PLOS ONE: onormalt uttryck av Cx43 förknippas med peritonealdialys metastasering av Gastric Cancer och Cx43-medierad Gap Junction Förbättrar Gastric Cancer Cell diapedes från Peritoneal Mesothelium

Abstrakt

Processen för peritoneal metastas innebär diapedes av intra -abdominal exfolierade gastric cancerceller genom mesotelceller mono; Men tillhörande molekylära mekanismerna för denna process är fortfarande oklart. Heterocellular gap-förbindelse kommunikationen mellan (GJIC) mellan gastric cancerceller och mesotelceller kan spela en aktiv roll under diapedes. I denna studie upptäckte vi uttrycket av connexin 43 (Cx43) i primära magsäckscancer vävnader, intraabdominella exfolierade cancerceller, och matchade metastaserande peritoneala vävnader. Vi fann att uttrycket av Cx43 i primära magcancer vävnader var signifikant minskat; de intraabdominella Expanderad cancerceller och matchade metastaser peritoneala vävnader uppvisade ökande uttryck jämfört med primära magsäckscancer vävnader. BGC-823 och SGC-7901 humana gastriska cancerceller konstruerades för att uttrycka Cx43 eller Cx43T154A (en mutant protein som endast par gap-junctions men ger ingen kommunikationen mellan) och samodlades med humana peritoneala mesotelceller (HPMC). Heterocellular GJIC och diapedes genom HPMC monolager på Matrigel-belagda täck undersöktes. Vi fann att BGC-823 och SGC-7901 gastric cancerceller som uttrycker Cx43 bildade funktionella heterocellular gap junctions med HPMC monolager inom en timme. En betydande ökning av diapedes observerades i manipulerade Cx43-uttryckande celler jämfört med Cx43T154A och kontrollgruppen celler, som tydde på att den observerade uppreglering av diapedes i Cx43-uttryckande celler som krävs heterocellular GJIC. Ytterligare studier visade att de gastric cancerceller transmigrated genom det intercellulära utrymmet mellan mesotelcellerna via en paracellulär väg. Våra resultat tyder på att onormalt uttryck av Cx43 spelar en viktig roll i peritoneal metastas och att Cx43-medierad heterocellular GJIC mellan gastric cancerceller och mesotelceller kan vara en viktig reglerande steg under metastas. Slutligen konstaterade vi att diapedes av exfolierad gastric cancerceller genom mesothelial hinder är en framkomlig väg för paracellulär migration

Citation. Tang B, Peng Zh, Yu PW, Yu G, Qian F, Zeng Dz, et al. (2013) onormalt uttryck av Cx43 förknippas med peritonealdialys metastasering av Gastric Cancer och Cx43-medierad Gap Junction Förbättrar Gastric Cancer Cell diapedes från Peritoneal Mesothelium. PLoS ONE 8 (9): e74527. doi: 10.1371 /journal.pone.0074527

Redaktör: Johanna M Brandner, Universitetssjukhuset Hamburg-Eppendorf, Tyskland

emottagen: 19 januari 2013; Accepteras: 6 augusti 2013; Publicerad: 11 September, 2013

Copyright: © 2013 Tang et al. Detta är en öppen tillgång artikel distribueras enligt villkoren i Creative Commons Attribution License, som tillåter obegränsad användning, distribution och reproduktion i alla medier, förutsatt den ursprungliga författaren och källan kredit

Finansiering:. Detta arbete stöddes av bidrag nr 30801097 och nr 81272366 från National Natural Science Foundation i Kina. Finansiärerna hade ingen roll i studiedesign, datainsamling och analys, beslut att publicera, eller beredning av manuskriptet

Konkurrerande intressen:.. Författarna har förklarat att inga konkurrerande intressen finns

