore originale e la fonte sono accreditati

Finanziamento:. Questo lavoro è stata sostenuta da sovvenzioni n ° 30801097 e n 81272366 dal National Science Foundation naturale della Cina. I finanziatori avevano alcun ruolo nel disegno dello studio, la raccolta e l'analisi dei dati, la decisione di pubblicare, o preparazione del manoscritto

Competere interessi:.. Gli autori hanno dichiarato che non esistono interessi in competizione

Introduzione

L'incidenza di cancro gastrico è in declino, ma rimane una delle principali cause di morte per cancro in tutto il mondo. Le caratteristiche predominanti di cellule di cancro gastrico comprendono le capacità invasive e metastatici. metastasi peritoneale è una caratteristica fondamentale per la progressione del tumore nel cancro gastrico avanzato [1]. Durante il processo di metastasi peritoneale, cellule di cancro gastrico interagiscono intercellularly con più tipi di cellule, e l'interazione dei espansa cellule di cancro gastrico intra-addominali e le cellule mesoteliali peritoneali è di particolare importanza. Come continuo cellule mesoteliali peritoneale umana (HPMC) monostrati agiscono come una barriera contro le metastasi peritoneale, una volta che si verifica la diapedesi delle cellule di cancro gastrico espansa attraverso monostrati di cellule mesoteliali, l'afflusso di sangue abbondante nella matrice sotto il mesotelio offrirà un ambiente confortevole per gastrico metastatico le cellule tumorali e promuovere la loro colonizzazione. Pertanto, diapedesi delle cellule di cancro gastrico esfoliate attraverso il monostrato cellulare mesoteliali è un passo essenziale durante la metastasi peritoneale. L'interazione tra queste cellule è accompagnata dalla comunicazione intercellulare (IC), che è prevalentemente mediata da gap cellula-cellula giunzioni [2]. giunzioni sono formate da connessine membrana plasmatica, ciascuno dei quali è composto da sei connessine (CXS) [3]. Fino ad oggi, 20 differenti isoforme connessine sono state identificate negli esseri umani. Cx43 è una isoforma generale espressa nella maggior parte dei tessuti epiteliali. Studi precedenti [4-6] hanno indicato che l'espressione Cx43 diminuito durante la tumorigenesi ed è stato quindi classificato come un soppressore del tumore. Tuttavia, vi è un crescente corpo di prove che connessine possono essere coinvolti nella intravasation e stravaso di cellule cancerose e svolgono un ruolo positivo nel processo di metastasi [7,8]. Se la giunzione gap Cx43 mediata gioca un ruolo importante nella diapedesi delle cellule di cancro gastrico attraverso la barriera mesothelial peritoneale rimane poco chiaro. Per affrontare l'ipotesi abbiamo esaminato l'espressione di Cx43 in tessuti di cancro gastrico primarie, espansa cellule di cancro gastrico, e tessuti metastatici peritoneali. Abbiamo costruito un vettore Cx43-esprimere e un sito Cx43T154A mutazione vettore. Poi, abbiamo utilizzato due linee umane di cellule di cancro gastrico (BGC-823 e SGC-7901) che è GJIC carenti e non esprime alcun connessine noti [9]. Poiché le cellule mesoteliali abbondantemente esprimono Cx43, abbiamo progettato cellule di cancro gastrico per esprimere sia wild-type Cx43 o un mutante site-specific per determinare se il potenziale di diapedesi cellule di cancro gastrico 'attraverso il mesotelio cambierebbe in entrambe o una di queste condizioni. In questo studio abbiamo dimostrato che l'espressione Cx43 upregulates diapedesi delle cellule tumorali attraverso un meccanismo GJIC-dipendente

Materiali e Metodi

2.1:. Reagenti e anticorpi

Anti-connessina 43 policlonale anticorpo (Zymed, San Diego, CA, USA), Matrigel (Becton-Dickenson, Bedford, MA, USA), 1, 1'-diocta-decile-3, 3, 3 ', 3'-tetramethylindocarbocyanine percholate (Dil; molecolare sonde, Eugene, OR, stati Uniti d'America), calceina-AM (Dojindo, Kumamoto, Giappone), e falloidina FITC-coniugato sono stati acquistati dalla Sigma (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA).

