PLoS One: kóros expressziója Cx43 társul a peritoneális metasztázis gyomorrák és Cx43 által közvetített Gap Junction Javítja Gyomor Cancer Cell diapedesis származó peritoneális Mesothelium

absztrakt katalógusa

A folyamat a hashártya áttét jár diapedesis belüli -abdominal rétegesen gyomorrák sejtek révén mesothelial egysejtrétegekre; Ugyanakkor a kapcsolódó molekuláris mechanizmusok ez a folyamat még nem tisztázott. Heterocellular gap junction-intercelluláris kommunikáció (GJIC) között gyomorrák sejtek és mesotheliális sejtek aktív szerepet közben diapedesis. Ebben a tanulmányban kimutatott expresszióját connexin 43 (Cx43) elsődleges gyomorrák szövetek, hasüregi rétegesen rákos sejteket, és kiegyenlített áttétes peritoneális szövetekben. Azt találtuk, hogy a kifejezés a Cx43 primer gyomorrák szövetekben jelentősen csökken; A hasüregi exfoliált rákos sejteket, és kiegyenlített áttétes peritoneális szövetekben mutatott egyre inkább kifejezést képest elsődleges gyomorrák szövetekben. BGC-823, SGC-7901 humán gyomorrák sejteket expressziójára átalakított Cx43 vagy Cx43T154A (mutáns fehérjét, hogy csak a párok gap junction de nem nyújt intercelluláris kommunikáció), és együtt tenyésztettünk humán peritoneális mesothelialis sejtek (HPMCs). Heterocellular GJIC és diapedesis keresztül HPMC egyrétegű matrigel-bevonatú fedőlemezeket vizsgáltuk. Azt találtuk, hogy BGC-823, SGC-7901 gyomorrák expresszáló sejtek Cx43 kialakult funkcionális heterocellular réskapcsolatok HPMC egyrétegű egy órán belül. A jelentős növekedés a diapedesis volt megfigyelhető megtervezett Cx43 expresszáló sejtek képest Cx43T154A és kontrollcsoport sejteket, amely azt sugallta, hogy a megfigyelt túlszabályzását diapedesis a Cx43 expresszáló sejtek szükséges heterocellular GJIC. További vizsgálatok feltárták, hogy a gyomor rákos sejtek transzmigrált keresztül az intercelluláris tér között, a mesothel sejtek keresztül paracelluláris úton. Eredményeink azt sugallják, hogy az abnormális expressziója Cx43 lényeges szerepet játszik a peritoneális áttétek, és hogy Cx43 közvetített heterocellular GJIC között gyomorrák sejtek és mesothel sejtek lehetnek egy fontos szabályozási lépés során metasztázis. Végül azt tapasztaltuk, hogy a diapedesis a exfoliált gyomorrák sejtek révén mesothelialis akadályok egy járható útja a paracelluláris migráció. Katalógusa

Citation: Tang B, Peng Zh, Yu PW, Yu G, Qian F, Zeng Dz et al. (2013) kóros expressziója Cx43 társul a peritoneális metasztázis gyomorrák és Cx43 által közvetített Gap Junction Javítja Gyomor Cancer Cell diapedesis származó peritoneális Mesothelium. PLoS ONE 8 (9): e74527. doi: 10,1371 /journal.pone.0074527 katalógusa

Szerkesztő: Johanna M Brandner, University Hospital Hamburg-Eppendorf, Németország katalógusa

Beérkezett: január 19, 2013; Elfogadva: augusztus 6, 2013; Megjelent: szeptember 11, 2013 katalógusa

Copyright: © 2013 Tang et al. Ez egy nyílt hozzáférésű cikk feltételei szerint terjeszthető a Creative Commons Nevezd meg! Licenc, amely engedélyezi a korlátlan használatát, a forgalmazás és a reprodukció bármilyen adathordozón, feltéve, hogy az eredeti szerző és a forrás jóváírásra. Katalógusa

Forrás: Ez a munka támogatott támogatási No. 30801097 és 81272366 számú a Nemzeti Természettudományi Alapítvány Kína. A finanszírozók nem volt szerepe a tanulmány tervezés, adatgyűjtés és elemzés, döntés, hogy közzéteszi, vagy a készítmény a kézirat. Katalógusa

Érdekütközés: A szerzők kijelentették, hogy nem ellentétes érdekek léteznek. Katalógusa