Introduktion

förekomsten av magcancer minskar men är fortfarande en viktig orsak till cancerrelaterad död i hela världen. De dominerande inslag i gastric cancerceller inkluderar deras invasiva och metastatiska kapacitet. Peritoneal metastaser är en kritisk funktion för tumörprogression hos avancerad magsäckscancer [1]. Under processen av peritoneal metastas, gastric cancerceller samverkar intercellularly med flera celltyper, och samverkan mellan de intraabdominella exfolierade gastric cancerceller och de peritoneala mesotelcellerna är av särskild betydelse. Som kontinuerlig mänsklig peritoneal mesotelceller (HPMC) monolager fungerar som en barriär mot peritoneal metastas, när diapedes av exfolierad gastric cancerceller genom mesothelial cellmonoskikt inträffar kommer den rikliga blodtillförseln i matrisen under mesothelium erbjuder en bekväm miljö för magsäcks cancerceller och främja deras kolonisering. Därför är diapedes av exfolierad gastric cancerceller genom mesothelial cellmonoskiktet ett viktigt steg under peritoneal metastas. Interaktionen mellan dessa celler åtföljs av intercellulär kommunikation (IC), som till övervägande del medieras av cell-cell-kanalförbindelser [2]. Kanalförbindelser bildas genom plasmamembran connexiner, vilka var och en bestod av sex connexiner (CXS) [3]. Hittills har 20 olika connexin isoformer har identifierats hos människa. Cx43 är en allmän isoform uttryckt i de flesta epitelvävnader. Tidigare studier [4-6] indikerade att Cx43 uttryck minskade under tumörbildning och därför klassas som en tumörsuppressor. Det finns dock en växande mängd bevis för att connexiner kan vara inblandade i intravasering och extravasering av cancerceller och spela en positiv roll i processen för metastaser [7,8]. Huruvida Cx43 medierad gap junction spelar en viktig roll i diapedes av gastric cancerceller genom peritoneal mesothelial barriären är fortfarande oklart. För att ta itu hypotesen undersökte vi uttrycket av Cx43 i primära gastriska cancervävnader, exfolierad gastric cancerceller, och peritoneala metastatiska vävnader. Vi konstruerade en Cx43-uttryckande vektor och en Cx43T154A plats mutation vektor. Sedan använde vi två humana magcancer-cellinjer (BGC-823 och SGC-7901) som är GJIC bristfällig och inte uttrycker några kända connexiner [9]. Eftersom mesotelceller uttrycker rikligt Cx43, konstruerade vi gastric cancerceller för att uttrycka antingen vildtyp Cx43 eller en platsspecifik mutant för att avgöra om potentialen för magcancer cellernas diapedes genom mesothelium skulle förändras under båda eller något av dessa villkor. I denna studie visar vi att Cx43 uttryck uppreglerar tumörcell diapedes via en GJIC-beroende mekanism

Material och metoder

2,1:. Reagens och antikroppar

Anti-connexin 43 polyklonala antikropp (Zymed, San Diego, CA, USA), Matrigel (Becton-Dickenson, Bedford, MA, USA), 1, 1'-diocta-decyl-3, 3, 3 ', 3'-tetramethylindocarbocyanine percholate (Dil; Molecular prober, Eugene, OR, USA), Calcein-AM (Dojindo, Kumamoto, Japan) och FITC-konjugerat falloidin köptes från Sigma (Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA).

2,2 : Vävnadsprover prover~~POS=HEADCOMP och cytologisk undersökning

Alla deltagare lämnade skriftliga informerat samtycke (från deras vårdnadshavare vid behov). Studien genomfördes i enlighet med principen om Helsingforsdeklarationen och dess ändringar och godkändes av den etiska kommittén Egentliga sjukhus, den tredje militära Medical University. Studiepopulationen bestod av 42 patienter som klassificerats som steg IV enligt den sjunde upplagan av UICC TNM klassificering av maligna tumörer. Clinicopathologic variabler listas i Tabell 1. Samtliga patienter som ingick i vår studie genomgick palliativ eller undersökande operation. Primär tumör och metastatiska peritoneala vävnader uppsamlades före slutet av kirurgi, och exfolierad gastriska cancerceller skördades genom centrifugering av ascites eller peritoneal lavage (om ascites inte existerade). Den kärnförsedd cellskiktet var smort på en glasskiva och färgades med hematoxylin och eosin (HE). Två erfarna cytopathologists utförde cytologiska utvärderingar. CEA användes som en biomarkör för att hjälpa till att identifiera adenokarcinomceller genom immunofluorescens med positiv färgning. Fall uteslöts från denna studie när resultaten från båda cytopathologists inte var överens
grupp
Number
procent (%) Review Sex male2764.0 female1536.0Age (år) <. 501740,4 ≥502559.6Tumor läge Antral2150.0 Body1228.6 Fundic911.4Pathological typ Väl differentiated24.7 Måttligt differentiated49.5 Poorly differentiated3685.8Bormann skriva I00 II12.4 III1228.5 IV2969.1Ascites Yes1535.7 No2764.3Surgical tillvägagångssätt palliativ gastrectomy2457.1 explorativ + biopsy1842.9Table 1. Kliniska och patologiska egenskaperna hos 42 fall av patienter med magsäckscancer sälja CSV Ladda ner CSV