2.2 : campioni di tessuto e citologico Esame

Tutti i partecipanti hanno fornito il consenso informato scritto (da loro tutori se necessario). Questo studio è stato condotto in conformità con i principi della Dichiarazione di Helsinki e successive modifiche ed è stato approvato dal comitato etico del Southwest Hospital, The Third Military Medical University. La popolazione in studio consisteva di 42 pazienti che sono stati classificati come stadio IV secondo la settima edizione della UICC TNM classificazione dei tumori maligni. variabili clinico-patologiche sono elencati nella tabella 1. Tutti i pazienti arruolati nel nostro studio sono stati sottoposti a chirurgia palliativa o esplorativa. tumore primitivo e tessuti peritoneali metastatici sono stati raccolti prima della fine di un intervento chirurgico, e exfoliated cellule di cancro gastrico sono state raccolte dalla centrifugazione di ascite o liquido di lavaggio peritoneale (se non esistessero ascite). Lo strato di cellule nucleate è stato spalmato su un vetrino e colorati con ematossilina ed eosina (HE). Due citopatologi esperti eseguite le valutazioni citologici. CEA è stato utilizzato come biomarker per aiutare a identificare le cellule di adenocarcinoma mediante immunofluorescenza con colorazione positiva. I casi sono stati esclusi dal presente studio, quando i risultati di entrambe le citopatologi non erano in accordo
gruppo
Numero
percentuale (%)
Sex male2764.0 female1536.0Age (anni) e lt.; 501.740,4 ≥502559.6Tumor posizione tipo Antral2150.0 Body1228.6 Fundic911.4Pathological Bene differentiated24.7 moderatamente differentiated49.5 scarsamente differentiated3685.8Bormann digitando approccio I00 II12.4 III1228.5 IV2969.1Ascites Yes1535.7 No2764.3Surgical palliative gastrectomy2457.1 esplorativa + biopsy1842.9Table 1. Le caratteristiche cliniche e patologiche di 42 casi di pazienti con cancro gastrico
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2.3:. immunoistochimica

campioni di tessuto di paraffina di tumori primari e metastatici tessuti peritoneali sono stati in serie sezionato e SE macchiatura confermato l'esistenza di cancro gastrico. sezioni consecutive sono stati deparaffinate, disidratati, e sottoposti a recupero dell'antigene in sequenza. Le sezioni sono state incubate con un anticorpo policlonale di coniglio anti-Cx43 anticorpi per 24 ore a 4 ° C. I siti di legame sono stati visualizzati con 3, 3'-diamino-benzidina (DAB) in una reazione di 5 min. Le sezioni sono state contrastate con ematossilina di Mayer, disidratati, cancellati e montate. L'omissione dell'anticorpo primario è stato usato come controllo negativo. La colorazione immunoistochimica è stata valutata attribuendo un punteggio in base alla portata e l'intensità di immunoreattività. misura di colorazione è stata valutata semiquantitativamente nel citoplasma e membrana come negativo (0, < celle 5% macchiato), (cellule 6-25% colorate) positivi 1 + 2 +, positive (cellule 26-50% colorate) o positivo (+ 3 > 50% delle cellule colorate). L'intensità della colorazione è stato segnato come 0 (nessuna colorazione), 1 (debole colorazione, giallo marrone), 2 (colorazione moderata, giallo marrone) o 3 (colorazione forte, marrone). . Immunoistochimica risultati sono stati segnati come la somma della portata e l'intensità di immunoreattività, considerando un punteggio ≥3 positivo e un punteggio < 3 negativo