Bevezető

Az előfordulási gyomorrák csökken, de továbbra is jelentős oka a rák okozta halál világszerte. A meghatározó jellemzői a gyomorrák sejtek közé tartoznak azok az invazív és metasztatikus kapacitását. Peritoneális áttét kritikus eleme a tumor progresszióját az előrehaladott gyomorrák [1]. A folyamat során a peritoneális metasztázis, gyomorrák-sejtek kölcsönhatásban intercellulárisan több sejttípus, és a kölcsönhatás a hasűri exfoliált gyomor rákos sejteket, és a peritoneális mesothel sejtek különösen fontos. Mivel folyamatos emberi peritoneális mesothelial cella (HPMC) egyrétegű akadályt ellen hashártya áttét, ha a diapedesis a exfoliált gyomorrák sejtek révén mesothelialis egysejtrétegekre történik, a bőséges vérellátás a mátrixban alatt mesothelium nyújt kényelmes környezetet a metasztatikus gyomor rákos sejteket, és elősegítik azok kolonizáció. Ezért diapedesis rétegleválásos gyomorrák-sejtek révén mesothelialis sejt monoréteg nélkülözhetetlen lépés során peritonealis metasztázis. Közötti kölcsönhatás ezeket a sejteket kíséri intercelluláris kommunikáció (IC), amely többnyire által közvetített sejt-sejt gap junction [2]. Gap junction vannak kialakítva plazmamembrán connexinek, amelyek mindegyike tartalmaz hat connexinek (CXS) [3]. A mai napig, 20 különböző connexin izoformát azonosítottak emberekben. Cx43 egy általános izoform kifejezve legtöbb epiteliális szövetekben. Korábbi tanulmányok [4-6] azt jelezte, hogy Cx43 kifejezés alatt csökkent tumorigenezis, és ezért minősíteni tumorszuppresszor. Van azonban egyre több bizonyíték arra, hogy connexinek is be lehet vonni a intravasation és extravazációjában rákos sejtek és pozitív szerepet játszik ebben a folyamatban az áttétek [7,8]. Függetlenül attól, hogy a Cx43 közvetített gap junction játszik fontos szerepet diapedesis gyomorrák sejtek keresztül peritoneális mesothelialis gát még nem tisztázott. A címet a hipotézist vizsgáltuk kifejezése Cx43 elsődleges gyomorrák szövetek, rétegesen gyomorrák sejtek, és a peritoneális áttétes szövetekben. Megkonstruáltuk Cx43-kifejező vektort és egy Cx43T154A hely mutáció vektor. Ezután, használtuk két emberi gyomor rákos sejtvonalat (BGC-823, SGC-7901), amely GJIC hiányos, és nem említik semmilyen ismert connexinek [9]. Mivel mesothelialis sejtek bőségesen kifejezni Cx43, mi manipulált gyomorrák sejtek kifejezni akár vad típusú Cx43 vagy helyspecifikus mutáns annak megállapítására, hogy a potenciális gyomorrák sejtek diapedesis a mesothelium változna alatt mindkét vagy az említett feltételek bármelyike. Ebben a tanulmányban azt mutatják, hogy a Cx43 kifejezés upregulálja tumorsejt diapedesis keresztül GJIC-dependens mechanizmusa. Katalógusa

Anyagok és módszerek katalógusa

2.1: Reagensek és antitestek katalógusa

Anti-connexin 43 poliklonális antitesttel (Zymed, San Diego, CA, USA), Matrigel (Becton-Dickinson, Bedford, MA, USA), 1, 1'-diocta-decil-3, 3, 3 ', 3'-tetrametil-percholate (Dil; Molecular Probes, Eugene, OR, USA), calcein-AM (Dojindo, Kumamoto, Japán), és FITC-konjugált falloidinnel a Sigma (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA).

2.2 : a szövetminták és citológiai vizsgálat katalógusa

Minden résztvevő írásos beleegyezését adta (a saját gyám, ha szükséges). Ezt a vizsgálatot megfelelően a tanait a Helsinki Nyilatkozat és annak módosításait, és jóváhagyta az etikai bizottság a Southwest kórház, a harmadik katonai Orvostudományi Egyetem. A vizsgálati populáció 42 beteg, akik sorolták szakasz szerinti IV hetedik kiadása UICC TNM osztályozás a rosszindulatú daganatok. Klinikai és patológiai változók az 1. táblázatban felsorolt ​​összes bevont betegek vizsgálatunk ment palliatív vagy felderítő műtét. Elsődleges daganatos és metasztázisos peritoneális szöveteket gyűjtöttünk vége előtt a műtét, és exfoliált gyomorrák sejteket a centrifugálással ascites vagy peritoneális mosófolyadékban (ha aszcitesz nem létezik). A magvas sejtréteg kenték rá egy tárgylemezre és hematoxilin-eozin (HE). Két tapasztalt citopatológusok végzett citológiai értékeléseket. CEA-t használni, mint egy biomarker, hogy segítsen azonosítani adenokarcinóma sejteket immunfluoreszcens pozitív festődés. Eseteket kizárták a jelen vizsgálat során a vizsgálat eredményeit mind a citopatológusok nem volt egyetértés. Katalógusa csoport katalógusa száma katalógusa százalék (%) hotelben szex male2764.0 female1536.0Age (év) < 501.740,4 ≥502559.6Tumor helyen Antral2150.0 Body1228.6 Fundic911.4Pathological típusú Nos differentiated24.7 Mérsékelten differentiated49.5 rosszul differentiated3685.8Bormann gépelési I00 II12.4 III1228.5 IV2969.1Ascites Yes1535.7 No2764.3Surgical megközelítés palliatív gastrectomy2457.1 feltáró + biopsy1842.9Table 1. Klinikai és patológiai jellemzői 42 esetben a gyomorrákos betegeknél.
CSV letöltése CSV