2,3. Immunohistokemi

Paraffinvävnadsprover av primära tumörer och metastaser peritoneala vävnader seriellt sektion och HE-färgning bekräftat förekomsten av magcancer. På varandra följande sektioner avparaffinerades, dehydratiseras, och utsattes för antigenåtervinning i sekvens. Sektionerna inkuberades med en kanin polyklonal anti-Cx43-antikropp under 24 timmar vid 4 ° C. Bindningsställen visualiserades med 3, 3'-diamino-bensidin (DAB) i en 5-min reaktion. Sektionerna motfärgades med Mayers hematoxylin, dehydratiserades, rensas och monteras. Utelämnande av den primära antikroppen användes som en negativ kontroll. Immunhistokemisk färgning utvärderades genom att tilldela en summa baserad på omfattningen och intensiteten av immunreaktivitet. Färgning utsträckning utvärderades semikvantitativt i cytoplasman och membranet som negativ (0 < 5% celler färgas), positiva 1 + (6-25% celler färgade), positiva 2 + (26-50% celler färgade) eller positiv 3 + ( > 50% celler färgas). Färgningsintensiteten poängsattes som 0 (ingen färgning), en (svag färgning, gul brun), 2 (måttlig färgning, gulbrun), eller 3 (stark färgning, brun). . Immunfärgning resultat bedömdes som summan av omfattningen och intensiteten av immunreaktivitet, med tanke på en poäng ≥3 positiv och en poäng < 3 negativa

2,4: Immunofluorescens

Cx43 uttryck i intraabdominell exfolierade gastric cancerceller bedömdes med hjälp av immunofluorescens. Fyrtiotvå fall inkluderades i vår studie. Cellerna smort på glastäck fixerades med 4% paraformaldehyd och tvättades med PBS innehållande 0,5% BSA (sköljbuffert). Cellerna inkuberades sedan under 24 timmar vid 4 ° C med en anti-Cx43-antikropp (1: 150). Täckglasen tvättades och inkuberades med FITC-konjugerad get-anti-kanin sekundär antikropp. Kärnorna färgades med användning av 10 | ig /ml DAPI (Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA). Täckglasen avbildas med ett fluorescensmikroskop (Siemens, Tyskland). Kontrollerna (primära antikroppar ersattes av PBS) var negativa för alla experiment (data ej visade) katalog

2,5. Cellodling och stabilt uttryck av Cx43 och Cx43 mutanter

icke-maligna mänsklig förevigat mesotelceller , Met-5A, erhölls från ATCC. Dessa celler upprätthölls och förökades i medium 199 innehållande 1,5 g /L natriumbikarbonat, 10% fetalt bovint serum, 3,3 nM epidermal tillväxtfaktor (EGF), 400 nM hydrokortison, 870 nM zinkfritt bovint insulin, 20 mM HEPES och 3,87 ug /L selensyrlighet (H2SeO3).

de humana magcancer-cellinjer BGC-823 och SGC-7901 erhölls från Shanghai Institute cellbank, Chinese Academy of Science. Cx43- och Cx43T154A-uttryckande vektorer konstruerades med användning av Lentiviral infektion. PTA2-Cx43, som innehöll en human Cx43-sekvensen, konstruerades i vårt laboratorium. Den Cx43T154A site mutation vektorkonstruktion åstadkoms med användning overlap extension PCR, vilken kodade för ett protein som fungerade som ett gap junction utan IC såsom beskrivits tidigare [10]. CDNA av Cx43 och Cx43T154A sattes in i Lenti-GFP-vektorn och transfekterades in i 293T packande cellinjen. Lentiviral Supernatanten uppsamlades efter 48 h, filtrerades genom en 0,45-pm filter och användes för att infektera BGC-823 och SGC-7901-celler. Ersattes mediet med RPMI1640 24 timmar efter infektion, och cellerna odlades rutinmässigt. Mer än 90% av tumörcellerna uttryckta Cx43 eller Cx43T154A efter tre omgångar av viral infektion; de framgångsrikt infekterade cellerna uppsamlades genom flödescytometri