2.4: immunofluorescenza
espressione

Cx43 in intra-addominale cellule di cancro gastrico esfoliate è stata valutata utilizzando immunofluorescenza. Quarantadue casi sono stati arruolati nel nostro studio. Le cellule spalmate su vetrini sono stati fissati con paraformaldeide al 4% e lavate con PBS contenente 0,5% (tampone di lavaggio) BSA. Le cellule sono state poi incubate per 24 ore a 4 ° C con un anticorpo anti-Cx43 (1: 150). I vetrini sono stati lavati e incubate con FITC-coniugato anticorpo secondario di capra anti-coniglio. I nuclei sono stati colorati con 10 ug /ml DAPI (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA). I vetrini sono stati ripresi utilizzando un microscopio a fluorescenza (Siemens, Germania). I controlli (anticorpi primari sono stati sostituiti da PBS) sono risultati negativi per tutti gli esperimenti (dati non riportati)

2.5:. Coltura cellulare e espressione stabile di Cx43 e Cx43 mutanti

umano non maligne immortalato cellule mesoteliali , Met-5A, sono stati ottenuti da ATCC. Queste cellule sono state mantenute e propagate in Medium 199 contenente bicarbonato 1,5 g /L di sodio, 10% di siero fetale bovino, 3,3 nM fattore di crescita epidermico (EGF), 400 nM idrocortisone, 870 nM senza zinco insulina bovina, 20 mM HEPES, e 3,87 mg /L di acido selenioso (H2SeO3).

le linee cellulari di adenocarcinoma gastrico umane BGC-823 e SGC-7901 sono stati ottenuti dalla banca di cellule Shanghai Institute, Accademia Cinese delle Scienze. vettori Cx43- e Cx43T154A che esprimono sono stati progettati con l'infezione lentivirale. PTA2-Cx43, che comprendeva una sequenza Cx43-codifica umana, è stato costruito nel nostro laboratorio. La costruzione mutazione vettoriale sito Cx43T154A stata eseguita utilizzando overlap extension PCR, che codifica una proteina che fungeva da gap junction senza IC come precedentemente descritto [10]. Il cDNA di Cx43 e Cx43T154A è stato inserito nel vettore lenti-GFP e trasfettato nella linea cellulare 293T confezionamento. Il surnatante è stato raccolto lentivirale dopo 48 h, filtrata attraverso un filtro da 0,45 micron e utilizzato per infettare BGC-823 e cellule SGC-7901. Il mezzo è stato sostituito con RPMI1640 24 ore dopo l'infezione, e le cellule sono state coltivate routine. Più del 90% delle cellule tumorali espressi Cx43 o Cx43T154A dopo tre cicli di infezione virale; le cellule infettate con successo sono stati raccolti mediante citometria di flusso

. 2.6: l'estrazione di proteine ​​e occidentale blot

Le cellule di cancro gastrico ingegnerizzate Cx43- e Cx43T154A esprimono BGC-823 e SGC-7901 sono state lisate . Proteine ​​(50 mg) per ogni tipo di cellula è stato separato su gel di SDS-poliacrilammide al 12% e trasferite su membrane di nitrocellulosa. membrane di nitrocellulosa sono state bloccate con latte in polvere 5% senza grassi e sono stati poi sondati per la proteina Cx43 utilizzando un anticorpo policlonale anti-Cx43 (1: 500). Immunoblot sono stati sondati con il rafano anticorpi secondari coniugati con perossidasi appropriati (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) in una diluizione 1: 10.000. Le proteine ​​sono state visualizzate utilizzando un substrato SuperSignal occidentale Pico Chemiluminescent (Pierce Chemical Co.) e immunoblot sono stati esposti a Amersham Hyperfilm (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ, USA) per 30 s

2.7:. Tumorale delle cellule /mesoteliali Adesione Cellulare Assay

cellule mesoteliali sono state coltivate fino a confluenza monostrato su vetrini in piastre da 24 pozzetti. Il Cx43- progettato e Cx43T154A esprimenti cellule di cancro gastrico sono stati etichettati con una soluzione /ml Dil 10 mg per 15 minuti a 37 ° C. Dil è una sonda a fluorescenza comunemente usato che mostra una fluorescenza arancio-rosso in membrane ed è stato utilizzato nel nostro studio per marcare le cellule di cancro gastrico. Queste cellule marcate sono state poi aggiunte ai monostrati di cellule mesoteliali e incubate per 1 ora a 37 ° C. cellule non aderenti sono state rimosse mediante lavaggio, e le cellule che avevano aderito ai monostrati di cellule mesoteliali sono state fissate con 4% paraformaldeide. I vetrini di coltura sono stati montati in Mowiol (Calbiochem) ed esaminati mediante microscopia a fluorescenza (Leica MPS 60)