2.3: immunhisztokémia katalógusa

Paraffin szövetminta primer tumor és metasztatikus peritoneális szöveteket sorozatmetszetekre és HE festés megerősítette a gyomorrák. Egymást követő metszeteket paraffint, szárított és antigen sorrendben. A metszeteket egy nyúl poliklonális anti-Cx43 antitesttel 24 órán át 4 ° C-on. Kötőhelyek tettük láthatóvá 3, 3'-diamino-benzidin (DAB) egy 5 perces reakció. A metszeteket kontrasztfestést Mayer féle hematoxilinnel, szárított, üres, és szerelt. Kihagyása a primer antitestet használtunk negatív kontrollként. Immunhisztokémiai festést értékeltük hozzárendelésével pontszám alapján a kiterjedése és intenzitása immunreaktivitás. Festési mértékben értékeltük szemikvantitatíven a citoplazmában, és a membrán, mint a negatív (0, < 5% festett sejtek), a pozitív 1 + (6-25% festett sejtek), pozitív 2 + (26-50% festett sejtek), vagy pozitív 3 + ( > 50% festett sejtek). A festődés intenzitása pontoztuk, mint 0 (nincs festés), 1 (gyenge festődés, sárga, barna), 2 (közepes festéssel, sárga barna), vagy 3 (erős festődés, barna). Immunfestést eredményeket szerzett összegeként mértékének és intenzitásának immunreaktivitást tekintve a pontszám ≥3 pozitív és pontszámot < 3 negatív. Katalógusa

2.4: Immunfluoreszcenciás katalógusa

Cx43 expresszióját hasüregi rétegesen gyomorrák-sejtek alkalmazásával vizsgáltuk immunfluoreszcenciával. Negyvenkét esetben vontak be a vizsgálatba. A sejteket bekent üveg fedőlemezen fixáltuk 4% paraformaldehid és PBS-sel mostuk, amely 0,5% BSA-t (öblítő puffer). A sejteket ezután 24 órán keresztül inkubáltuk 4 ° C hőmérsékleten egy anti-Cx43 antitesttel (1: 150). A fedőlemezeket mostuk, és FITC-konjugált kecske anti-nyúl másodlagos antitesttel. A sejtmagokat megfestjük 10 ng /ml DAPI-t (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA). A fedőlemezeket leképezett fluoreszcens mikroszkóppal (Siemens, Németország). A kontrollokat (primer antitesteket helyébe PBS) negatív volt az összes kísérlet (az adatokat nem mutatjuk be).

2,5: Sejttenyésztés és stabil expressziója Cx43 és Cx43 mutánsok

nem rosszindulatú humán halhatatlanná tett mesothelialis sejtek , Met-5A, ATCC-től kaptuk. Ezeket a sejteket tartottunk fenn és szaporítjuk Medium 199, amely 1,5 g /l nátrium-hidrogén-karbonát, 10% magzati borjúszérumot, 3,3 nM az epidermális növekedési faktor (EGF), 400 mM hidrokortizonnal, 870 nM cink-mentes szarvasmarha-inzulin, 20 mM HEPES, és 3,87 ug /L selenious sav (H2SeO3). katalógusa

az emberi gyomor adenokarcinóma sejtvonalak BGC-823, SGC-7901 kaptuk a Shanghai Institute sejtbank, kínai Tudományos Akadémia. Cx43- és Cx43T154A kifejező vektorok géntechnológiai segítségével Lentivirális fertőzés. PTA2-Cx43, amely magában foglalta a humán Cx43 kódoló szekvencia épült laboratóriumunkban. A Cx43T154A hely mutáció vektorkonstrukció végeztük átlapolás kiterjesztéses PCR, amely kódolt egy fehérjét, funkcionált gap junction nélkül IC a korábban leírt [10]. A cDNS-t a Cx43 és Cx43T154A helyezünk a Lenti-GFP vektorba, és transzfektálunk a 293T csomagoló sejtvonal. A lentivirális felülúszót összegyűjtöttük 48 óra múlva átszűrjük egy 0,45 jim-es szűrőn, és fertőzésére alkalmaztuk BGC-823, SGC-7901 sejteket. A tápközeget helyettesítettük RPMI1640 24 órával a fertőzés után, és a sejteket tenyésztjük, rutinszerűen. Több, mint 90% -a a tumorsejtek kifejezett Cx43 vagy Cx43T154A után három fordulóban vírus-fertőzés; A sikeresen fertőzött sejteket összegyűjtöttük áramlási citometriával. katalógusa