2,6:. Protein extraktion och Western blot-analys

De manipulerade Cx43- och Cx43T154A-uttryck BGC-823 och SGC-7901 gastriska cancerceller lyserades . Protein (50 | ig) från varje celltyp separerades i en 12% SDS-polyakrylamidgel och överfördes till nitrocellulosamembran. Nitrocellulosamembran blockerades med 5% fettfri torrmjölk och sonderades sedan för Cx43-protein med användning av en polyklonal anti-Cx43-antikropp (1: 500). Immunoblots sonderades med de lämpliga pepparrotsperoxidaskonjugerad sekundära antikroppar (Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA) vid en 1: 10000 utspädning. Proteinerna visualiserades med användning av en supersignalen West Pico kemiluminiscent substrat (Pierce Chemical Co.) och immunoblottar exponerades för Amersham Hyperfilm (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ, USA) under 30 s

2,7:. Tumörcell /mesotelceller celladhesionsanalys

mesotelceller fick växa tills monoskiktet flyter samman på glastäckglas i 24-brunnsplattor. Den konstruerade Cx43- och Cx43T154A-uttryckande gastriska cancerceller märktes med en 10 | j, g /ml Dil lösning under 15 min vid 37 ° C. Dil är ett vanligt använt fluorescens sond som visar en orange-röd fluorescens i membran och användes i vår studie för att märka gastriska cancerceller. Dessa märkta cellerna sattes därefter till mesothelial cellmonoskikten och inkuberas under 1 h vid 37 ° C. Icke-vidhäftande celler avlägsnades genom tvättning, och de celler som hade vidhäftade mesothelial cellmonoskikten fixerades med 4% paraformaldehyd. Odlingsglasen monterades i Mowiol (Calbiochem) och undersöktes med användning av fluorescensmikroskopi (Leica MPS 60) katalog

2,8. Tumör Cell /mesotelceller GJIC analys

konstruerad Cx43- och Cx43T154A-uttryckande BGC-823 och SGC-7901 gastriska cancerceller märktes under 15 minuter vid 37 ° C med 2 ml Opti-MEM innehållande 10 ^ g /ml kalcein-AM och 10 | ig /ml Dil. Kalcein-AM är en fluorescerande substrat som klyvs i levande celler till en membran ogenomtränglig form som kan passera genom funktionella gap-junctions men inte andra plasmamembrankanaler. Mesotelceller från cellmonoskikt förbehandlades under 4 h med 150 ^ m karbenoxolon (CBX) för att blockera homotypisk GJIC och behandlades därefter under 15 minuter med 10 | j, g /ml kalcein-AM (Molecular Probes) i ett Opti-MEM-lösning. De väl förberedda märkta gastric cancerceller sattes till Met-5A monolager på Matrigel och hetero GJIC mellan gastric cancerceller och mesotelcellerna upptäcktes. Fluorescens återhämtning i blekta celler kommer endast att ske om färgen passerar genom gap junctions i angränsande oblekta gastric cancerceller. Individuella mesotelceller intill gastric cancerceller blektes under ca 30 s med hjälp av en Zeiss laserskanning konfokalmikroskop och en argonlaser vid 33% effekt för varje experimentell skick. Enstaka mesotelceller som inte kunde etablera GJIC valdes för att genomgå blenching som kontroller. Obehandlade celler användes som bakgrunds modifiera celler. Den genomsnittliga fluorescensintensiteten av blekta /oblekta celler mättes över tid med hjälp av Scion bildbehandlingsprogram, och fluorescens återhämtning beräknades samt (Kt = (Ib-Ib0) /Iu × 100%, KT: fluorescens återvinningsgraden vid tiden t; Ib: fluorescensintensiteten i den blekta cellen vid tiden t; Ib0: fluorescensintensiteten i den blekta cellen vid tiden t = 0; Iu:. fluorescensintensiteten i den intilliggande oblekt cellen vid tidpunkten t) [11]