2.8:. Tumorale delle cellule /mesoteliali cellulare GJIC saggio

Il Cx43- progettato e Cx43T154A esprimono BGC-823 e cellule di cancro gastrico SGC-7901 sono stati etichettati per 15 minuti a 37 ° C con 2 ml di Opti-MEM contenente 10 mg /ml calceina-AM e 10 ug /ml Dil. Calceina-AM è un substrato fluorescente che viene scisso in cellule vitali di una forma di membrana impermeabile che può passare attraverso giunzioni gap funzionali, ma non gli altri canali della membrana plasmatica. monostrati di cellule mesoteliali sono stati pretrattati per 4 h con 150μM carbenoxolone (CBX) per bloccare omotipica GJIC e sono state quindi trattate per 15 minuti con 10 ug /ml calceina-AM (Molecular Probes) in una soluzione Opti-MEM. Le cellule di cancro gastrico marcate ben preparati sono stati aggiunti ai monostrati MET-5A sul Matrigel, e è stato rilevato l'GJIC eterotipica tra le cellule di cancro gastrico e le cellule mesoteliali. recupero di fluorescenza nelle cellule sbiancato si verificherà solo se colorante passa attraverso le giunzioni delle cellule di cancro gastrico greggi adiacenti. Singole cellule mesoteliali adiacenti cellule di cancro gastrico sono stati sbiancati per circa 30 s usando un microscopio confocale a scansione laser Zeiss e un laser ad argon a potenza 33% per ogni condizione sperimentale. cellule mesoteliali singoli che non ha potuto stabilire GJIC sono stati scelti per sottoporsi blenching come controlli. cellule non trattate sono state usate come sfondo modificando le cellule. L'intensità di fluorescenza media di sbiancati cellule /greggi è stata misurata nel tempo utilizzando software di imaging Scion, e il tasso di recupero di fluorescenza è stato calcolato come bene (Kt = (Ib-IB0) /Iu × 100%, Kt: tasso di recupero di fluorescenza al tempo t; Ib: l'intensità di fluorescenza nella cella sbiancata al tempo t; IB0: l'intensità di fluorescenza nella cella sbiancato al tempo t = 0; Iu:. intensità di fluorescenza nella cella greggi adiacente al tempo t) [11]

2.9: migrazione transmesothelial test

Il test di migrazione transmesothelial è stata eseguita, come descritto in precedenza [12]. In breve, 1 × 10 ^{5 cellule mesoteliali Met-5A sono stati seminate su vetrini da 12 mm che sono stati rivestiti con Matrigel (Becton-Dickenson, Stati Uniti d'America). Monostrati raggiunto confluenza come determinato mediante microscopia ottica. Vetrini sono stati trasferiti in un 24-pozzetti e sono state coltivate per 48 ore in EGM. cellule di cancro gastrico sono stati divisi dal gruppo vettore vuoto, gruppo Cx43-esprimere, di gruppo e CBX gruppo pretrattato Cx43T154A esprimono (Cx43-esprimono cellule di cancro gastrico sono stati pretrattati per 4 h con 150μM carbenoxolone (CBX) per bloccare omotipica GJIC) ed etichettato con Dil . Circa 1 × 10 sono stati aggiunti 5 cellule mesoteliali monostrati di cellule con un rapporto di 1:10 (cellule tumorali: cellule mesoteliali). Le cellule sono state co-coltura per tempi diversi (1, 4, o 7 h) prima di vivere osservazione o fissazione e immunocolorazione. investigatori Blinded quantificati diapedesi utilizzando LSM, come descritto in precedenza [7]. In breve, co-colture sono state fissate e colorate per F-actina. Diapedesi stata quantificata come il numero di cellule tumorali che sono state in contatto con mesotelio e classificata in tre fasi secondo la loro posizione rispetto al mesotelio: 1) arrotondato - cellule tumorali con una forma sferica sulla superficie apicale del mesotelio; 2) migrating - cellule tumorali avevano penetrato attraverso i monostrati cellulari mesoteliali a giunzioni cellulari mesoteliali con una porzione del corpo cella sopra mesotelio ed una porzione dello spread corpo cellulare sul Matrigel sotto le cellule mesoteliali fibre di stress F-actina; e 3) sotto - l'intero corpo cellula tumorale era al di sotto del piano delle fibre di stress delle cellule mesoteliali. Migrazione e le cellule sotto sono stati classificati come trasmigrante. Circa 100 cellule mesotelio-aderenti sono stati registrati e dichiarati per vetrino, e tutti gli esperimenti sono stati ripetuti tre volte con lamelle in triplicato}