2.6: Fehérje és Western blot analízis katalógusa

A megtervezett Cx43- és Cx43T154A expresszáló BGC-823, SGC-7901 gyomorrák lizáltuk . Fehérje (50 ug) származó egyes sejttípusok elválasztjuk egy 12% -os SDS-poliakrilamid-gélen, és nitrocellulóz membránra transzferáltuk. Nitrocellulóz-membránokat blokkoltuk 5% zsírmentes tejpor és ezután próbaként a Cx43 fehérje egy poliklonális anti-Cx43 antitesttel (1: 500). Az immun-blot próbaként a megfelelő torma peroxidázzal konjugált szekunder antitestekkel (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) 1: 10,000 hígításban. A fehérjéket vizualizáltuk Supersignal West Pico kemilumineszcens szubsztrátot (Pierce Chemical Co.) és immunoblot voltak kitéve, Amersham Hyperfilm (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ, USA) 30 másodpercig.

2,7: Tumor Cell /mesothelialis Adhézió meghatározása

mesothelialis sejteket amíg egyrétegű összefolyása üveg fedőlemezen 24 mérőhelyes lemezeken. A génsebészetileg Cx43- és Cx43T154A-t expresszáló gyomorrák sejteket jelölt, 10 ug /ml Dil oldatot 15 percig 37 ° C-on. Dil egy általánosan használt fluoreszcens próba, amely azt mutatja a narancs-vörös fluoreszcencia membránokban, és ezt használtuk a vizsgálatunkban a címkén gyomor rákos sejteket. Ezek a jelzett sejteket ezután hozzáadjuk a mesothel egysejtrétegek, és inkubáltuk 1 órán át 37 ° C-on. Nem adherens sejteket mosással eltávolítjuk, és a sejteket, amelyek csatlakoztak a mesothel sejt egyrétegű sejttenyészeteket fixáltuk 4% paraformaldehiddel. A kultúra metszeteket szerelt Mowiol (Calbiochem) és vizsgáltuk fluoreszcencia mikroszkóp (Leica MPS 60). Katalógusa

2.8: Tumor Cell /mesothelialis Cell GJIC assay katalógusa

A megtervezett Cx43- és Cx43T154A expresszáló BGC-823, SGC-7901 gyomorrák sejteket jelzett 15 percen át 37 ° C-on 2 ml Opti-MEM, amely 10 ug /ml calcein-AM és 10 ng /ml-Dil. Calcein-AM fluoreszcens szubsztrátum, amely lehasad az életképes sejteket egy membránimpermeábilis formájában, amelyek áthaladnak a funkcionális gap junction de nem más plazmamembrán csatornákat. Mesothelialis egysejtrétegeket előkezeljük 4 órán át 150μM karbenoxolon (CBX), hogy blokkolja a homotípusos GJIC és ezután kezeltük 15 percig 10 ng /ml calcein-AM (Molecular Probes) egy Opti-MEM-oldattal. A jól előkészített jelölt gyomor rákos sejteket adunk a Met-5A monorétegek a Matrigel, és heterotípusos GJIC között a gyomor rákos sejtek, és a mesothel sejtek volt kimutatható. A fluoreszcencia fellendülés fehérített sejtek csak akkor fordul elő, ha festék áthalad a gap junction szomszédos fehérítetlen gyomor rákos sejteket. Egyedi mesothelialis sejtek szomszédos gyomorrák sejteket fehérített körülbelül 30 s egy Zeiss lézer konfokális mikroszkóppal és egy argon lézer 33% -os teljesítmény minden egyes kísérleti feltétel. Egységes mesothelialis sejtek nem tudják megállapítani GJIC választottunk alávetni blenching kontrollként. Kezeletlen sejteket használtunk, mint háttér módosításával sejteket. Az átlagos fluoreszcencia intenzitás fehérített /fehérítetlen sejtek mértük idővel Scion képalkotó szoftver, és a fluoreszcencia visszanyerési arány számítottuk, valamint (Kt = (Ib-Ib0) /lu × 100%, Kt: fluoreszcencia hasznosítási arány t időpontban; Ib: a fluoreszcencia intenzitás a fehérített sejt t időpontban; Ib0: fluoreszcencia intenzitás a fehérített sejt t = 0; lu: fluoreszcencia intenzitás a szomszédos fehérítetlen sejt idő alatt t) [11]. katalógusa