2,9: transmesothelial migration analys

transmesothelial migration utfördes, såsom beskrivits tidigare [12]. I korthet, 1 x 10 ^{5 Met-5A mesotelceller såddes på 12-mm täckglas som var belagda med Matrigel (Becton-Dickenson, USA). Monolager nådde konfluens bestämd med ljusmikroskop. Täckglas överfördes till en 24-brunnars platta och odlades under 48 h i EGM. Gastric cancerceller delades av tom vektor grupp, Cx43-uttryckande grupp, Cx43T154A-uttryckande grupp och CBX förbehandlat grupp (var Cx43-uttryckande gastriska cancerceller förbehandlade under 4 timmar med 150 ^ m karbenoxolon (CBX) för att blockera homotypisk GJIC) och märkt med Dil . Ca 1 × 10 5 celler sattes till mesotelceller cellmonoskikt i ett förhållande av 01:10 (tumörcell: mesotelcell). Cellerna samodlades för olika tidpunkter (1, 4, eller 7 h) Innan leva observation eller fixering och immunfärgning. Förblindade utredare kvantifieras diapedes använder LSM, som beskrivits tidigare [7]. Kortfattat, co-kulturer fixeras och färgas för F-aktin. Diapedes kvantifierades som antalet tumörceller som var i kontakt med mesothelium och klassificeras i tre steg i enlighet med deras position i förhållande till mesothelium: 1) avrundat - tumörceller med en sfärisk form på den apikala ytan av mesothelium; 2) migrating - tumörceller hade trängt igenom mesothelial cellmonoskikt vid mesothelial cellkontakter med en del av cellkroppen ovanför mesothelium och en del av cellkroppen sprids på Matrigel under mesotelcellen F-aktin spänningsfibrer; och 3) undertill - hela tumören cellkroppen var under planet för mesothelial cellstress fibrer. Migrera och nedanför celler klassificerades som transmigrating. Cirka 100 mesothelium-adherenta celler registrerades och räknades per täckglas, och alla experiment upprepades tre gånger med trippeltäck}

2,10:. Statistisk analys

All statistisk analys utfördes med användning av SPSS ( version 13.0). Sannolikheterna P < 0,05 ansågs statistiskt signifikant

Resultat

3,1. Cx43-uttryck i primära tumörer och matchade metastaserande peritoneala vävnader

Fyrtiotvå normal epitel (100%) uttryckte Cx43 med typiska membranös och cytoplasmisk färgning (Figur 1A). Elva av 42 primära tumörer (26,2%) var positiva för Cx43, vilket avsevärt minskade jämfört med intilliggande normal epitel (p < 0,05). Cx43 uttryck var heterogen i olika vävnadsprover: i väl differentierade magcancer vävnader, Cx43 uttryck visade en stor blandad (cytoplasma och membranös) färgning (Figur 1B); måttligt differentierade gastric cancervävnader hade endast cytoplasma Cx43 uttryck (Figur 1C); och Cx43 var knappast uttryckas i dåligt differentierade magsäckscancer vävnader (figur 1D). Däremot var Cx43 uttryck signifikant förhöjd i 29 av de 42 metastatiska peritoneala vävnader (69,0%) och uppvisade typisk cytoplasmisk och membranfärgning (p < 0,05). (Figur 1E) (tabell 2)
Connexin 43
Primär magcancer (fall) (%) Review Intill normal vävnad (fall) (%) katalog metastaserad peritoneal vävnad (fall) (%) Review Negativ (poäng < 3) 31 (73,8%) 0 (0 ) 13 (31,0%) Positiv (score≥3) 11 (26,2%) * 42 (100%) 29 (69,0%) † Tabell 2. immunohistokemi resultat Connexin 43 uttryck i primära magcancer vävnader angränsande normala mag vävnader och peritonealdialys . metastatiska vävnader (N = 42) katalog * Jämfört med intilliggande normala vävnader, uttrycket av connexin 43 signifikant minskade (p 0,05); † Jämfört med primära magcancer vävnader, uttrycket av connexin 43 i metastatisk peritoneal vävnad ökade signifikant (p < 0,05). CSV Ladda ner CSV