2.10:. L'analisi statistica

Tutte le analisi statistica è stata effettuata utilizzando il software SPSS ( versione 13.0). Le probabilità di P < 0,05 sono stati considerati statisticamente significativi

Risultati

3.1:. Espressione Cx43 nei tumori primari e metastatici tessuti peritoneali abbinati

Il quarantadue per epiteli normale (100%) ha espresso Cx43 con tipica colorazione membranosa e citoplasmatica (Figura 1A). Undici dei 42 tumori primari (26,2%) sono risultati positivi per Cx43, che è stato notevolmente diminuito rispetto al epiteli normale adiacente (p < 0,05). espressione Cx43 era eterogenea in diversi campioni di tessuto: in tessuti di cancro gastrico ben differenziati, espressione Cx43 ha mostrato un grande colorazione mista (citoplasmatica e membranosa) (Figura 1B); moderatamente differenziati tessuti di cancro gastrico avevano solo citoplasmatica espressione Cx43 (Figura 1C); e Cx43 è stato scarsamente espresso nei tessuti di cancro gastrico scarsamente differenziati (Figura 1D). Al contrario, l'espressione Cx43 era significativamente aumentata in 29 dei 42 tessuti peritoneali metastatici (69,0%) ed espone tipica colorazione citoplasmatica e di membrana (p < 0,05). (Figura 1E) (Tabella 2)
Connessina 43
primaria cancro gastrico (casi) (%)
tessuto normale adiacente (casi) (%)
tessuto metastatico peritoneale (casi) (%)
negativo (score < 3) 31 (73,8%) 0 (0 ) 13 (31,0%) positivo (score≥3) 11 (26,2%) * 42 (100%) 29 (69,0%) † Tabella 2. risultati immunoistochimica Connexin 43 espressione nei tessuti di cancro gastrico primarie, tessuti gastrici normali adiacenti e peritoneale . tessuti metastatici (N = 42)
* Rispetto ai tessuti normali adiacenti, l'espressione della connessina 43 è diminuito in modo significativo (p < 0,05); † Rispetto ai tessuti di cancro gastrico primarie, l'espressione della connessina 43 nel tessuto peritoneale metastatico è aumentato in modo significativo (p < 0,05). CSV Scarica CSV

3.2: espressione Cx43 in espansa cellule di cancro gastrico intra-addominali
esistono

espansa cellule di cancro gastrico La maggior parte intra-addominale come sferoidi multicellulari (Figura 1F). Cx43 positivo immunocolorazione è stata osservata in 35 dei 42 casi di cellule intra-addominali cancro espansa con citoplasmatica misto e colorazione membranosa, e il tasso di positivo è 83,3% (Figura 1 G, H e I).

3.3 : espressione di esogena Cx43 in BGC-823 e cellule di cancro gastrico SGC-7901

cellule di cancro gastrico sono stati progettati per esprimere Cx43 funzionale, Cx43T154A e un vettore lentivirale vuoto come controllo per studiare gli effetti di espressione Cx43 sulla comportamento biologico di queste cellule. espressione Cx43 era assente nel gruppo vettore vuoto, ma gli altri due gruppi ingegnerizzati sono stati rilevati per esprimere sia Cx43 o Cx43T154A (Figura 2A)