2.9: transmesothelial migrációs assay

A transmesothelial migrációs assay-t, a korábban leírtak szerint [12]. Röviden, 1 × 10 ^{5 Met-5A mesothelialis sejtet oltunk 12 mm-es üveg fedőlemezen hogy vonunk be Matrigel (Becton-Dickinson, USA). Egyrétegű összeértek meghatározva fénymikroszkópos. Fedőlemezeket átvittük egy 24 lyukú lemezt, és tenyésztettük 48 órán in EGM. Gyomorrák sejteket osztva üres vektor-csoport, Cx43 expresszáló-csoport, Cx43T154A expresszáló-csoport és CBX előkezelt csoportnál (Cx43-t expresszáló gyomorrák sejteket előkezeljük 4 órán át 150μM karbenoxolon (CBX), hogy blokkolja a homotípusos GJIC) és jelzett híg . Körülbelül 1 × 10 5 sejteket adtunk mesothelialis egysejtrétegeken 1:10 arányban (tumorsejt: mesothelialis sejt). A sejteket ko-tenyésztettük különböző időpontokban (1, 4, vagy 7 h) megelőzően élő megfigyelés vagy fixálás és immunfestés. Vak vizsgálók mennyiségileg diapedesis használva LSM, a korábban ismertetett módon [7]. Röviden, a ko-tenyészeteket fixáltuk és megfestettük az F-aktin. Diapedesis mennyiségileg, mint a daganatsejtek számát, amelyek érintkeznek a mesothelium és sorolhatók három szakaszban aszerint, hogy azok pozícióját a mesothelium: 1) lekerekített - tumorsejtek egy gömb alakú az apikális felszínen a mesothelium; 2) áttelepítése - daganatsejtekben áthatolt a mesothel egysejtrétegeken mesothelialis sejt csomópontok egy része a sejt test fölött a mesothelium és egy része a sejt test spread a Matrigel alatt mesothelialis sejt F-aktin stressz szálak; és 3) a alatta - a teljes tumor sejttest volt síkja alatt a mesothel sejt stressz szálak. Költöztetése és az alatta sejteket minősülő transmigrating. Körülbelül 100 mesothelium tapadt sejteket rögzítésre és megszámoltuk per fedőlemez, és az összes kísérletet háromszor megismételjük három példányban fedőlemezeket.}

2,10: Statisztikai analízis

Minden statisztikai elemzést végeztünk az SPSS szoftver ( 13.0). Valószínűségeket P < 0.05 statisztikailag szignifikánsnak tekintettük. Katalógusa

Eredmények katalógusa

3.1: Cx43 expressziója primer tumorok és kiegyenlített áttétes peritoneális szövetek katalógusa

Negyvenkét normál hámban (100%) fejezte Cx43 tipikus hártyás és citoplazmatikus festődés (1a ábra). Tizenegy 42 primer tumorok (26,2%) volt pozitív Cx43, amely szignifikánsan csökkent összehasonlítva a szomszédos normális hámban (p < 0,05). Cx43 kifejezés heterogén volt a különböző szövetminták: jól differenciált gyomorrákban szövetekben Cx43 kifejezés mutatott jelentős vegyes (citoplazmatikus és membrán) festés (1B); közepesen differenciált gyomorrák szövetek már csak citoplazmatikus Cx43 kifejezés (1C); és Cx43 alig volt kifejezett rosszul differenciált gyomorrák szövetekben (1D). Ezzel szemben, a Cx43 expresszió jelentősen nőtt 29. 42 metasztatikus peritoneális szövetekben (69,0%) és a mutatott tipikus citoplazmatikus és membrán festés (p < 0,05) (1 E. ábra) (2. táblázat).
Connexin 43
Elsődleges gyomorrák (eset) (%) hotelben szomszédos normál szövetben (esetek) (%) hotelben áttétes peritoneális szövet (esetek) (%) hotelben Negative (pontszám < 3) 31 (73,8%) 0 (0 ) 13 (31,0%) pozitív (score≥3) 11 (26,2%) * 42 (100%) 29 (69,0%) † 2. táblázat Immunhisztokémia eredménye Connexin 43 expressziója primer gyomorrák szövetekben, szomszédos normál gyomor szövetek és a peritoneális metasztatikus szövetekben (n = 42).
* összehasonlítva a szomszédos normális szövetekben, a kifejezés a connexin 43 szignifikánsan csökkent (p < 0,05); †, mint az elsődleges gyomorrák szöveteket, a kifejezés a connexin 43 áttétes peritoneális szövetben jelentősen nőtt (p < 0,05). CSV letöltése CSV

3.2: Cx43 expresszió hasüregi exfoliált gyomorrák sejtek katalógusa

Most hasüregi exfoliált gyomorrák sejtek léteznek többsejtű gömböcskék (ábra 1F). Pozitív Cx43 immunfestés volt megfigyelhető 35 a 42 esetben a hasüregi exfoliált rákos sejtek vegyes citoplazmatikus és membrán festés, míg a pozitív arány 83,3% (1. ábra G, H, és I).