3,2: Cx43 uttryck i intraabdominella exfolierade gastric cancerceller

De flesta intraabdominella exfolierade gastric cancerceller förekommer som flercelliga sfäroider (figur 1F). Positiva Cx43 immunfärgning observerades i 35 av de 42 fallen av intraabdominella Expanderad cancerceller med blandade cytoplasmisk och membranfärgningen, och den positiva hastigheten är 83,3% (figur 1 G, H och I).

3,3 : expression av exogent Cx43 i BGC-823 och SGC-7901 gastric cancerceller

gastric cancerceller konstruerades för att uttrycka funktionella Cx43, Cx43T154A och en tom lentivirusvektor som en kontroll för att undersöka effekterna av Cx43 uttryck på biologiska beteendet hos dessa celler. Cx43 uttryck var frånvarande i den tomma vektorgrupp, men de andra två manipulerade grupper upptäcktes att uttrycka antingen Cx43 eller Cx43T154A (Figur 2A) Review

3,4. Vidhäftningsegenskaper av Gastric cancerceller att mesotelceller

effekten av Cx43 på adhesionen av gastriska cancerceller för mesotelcellerna undersöktes också. Engineered gastriska cancerceller som uttrycker antingen vildtyp Cx43 eller Cx43T154A uppvisade en signifikant ökning i vidhäftning till mesotelceller jämfört med tom vektor (P < 0,05). Inga signifikanta skillnader i vidhäftning förmåga observerades mellan Cx43- och Cx43T154A-uttryckande grupper (P > 0,05), vilket tyder på att Cx43 främjar magcancer celladhesion, som är oberoende av GJIC (Figur 2B) Review

3,5: Konstruerad. Cx43-uttryck BGC-823 och SGC-7901 celler bildar funktionella gap junction kanaler med mesothelial cellmonoskikt

Vi samodlas konstruerad Cx43- och Cx43T154A-uttryckande gastriska cancerceller med mesotelceller monolager att undersöka förmågan hos Cx43 uttryckande celler för att bilda gap junctions och etablera GJIC med mesotelceller. Resultaten visar att gastric cancerceller i antingen tom vektor gruppen eller Cx43T154A gruppen misslyckats med att etablera GJIC med intilliggande peritoneala mesotelceller efter laser blekning, medan Cx43-uttryckande grupp kunde etablera GJIC med peritoneala mesotelceller framgångsrikt. Den intracellulära fluorescensintensiteten detekterades före blekning, i det ögonblick då blekningen, och antingen 1 min, 2 min, 3 minuter och 4 minuter efter blekning. Resultaten visar att, i Cx43-uttryckande grupp, den intracellulära fluorescensintensiteten hos blekt mesotelcell minskade snabbt efter blekning. Fluorescensintensitet sedan gradvis återställa pga att färga passage genom gap junctions med angränsande oblekta gastric cancerceller, och den genomsnittliga fluorescens återvinningsgraden var 35,6 ± 0,9% och 39,4 ± 0,8% vid 4 min efter blenching i BGC-823 och SGC-7901 celler respektive, vilket var betydligt högre än den i Cx43T154A och tomma vetor gruppen (p < 0,05). (Figur 3, Tabell 3) katalog Group
Genomsnittlig fluorescens återvinningsgrad (%, x
± s ) (t=4min)
BGC-823Cx4335.6±0.9*BGC-823Cx43T154A12.1±0.6BGC-823v13.4±0.7SGC-7901Cx4339.4±0.8†SGC-7901Cx43T154A15.3±0.4SGC-7901v14.7±0.6Table 3. Jämförelse av genomsnittlig fluorescensåtervinningsnivåer efter blekning i BGC-823 och SGC-7901 gastriska cancerceller (fluorescensintensiteten, x
± s) katalog CSV Ladda ner CSV