3.4. Adesione proprietà delle cellule cancro gastrico per mesothelial celle

l'effetto della Cx43 sull'adesione di cellule di cancro gastrico verso le cellule mesoteliali stato inoltre studiato. cellule di cancro gastrico ingegnerizzate che esprimono sia wild-type Cx43 o Cx43T154A hanno mostrato un aumento significativo in adesione alle cellule mesoteliali rispetto al gruppo vuoto vettore (P < 0,05). Non sono state osservate differenze significative nella capacità di adesione tra Cx43- e gruppi Cx43T154A esprimono (P > 0,05), suggerendo che Cx43 promuove l'adesione delle cellule del cancro gastrico, che è indipendente GJIC (Figura 2B)

3.5: ingegnerizzati. cellule che esprimono Cx43-BGC-823 e SGC-7901 forma funzionale canali gap junction con monostrati di cellule mesoteliali

co-coltura ingegnerizzato Cx43- e Cx43T154A esprimenti cellule di cancro gastrico con monostrati di cellule mesoteliali di esaminare la possibilità di Cx43 esprimente le cellule a formare giunzioni e stabilire GJIC con le cellule mesoteliali. I risultati mostrano che le cellule di cancro gastrico in entrambi gruppo vettore vuoto o il gruppo Cx43T154A non è riuscito a stabilire con GJIC adiacenti cellule mesoteliali peritoneali dopo lo sbiancamento laser, mentre il gruppo Cx43 che esprimono è stato in grado di stabilire GJIC con cellule mesoteliali peritoneali con successo. L'intensità della fluorescenza intracellulare è stata rilevata prima candeggio, nell'istante di sbianca, e sia 1 min, 2 min, 3 minuti o 4 minuti dopo lo sbiancamento. I risultati mostrano che, in Cx43 esprimenti gruppo, l'intensità di fluorescenza intracellulare di cellule mesoteliali sbiancato diminuita rapidamente dopo candeggio. intensità di fluorescenza poi gradualmente recuperato a causa di tingere il passaggio attraverso giunzioni gap con cellule di cancro gastrico greggi adiacenti, e il tasso di recupero di fluorescenza media era di 35,6 ± 0,9% e 39,4 ± 0,8% a 4 minuti dopo blenching in BGC-823 e le cellule SGC-7901, rispettivamente, che era significativamente più alta rispetto a quella in Cx43T154A e gruppo vuoto vetor (p < 0,05). (Figura 3, Tabella 3)
gruppo
Significa tasso di recupero di fluorescenza (%, x
± s ) (t=4min)
BGC-823Cx4335.6±0.9*BGC-823Cx43T154A12.1±0.6BGC-823v13.4±0.7SGC-7901Cx4339.4±0.8†SGC-7901Cx43T154A15.3±0.4SGC-7901v14.7±0.6Table 3. Il confronto dei tassi di recupero di fluorescenza media dopo lo sbiancamento in BGC-823 e le cellule SGC-7901 cancro gastrico (intensità di fluorescenza, x
± s)
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3.6:. Valutazione morfologica di cellule tumorali diapedesi

Abbiamo stabilito un in vitro
sistema per immagini la migrazione transmesothelial di cellule di cancro gastrico per indagare il meccanismo e la via di diapedesi. Questo imita saggio aspetti della parete del vaso ed è stato utilizzato in precedenza per analizzare leucociti diapedesi [11]. cellule tumorali Dil-marcati sono stati valutati in base alla loro morfologia e la posizione rispetto al mesotelio. Abbiamo definito tre fasi distinte della migrazione usando la microscopia confocale: arrotondato (Figura 4A); migrazione (Figura 4E); e sotto (Figura 4E). Le cellule tumorali sulla parte superiore del mesotelio prima di diapedesi mostrato una forma rotonda o ovulare, e questo forma è stata mantenuta dalla apicale (Figura 4B) per la superficie basale (Figura 4C, D). Migrazione cellule tumorali che passano tra le cellule mesoteliali adiacenti cambiato forma da ovoidale a un lungo fuso con intracellulare F-actina assemblati in fasci di filamenti di actina (Figura 4F, G, H). Le cellule tumorali che hanno completato diapedesi erano situati completamente sotto il mesotelio. La forma delle cellule gradualmente cambiato dal lungo fuso alla forma rotonda, e le intracellulari filamenti di F-actina progressivamente esteso e sono state un poco disposta tra i filamenti (figura 4J, K, L). Il nostro studio ha rivelato che diapedesi cellule di cancro gastrico 'avvenuta attraverso un percorso paracellulare