3.3 expressziója exogén Cx43 a BGC-823, SGC-7901 gyomorrák sejtek katalógusa

a gyomorrák sejteket úgy tervezték, hogy kifejezze a funkcionális Cx43, Cx43T154A és egy üres lentivirális vektor kontrollként hatásának vizsgálata a Cx43 kifejezés a biológiai viselkedését ezekben a sejtekben. Cx43 kifejezés nem volt jelen az üres vektor csoport, de a másik két géntechnológiai csoportot észlelt kifejezni sem Cx43 vagy Cx43T154A (2A ábra). Katalógusa

3.4: adhéziós tulajdonságai Gyomorrák Cells mezoteliás Cells katalógusa

a hatás a Cx43 a tapadását gyomorrák sejtek mesothel sejtek is vizsgáltuk. Engineered gyomorrák expresszáló sejtek vagy vad típusú Cx43 vagy Cx43T154A mutatott jelentős növekedése tapadás mesothelialis sejtek összehasonlítva üres vektorral csoport (P < 0,05). Nincs szignifikáns különbség a tapadási képesség volt megfigyelhető között Cx43- és Cx43T154A expresszáló csoportban (p > 0,05), ami arra utal, hogy a Cx43 elősegíti gyomorrák sejt adhézió, amely független a GJIC (2b ábra).

3,5: Engineered Cx43 expresszáló BGC-823, SGC-7901 sejtek alkotnak funkcionális gap junction csatornák mesothelialis egysejtrétegek

együtt tenyésztett génsebészeti Cx43- és Cx43T154A-t expresszáló gyomorrák sejtek mesothelialis sejt monorétegek, hogy megvizsgálja a képessége Cx43 -expresszáló sejtek alkotnak réskapcsolatok és létrehozza GJIC a mesothelialis sejteket. Az eredmények azt mutatják, hogy a gyomor rákos sejtek vagy az üres vektor-csoport vagy Cx43T154A csoport nem bizonyította GJIC szomszédos peritoneális mesothelialis sejtek után lézeres fehérítés, míg a Cx43 expresszáló csoport képes volt megállapítani GJIC peritoneális mesothelialis sejtek sikeresen. Az intracelluláris fluoreszcencia intenzitását detektáltuk előtt fehérítés, pillanatában fehérítés, és vagy 1 perc, 2 perc, 3 perc vagy után 4 perccel fehérítés. Az eredmények azt mutatják, hogy Cx43 expresszáló-csoport, az intracelluláris fluoreszcencia-intenzitását fehérített mesothelialis sejt gyorsan csökkent fehérítés után. A fluoreszcencia intenzitás majd fokozatosan visszanyert miatt festék áthaladás gap junction szomszédos fehérítetlen gyomorrák-sejtek, és az átlagos fluoreszcencia visszanyerési arány 35,6 ± 0,9%, illetve 39,4 ± 0,8% volt után 4 perccel blenching a BGC-823, SGC-7901 sejteket, volt, ami szignifikánsan magasabb volt, mint a Cx43T154A és üres Vetor csoportban (p < 0,05) (3. ábra, 3. táblázat).
Group
átlagos fluoreszcencia hasznosítási arány (%, x katalógusa ± s ) (t=4min)
BGC-823Cx4335.6±0.9*BGC-823Cx43T154A12.1±0.6BGC-823v13.4±0.7SGC-7901Cx4339.4±0.8†SGC-7901Cx43T154A15.3±0.4SGC-7901v14.7±0.6Table 3. Összehasonlítás az átlagos fluoreszcencia hasznosítási arányok fehérítés után a BGC-823, SGC-7901 gyomorrák sejtek (fluoreszcencia intenzitás, x katalógusa ± s).
CSV letöltése CSV