3,6. Morfologisk bedömning av tumörcell diapedes

Vi etablerade en in vitro
systemet att avbilda transmesothelial migration av gastric cancerceller för att undersöka mekanismen och vägen diapedes. Denna analys härmar aspekter av kärlväggen och har tidigare använts för att analysera leukocyt diapedes [11]. Dil-märkta tumörceller räknades enligt deras morfologi och placering med avseende på mesothelium. Vi definierade tre distinkta stadier av migration med hjälp av konfokalmikroskopi: rundad (Figur 4A); migrerar (Figur 4E); och under (figur 4I). Tumörceller ovanpå mesothelium före diapedes uppvisade en rund eller ovular form, och denna form upprätthölls från den apikala (figur 4B) till grundytan (Figur 4C, D). Migrerar tumörceller som passerar mellan intilliggande mesotelceller ändrade form från ovular till en lång spindel med intracellulärt F-aktin monteras aktin filamentknippen (figur 4F, G, H). Tumörcellerna som avslutade diapedes belägna helt under mesothelium. Cellformen förändrades gradvis från den långa spindeln till den rundare form och de intracellulära F-aktinfilament gradvis utvidgas och var ett glest anordnat mellan filamenten (figur 4J, K, L). Vår studie visar att gastric cancerceller "diapedes skett via en paracellulär väg

3,7. Cx43-medierad GJIC förbättrade gastric cancerceller diapedes

Vi samodlas Cx43-, Cx43T154A-uttryck gasric cancer celler och CBX förbehandlade Cx43-uttryckande celler med mesotelceller för 1, 4 och 7 timmar för att jämföra deras diapedes effektivitet [1,2]. Dessa celler värderade med hjälp av de beskrivna kriterierna för migration. Den procentuella andelen migrera Cx43T154A och CBX förbehandlade celler skilde sig inte signifikant till tomma vektorgrupp celler efter 7 h av samodling (p > 0,05), men den diapedes effektivitet Cx43-uttryckande grupp-celler var betydligt högre än andra tre grupperna (p <0,05) (Figur 5). Dessa resultat tyder på att närvaron av Cx43-protein i tumörcellen ensam inte är ansvarig för den observerade ökningen av diapedes, men att heterocellular GJIC mellan tumörceller och mesotelceller krävs för att öka effektiviteten i diapedes för gastriska cancerceller. Dessa resultat tyder på att Cx43 underlättar GJIC-beroende tumörcell diapedes.

Diskussion

Gap korsningar och connexin subenheter nedregleras i olika cancerformer [4,13,1,4]. Men senaste rapporterna tyder på att connexiner "uttryck inte alltid bibehålls på minskade nivåer under tumörprogression; Omvänt kan de vara närvarande under de senare stadierna av cancer, ökar migrationskapacitet invasiva celler [2,15-11,7]. Detta återuppstår connexiner tydligt observeras under utvecklingen av human bröstcancer, där Cx26- och Cx43-negativa primära tumörer utvecklas Cx26- och Cx43-positiva metastaser i lymfkörtlarna [18,1,9]. Liknande resultat har också uppnåtts i mushud cancer; Cx26 uttryck reduceras under de tidiga stadierna av cancer, men återställs i metastatiska lymfkörtlar [20]. Dessa studier antyder att connexiner spela olika roller under processen för karcinogenes. Vår studie var första gången för att undersöka uttrycket av Cx43 under olika stadier av magcancer progression (primär magcancer vävnader intraabdominella exfolierade gastric cancerceller och matchade metastaser peritoneala vävnader). Resultaten visar en signifikant minskning av Cx43-uttryck i primära gastriska cancervävnader i jämförelse med de intilliggande normala gastriska vävnader (p < 0,05). Däremot var Cx43 uttryck i intraabdominella exfolierade gastric cancerceller och metastaser peritoneala vävnader avsevärt. Dessa resultat tyder på att Cx43 spelar troligen en viktig roll i peritoneal metastas.