3.7:. Cx43-mediata GJIC migliorato cellule di cancro gastrico diapedesi

co-coltura Cx43-, Cx43T154A esprimono cancro gasric cellule e CBX pretrattate Cx43-cellule che esprimono con cellule mesoteliali per 1, 4 e 7 h per confrontare la loro efficienza diapedesi [1,2]. Queste cellule sono state valutato con i criteri descritti per la migrazione. La percentuale di migrazione delle cellule Cx43T154A e CBX pretrattati non erano significativamente differenti per le cellule di gruppo vettore vuote dopo 7 ore di co-coltura (p > 0,05), ma l'efficienza diapedesi delle cellule del gruppo Cx43 esprimono era significativamente più alta rispetto agli altri tre gruppi (p <0,05) (Figura 5). Questi risultati suggeriscono che la presenza della proteina Cx43 nella sola cellula tumorale non è responsabile per l'aumento osservato in diapedesis, ma è necessario che GJIC heterocellular tra cellule tumorali e cellule mesoteliali per aumentare l'efficienza di diapedesi per cellule di cancro gastrico. Questi risultati suggeriscono che Cx43 facilita GJIC-dipendente diapedesi delle cellule tumorali.

Discussione

giunzioni e subunità connessine sono inibiti in vari tumori [4,13,1,4]. Tuttavia, recenti rapporti indicano che l'espressione connessine 'non è sempre mantenuta a diminuzione dei livelli durante la progressione tumorale; al contrario, possono essere presenti durante le fasi successive di carcinogenesi, aumentando la capacità migrazione delle cellule invasive [2,15-11,7]. Questo riemergere di connessine è chiaramente osservato durante la progressione del cancro al seno umano, dove tumori primari Cx26- e Cx43-negativi sviluppati Cx26- e metastasi Cx43-positive nei linfonodi [18,1,9]. Risultati simili sono stati ottenuti anche nel topo carcinogenesi della pelle; espressione CX26 è ridotta durante le prime fasi della carcinogenesi, ma viene ripristinato nei linfonodi metastatici [20]. Questi studi implicano che connessine giocano ruoli diversi durante il processo di carcinogenesi. Il nostro studio era la prima volta per esaminare l'espressione di Cx43 durante le diverse fasi della progressione del cancro gastrico (tessuti di cancro gastrico primarie, cellule di cancro gastrico espansa intra-addominali e tessuti peritoneali metastatico abbinati). I risultati mostrano una significativa diminuzione dell'espressione Cx43 in tessuti di cancro gastrico primarie rispetto ai tessuti normali gastriche adiacenti (p < 0,05). Al contrario, l'espressione Cx43 in espansa cellule di cancro gastrico intra-addominali e tessuti peritoneali metastatici è risultata significativamente aumentata. Questi risultati suggeriscono che Cx43 molto probabilmente svolge un ruolo importante nella metastasi peritoneali.

Per esplorare se l'espressione Cx43 ha un effetto sulla metastasi peritoneali, Cx43 è stato trasfettato in BGC-823 e cellule di cancro gastrico SGC-7901, e un Cx43T154A sito di mutazione è stato costruito per determinare il ruolo della comunicazione gap giunzionale nel processo di metastasi peritoneale. Adesione e diapedesi delle cellule tumorali ai monostrati di cellule mesoteliali sono due fasi critiche per la formazione di metastasi peritoneale. Un in vitro
adesione cellulare ha rivelato che le cellule Cx43- e Cx43T154A esprimono BGC-823 e SGC-7901 esposti adesione più efficiente per i monostrati di cellule mesoteliali che cellule vuoto vettore e che l'efficienza di adesione Cx43T154A esprimono cellule tumorali era simile alle cellule che esprimono Cx43-. Questi risultati suggeriscono che Cx43 promuove l'adesione delle cellule di cancro gastrico per mesoteliali cellule, che è indipendente dalla comunicazione gap junction. Per quanto riguarda il suo meccanismo correlato, il nostro studio precedente aveva indicato che Cx43 può interagire con proteine ​​di adesione associate cellulari, come ad esempio E-caderina, partecipare al processo di adesione [21], che può proporre un ruolo positivo di espressione Cx43 in aumento adesione cellulare.