3.6: A morfológiai értékelést a tumorsejtek diapedesis katalógusa

létrehozott egy in vitro katalógusa rendszer kép a transmesothelial migráció gyomorrák sejtek vizsgálatára a mechanizmus és útvonala diapedesis. Ez a vizsgálati eljárás utánozza aspektusait az érfal és már korábban használt, hogy elemezzék leukocita diapedesis [11]. Dil-jelzett tumorsejteket szerint pontoztuk morfológiájuk és helyét tekintetében a mesothelium. Meghatároztuk három különböző szakaszaiban a migráció, konfokális mikroszkóp segítségével: lekerekített (4A); migráló (ábra 4E); és alatta (ábra 4I). A tumorsejteket a tetején a mesothelium megelőzően diapedesis mutatott egy kerek vagy ovális alakú, és ez a forma tartjuk a csúcsi (4b ábra), hogy a bazális felület (4C, D). Átállítása tumorsejtek között elhaladó szomszédos mesothelialis sejtek megváltozott alakú ovális, hogy egy hosszú orsó intracelluláris F-aktin összeállítva aktin kötegek (4F, G, H). A tumorsejtek elkészült diapedesis helyezkedtek teljesen alatta mesothelium. A sejt formája fokozatosan változott a hosszú orsó a kerekebb alakú, és az intracelluláris F-aktin filamentumok fokozatosan terjeszteni, és arra egy ritkán között elrendezett szálak (ábra 4J, K, L). A tanulmány kimutatta, hogy a gyomorrák sejtek diapedesis történt keresztül paracelluláris útvonalat. Katalógusa

3.7: Cx43 közvetített GJIC fokozott gyomorrák sejtek diapedesis katalógusa

együtt tenyésztett Cx43-, Cx43T154A expresszáló gasric rák sejtek és CBX előkezelt Cx43-expresszáló sejtek mesothelialis sejteket 1, 4 és 7 óra összehasonlítani a diapedesis hatékonyságát [1,2]. Ezeket a sejteket szerezte az ismertetett kritériumok migráció. A százalékos vándorló Cx43T154A és CBX előkezelt sejtek nem voltak szignifikánsan eltérőek a üres vektor csoport sejteket 7 óra elteltével az együtt-tenyésztés (p 0,05), de a diapedesis hatékonyságát Cx43 expresszáló csoport sejtek szignifikánsan magasabb volt, mint a másik három csoportban (p <0,05) (5. ábra). Ezek az eredmények arra utalnak, hogy a jelenléte a Cx43 fehérje a tumorsejt önmagában nem felelős a megfigyelt növekedése diapedesis, de heterocellular GJIC között tumorsejtek és mesothel sejtek szükséges növelni a hatékonyságot a diapedesis gyomor rákos sejteket. Ezek az eredmények arra utalnak, hogy a Cx43 megkönnyíti GJIC függő tumorsejt diapedesis. Katalógusa

Vita katalógusa

Gap junction és connexin alegységek downregulált különböző rákos [4,13,1,4]. A legújabb jelentések azt mutatják, hogy connexinek "kifejezés nem mindig tartjuk csökkent szintje alatt a tumor progresszióját; megfordítva, jelen lehet a későbbi szakaszaiban carcinogenesis, a növekvő migrációs képességét invazív sejtek [2,15-11,7]. Ez újbóli megjelenése connexinek egyértelműen megfigyelhető progressziója során humán mellrák, ahol Cx26- és Cx43-negatív primer tumorok kifejlesztett Cx26- és Cx43-pozitív áttétek a nyirokcsomókban [18,1,9]. Hasonló eredményeket értek kapott egerek bőrén karcinogenezissel; Cx26 kifejezés csökken a korai szakaszában carcinogenezist, de visszaáll az áttétes nyirokcsomók [20]. Ezek a vizsgálatok arra utalnak, hogy a connexinek különböző szerepet játszik a folyamat során a kialakulásában. A tanulmány volt az első alkalom, hogy vizsgálja meg a kifejezés Cx43 során különböző szakaszaiban gyomorrák progresszió (primer gyomorrák szövetek, hasüregi exfoliált gyomorrák sejtek és kiegyenlített áttétes peritoneális szövetek). Az eredmények azt mutatják, jelentős csökkenését Cx43 expressziója primer gyomorrák szövetekben, összehasonlítva a szomszédos normál gyomor szövetekben (p < 0,05). Ezzel szemben, a Cx43 expresszió intraabdominális exfoliált gyomorrák sejtek és metasztatikus peritoneális szövetekben jelentősen megnőtt. Ezek az eredmények azt sugallják, hogy Cx43 legvalószínűbb fontos szerepet játszik a peritoneális metasztázist.