För att undersöka om Cx43 uttryck har en effekt på peritoneal metastas, var Cx43 transfekterades i BGC-823 och SGC-7901 gastric cancerceller, och en Cx43T154A site mutation konstruerades för att bestämma rollen av kanalförbindelsekommunikation i processen för peritoneal metastas. Vidhäftning och diapedes av tumörceller till mesothelial cellmonoskikten är två viktiga steg för bildandet av peritoneal metastas. En in vitro
celladhesionsanalys avslöjade att Cx43- och Cx43T154A uttryck BGC-823 och SGC-7901 celler uppvisade effektivare vidhäftning till mesothelial cellmono än tomma vektor celler och att vidhäftnings effektivitet Cx43T154A-uttryckande tumörceller liknade Cx43-uttryckande celler. Dessa resultat tyder på att Cx43 befrämjar vidhäftningen av gastriska cancerceller för mesotelceller, som är oberoende av den kanalförbindelsekommunikation. När det gäller dess närstående mekanism hade vår tidigare studie visade att Cx43 kan interagera med cellvidhäftningsassocierade proteiner, såsom E-cadherin, som deltar i processen av adhesion [21], som kan föreslå en positiv roll Cx43 uttryck i att öka celladhesion.

diapedes av gastric cancerceller genom mesothelial cellmonolager in vitro
undersöktes ytterligare i våra experiment. Vår studie visade att diapedes av Cx43-uttryck gastric celler förbättras avsevärt jämfört med Cx43T154A-uttryckande celler, vilket tyder på att Cx43 uttryck påverkade cellrörlighet, vilket var i linje med flera tidigare rapporter [2, 14, 22 och 23]. Det återstår dock att klarlägga huruvida Cx43-uttryck i samband med kommunikationen mellan. Vi utforskade sedan om GJIC spelar en central roll i diapedes. Först undersökte vi GJIC mellan gastric cancerceller och peritoneala mesotelceller. Resultaten visade att Cx43-uttryckande gastriska cancerceller etablerat en effektiv hetero GJIC med peritoneala mesotelceller; dock Cx43T154A-uttryckande celler misslyckades med att etablera GJIC, som ansågs tidigare [10].

Cx43- och Cx43T154A-uttryck gastric celler sattes till mesotelceller monolager samt co-odlade över natten (inte längre än 12 timmar ) för att ytterligare bekräfta roll GJIC i trans av gastriska cancerceller genom peritoneala mesotelceller monolager. Gastric cancercell diapedes undersöktes med hjälp av laserskanning konfokalmikroskopi. Våra resultat visade att Cx43-uttryckande gastriska cancerceller uppvisade effektivare migration genom mesothelial cellmonoskikt än Cx43T154A och tomma vektor grupp celler, medan den diapedes effektiviteten av tumörceller i sistnämnda två grupperna skilde sig inte signifikant, vilket antyder att heterocellular GJIC mellan tumör och mesotelceller är nödvändigt att förstärka diapedes. För att förstå den centrala roll GJIC i diapedes av gastriska cancerceller genom mesothelial cellager, såg vi tidigare studier som har klargjort mekanismer som är involverade i diapedes av tumörceller genom endotelceller cellager. Dessa studier har visat att tumörceller kan sända signaler till endotel, såsom inositoltrifosfat (IP3), genom gap junctions att reglera intracellulära kalciumnivåer. Förhöjda nivåer av intracellulär kalcium övergående fosforylera myosin lätta kedjan att öka endotel permeabilitet. Endotelceller kan också sända signaler till tumörceller genom gap junctions att uppreglera cellular motilitet proteiner, såsom Rho GTPaser, proteinkinas C, och fosfoinositid-3-kinas [24-22,7]. Dessa resultat kan bidra till att belysa mekanismen för hur GJIC spelar en central roll under diapedes av gastric cancerceller.

Med hänsyn till resultaten av denna studie och nya rön, föreslår vi att Cx43-förmedlade kanalförbindelser spelar en aktiv roll i peritoneal metastas av gastric cancerceller. Våra resultat stödjer hypotesen att heterocellular spalt Junktional kopplingar mellan gastric cancerceller och mesothelium reglerar trans av gastric cancerceller till de peritoneala mesotelceller monolager. Gastric cancerceller "trans genom mesothelial barriären skett via para migration.

• PLOS Genetics: Onkogena Pathway Kombinationer förutsäger kliniska prognoser i Gastric Cancer
• PLOS ONE: Tumör Content An-Assisted HER2 /CEP17 Digital PCR-analys för magcancer biopsi