La diapedesi delle cellule di cancro gastrico attraverso monostrati di cellule mesoteliali in vitro
è stato ulteriormente indagato nei nostri esperimenti. Il nostro studio ha rivelato che la diapedesi di Cx43 che esprimono cellule gastriche è stato significativamente migliorato rispetto a cellule Cx43T154A-esprimono, il che suggerisce che l'espressione Cx43 colpito la motilità cellulare, che era coerente con diversi precedenti relazioni [2, 14, 22, e 23]. Tuttavia, resta da chiarire se l'espressione Cx43 è stato associato con la comunicazione intercellulare. Abbiamo poi esplorato se GJIC gioca un ruolo fondamentale nella diapedesi. In primo luogo, abbiamo esaminato la GJIC tra le cellule di cancro gastrico e le cellule mesoteliali peritoneali. I risultati hanno dimostrato che Cx43-esprimendo cellule di cancro gastrico istituito un GJIC eterotipica efficace con cellule mesoteliali peritoneali; Tuttavia, le cellule che esprimono Cx43T154A-non è riuscito a stabilire GJIC, come è stato considerato prima [10].

Cx43- e Cx43T154A esprimenti cellule gastriche sono stati aggiunti al mesoteliali monostrati cellulari e durante la notte co-coltura (non più di 12 ore ) per confermare ulteriormente il ruolo del GJIC nella trasmigrazione delle cellule di cancro gastrico attraverso i peritoneali monostrati di cellule mesoteliali. Gastrico diapedesi delle cellule del cancro è stata esaminata mediante scansione laser microscopia confocale. I nostri risultati hanno rivelato che Cx43-esprimendo cellule di cancro gastrico esposto migrazione più efficiente attraverso i monostrati di cellule mesoteliali che Cx43T154A e le cellule di gruppo vettore vuoto, mentre l'efficienza diapedesi delle cellule tumorali in questi ultimi due gruppi non era significativamente diversa, suggerendo che la GJIC heterocellular tra tumore e cellule mesoteliali è necessario rafforzare la diapedesi. Per comprendere il ruolo centrale del GJIC nella diapedesi delle cellule di cancro gastrico attraverso gli strati di cellule mesoteliali, abbiamo cercato di precedenti studi che hanno chiarito i meccanismi coinvolti nella diapedesi delle cellule tumorali attraverso strati di cellule endoteliali. Questi studi hanno indicato che le cellule tumorali possono inviare segnali al endotelio, come inositolo trifosfato (IP3), attraverso giunzioni per regolare i livelli di calcio intracellulare. Elevati livelli di calcio intracellulare transitoriamente fosforilano la catena leggera della miosina per aumentare la permeabilità endoteliale. Le cellule endoteliali possono anche inviare segnali alle cellule tumorali attraverso giunzioni a upregulate proteine ​​della motilità cellulare, come ad esempio Rho GTPasi, proteina chinasi C, e phosphoinositide-3 chinasi [24-22,7]. Questi risultati possono aiutare a chiarire il meccanismo di come GJIC svolge un ruolo fondamentale durante la diapedesi delle cellule di cancro gastrico.

Tenendo conto dei risultati di questo studio e di scoperte recenti, ci suggeriscono che giunzioni Cx43-mediate svolgono un ruolo attivo nella metastasi peritoneale di cellule di cancro gastrico. I nostri risultati supportano l'ipotesi che heterocellular giunti gap-giunzionale tra le cellule di cancro gastrico e il mesotelio regola la trasmigrazione delle cellule di cancro gastrico per i peritoneali monostrati di cellule mesoteliali. trasmigrazione cellule di cancro gastrico 'attraverso la barriera mesothelial avvenuta tramite la migrazione paracellular.

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