vizsgálni, hogy a Cx43 expresszióját hatással van a peritoneális metasztázis, Cx43 t transzfektáltunk BGC-823, SGC-7901 gyomorrák-sejtek, és egy Cx43T154A hely mutáció került kialakításra, hogy meghatározzák a szerepét gap junction kommunikáció a folyamat a peritoneális metasztázist. Tapadás és diapedesis tumorsejtek a mesothel egysejtrétegek két kritikus lépései a kialakulását a peritoneális áttétek. Egy in vitro
sejtadhéziós vizsgálati eljárás kimutatta, hogy a Cx43- és Cx43T154A expresszáló BGC-823, SGC-7901 sejtek mutattak hatékonyabb tapadás a mesothel egysejtrétegek mint üres vektor sejteket és hogy az adhéziós hatékonysága Cx43T154A expresszáló tumorsejtek hasonló volt a Cx43-expresszáló sejteket. Ezek az eredmények azt sugallják, hogy Cx43 elősegíti a tapadását gyomorrák sejtek mesothel sejtek, amelyek független a gap junction kommunikáció. Tekintettel annak kapcsolódó mechanizmus, a mi korábbi tanulmány jelezte, hogy Cx43 kölcsönhatásba léphet sejtadhézió-asszociált proteinek, mint például az E-cadherin, a folyamatban részt vevő adhéziós [21], amely javaslatot tehet pozitív szerepét Cx43 expresszió növelése sejt adhéziós. katalógusa

A diapedesis gyomorrák sejtek révén mesothelialis egysejtrétegekre in vitro katalógusa tovább vizsgáltuk kísérleteinkben. A tanulmány kimutatta, hogy a diapedesis a Cx43 expresszáló gyomor sejtek jelentősen javul összehasonlítva Cx43T154A-expresszáló sejtek, ami arra utal, hogy a Cx43 expresszióját befolyásolja celluláris motilitás, ami összhangban volt több korábbi jelentések [2, 14, 22, és 23]. Azonban még nem tisztázott, hogy a Cx43 kifejezés járt sejtközi kommunikáció. Ezután megvizsgálta, hogy GJIC játszik döntő szerepet diapedesis. Először azt vizsgáltuk meg, GJIC között gyomorrák sejtek és peritoneális mesotheliális sejteket. Az eredmények azt mutatják, hogy a Cx43 expresszáló gyomorrák sejtek létre egy hatékony heterotipikus GJIC peritoneális mesothelialis sejtek; Azonban Cx43T154A-expresszáló sejtek nem bizonyította GJIC, mint tartották előtt [10].

Cx43- és Cx43T154A expresszáló gyomor sejteket adtunk mesothelialis egysejtrétegek és együtt tenyésztettük egy éjszakán át (nem hosszabb, mint 12 óra ), hogy tovább erősítse a szerepe GJIC a transzmigrálásához gyomorrák sejtek a peritoneális mesothelial egysejtrétegekre. A gyomorrák sejt diapedesis vizsgáltuk konfokális lézer mikroszkóppal. A mi eredményeink azt mutatták, hogy a Cx43-t expresszáló gyomorrák-sejtek mutattak hatékonyabb migráció révén mesothelialis egysejtrétegek mint Cx43T154A és üres vektor csoport sejtek, míg a diapedesis hatékonyságát tumorsejtek utóbbi két csoport nem különbözött szignifikánsan, ami arra utal, hogy a heterocellular GJIC között tumor és mesotheliális sejtek növelése érdekében szükséges diapedesis. Ahhoz, hogy megértsük a központi szerepet GJIC a diapedesis gyomorrák-sejtek révén mesothel sejtréteg, néztük az előző tanulmány, amely tisztázott mechanizmusok részt vesz a diapedesis tumorsejtek révén endotél sejt rétegeket. Ezek a vizsgálatok azt mutatták, hogy a tumorsejtek küldhet jeleket az endotélium, mint például az inozit-trifoszfát (IP3), keresztül gap junction, hogy szabályozzák az intracelluláris kalciumszintet. Emelkedett intracelluláris kalcium tranziens foszforilálni miozin könnyű lánc növeli az endothel áteresztőképesség. Az endoteliális sejtek is jelzéseket küldeni tumorsejtek keresztül gap junction upregulate celluláris motilitás fehérjék, mint például Rho GTP-ázok, a protein-kináz C, és foszfoinozitid-3-kináz [24-22,7]. Ezek az eredmények segíthetnek megvilágítani a mechanizmus hogyan GJIC kulcsszerepet játszik során diapedesis gyomorrák sejtek. Katalógusa

Figyelembe véve a vizsgálat eredményeit és a legújabb eredmények azt sugallják, hogy Cx43 közvetített réskapcsolatok játszanak aktív szerepet a peritoneális áttétek a gyomor rákos sejteket. Eredményeink alátámasztják azt a hipotézist, hogy a heterocellular gap junction-csatlakozók között gyomorrák sejtek és a mesothelium szabályozza a transzmigrálásához gyomorrák sejtek hashártya mesothelial egysejtrétegekre. A gyomorrák sejtek transmigration keresztül mesothelial gáton történt keresztül paracelluláris migráció.

• PLOS Genetics: onkogén útvonal kombinációk Tippelje klinikai prognózisa gyomorrákban
• PLoS One: Tumor Content kör segített HER2 /CEP17 Digitális PCR analízise Gyomorrák biopsziás minták