PLoS ONE: L'abbassamento di RPL6 da siRNA inibisce la proliferazione e la progressione del ciclo cellulare di gastrico umano Cancer Cell Lines

Estratto

Il nostro precedente studio ha rivelato che la proteina ribosomiale umana L6 (RPL6) era up-regolati in multi-resistente cellule di cancro gastrico e sovra-espressione di RPL6 potrebbe proteggere da cancro gastrico apoptosi indotta da farmaci. È stato inoltre dimostrato che up-regolazione di RPL6 accelerato la crescita e migliorato in vitro la formazione di colonie capacità delle cellule GES mentre down-regulation dei RPL6 esposto i risultati opposti. Il presente studio è stato progettato per studiare il ruolo potenziale della RPL6 nella terapia del cancro gastrico per clinica. L'espressione di RPL6 e ciclina E nei tessuti di cancro gastrico e normale mucosa gastrica è stata valutata immunohistochemisty. Si è constatato che RPL6 e ciclina E sono state espresse a un livello superiore nei tessuti di cancro gastrico da quello in normale mucosa gastrica ed i due erano correlativo nel cancro gastrico. Il tempo di sopravvivenza dei pazienti post-operatorio è stato analizzato mediante analisi di Kaplan-Meier e si è riscontrato che i pazienti con RPL6 espressione positiva hanno mostrato tempo di sopravvivenza più breve rispetto ai pazienti che con RPL6 espressione negativa. RPL6 era poi geneticamente down-regolato in gastrica SGC7901 cancro e linee di cellule AGS di siRNA. È stato dimostrato che down-regolazione di RPL6 ridotta formazione di colonie capacità delle cellule di cancro gastrico in vitro e ridotta crescita delle cellule in vivo. Inoltre, down-regulation di RPL6 potrebbe sopprimere G1 a S fase di transizione in queste cellule. Inoltre, abbiamo evidenziato che RPL6 siRNA down-regolato E l'espressione della ciclina nelle cellule SGC7901 e AGS. Presi insieme, questi dati suggeriscono che RPL6 era finita-espressi nei tessuti gastrici umani e ha causato prognosi infausta. Down-regulation dei RPL6 potrebbe sopprimere la crescita delle cellule e la progressione del ciclo cellulare, almeno attraverso la down-regolazione ciclina E e che potrebbe essere utilizzato come un nuovo approccio per la terapia del cancro gastrico

Visto:. Wu Q, Y Gou, Wang Q, Jin H, Cui L, Zhang Y, et al. (2011) L'abbassamento del RPL6 da siRNA inibisce la proliferazione e la progressione del ciclo cellulare di Human gastrico Cancer Cell Lines. PLoS ONE 6 (10): e26401. doi: 10.1371 /journal.pone.0026401

Editor: Xin-Yuan Guan, l'Università di Hong Kong, Cina |

Received: 7 agosto 2011; Accettato: 26 settembre 2011; Pubblicato: 17 ottobre 2011

Copyright: © 2011 Wu et al. Questo è un articolo ad accesso libero distribuito sotto i termini della Creative Commons Attribution License, che permette l'uso senza restrizioni, la distribuzione e la riproduzione con qualsiasi mezzo, a condizione che l'autore originale e la fonte sono accreditati

Finanziamento:. Questo studio è stato sostenuto in parte da sovvenzioni dal Programma nazionale di ricerca di base della Cina (n 2010CB732400, n 2010CB529300), e la National Science Foundation naturale della Cina (n ° 30.801.349). I finanziatori avevano alcun ruolo nel disegno dello studio, la raccolta e l'analisi dei dati, la decisione di pubblicare, o preparazione del manoscritto

Competere interessi:.. Gli autori hanno dichiarato che non esistono interessi in competizione

Introduzione

cancro gastrico, con la morale alto, è stato uno dei tumori più maligni nei paesi asiatici. La sua presenza è un processo multi-fattori e multi-passi, coinvolte nella alterazioni in molte molecole, tra cui l'attivazione di proto-oncogeni, inattivazione di geni oncosoppressori, alterazioni proteine ​​correlate ciclo cellulare e così via. Negli ultimi dieci anni, sono stati trovati un gran numero di proto-oncogeni e geni oncosoppressori. Nonostante il considerevole numero di geni già descritte, sono ancora in fase identificati nuovi geni con attività potenziali o tumore-sopprimere oncogenici. Tuttavia, il meccanismo molecolare di cancerogenesi gastrica rimane poco chiaro.

ribosoma è essenziale per la sintesi proteica in tutte le cellule, che è costituito da RNA ribosomiale (rRNA) e le proteine ​​ribosomali (RPS). Molti RP anche giocare diversi ruoli che sono indipendenti di biosintesi delle proteine, che si chiama extra-ribosomiale funzione [1]. L'aumento più ricerca ha dimostrato che il disturbo della traduzione di proteine ​​partecipato nella tumorigenesi e molte proteine ​​ribosomiali erano disfunzionale nei tumori, ma i meccanismi erano ancora sconosciute [2]. E 'stato proposto che molti RP agiscono come soppressori tumorali haploinsufficient a base di pesce e molti RPS geni potrebbe anche essere oncogeni in natura umana [3]. La prima relazione sui rapporti tra RP e tumori è stato pubblicato in 90 s del disfunzionale 20 ^{secolo, che ha dimostrato l'associazione di RPS19 con la progressione carcinoma del colon e la differenziazione [4] .Thereafter, sempre più RP sono stati trovati nei tumori , come l'elevata espressione di RPL19 nei tumori della mammella [5], [7], RP marcatore di rilevamento già sovra-espressione di RPL7a e RPL37 in campioni di tessuto prostatico-cancro [6], più alta espressione di RPL15 nel cancro esofageo di squamose umana carcinoma della cervice uterina [8], e sovra-espressione di RPL36a associato proliferazione cellulare nel carcinoma epatocellulare [9] e così via. I rapporti riguardanti l'associazione della RP con carcinogenesi erano ancora in aumento [2], [10]. Tuttavia, i ruoli esatti di RP nello sviluppo del tumore sono diverse e ancora bisogno di ulteriori chiarimenti.}

In precedenza, abbiamo analizzato i profili di mRNA di una linea cellulare di cancro gastrico umano SGC7901 e il suo multi-resistente variante SGC7901 /VCR dal differenziale visualizzati PCR e la soppressione ibridazione sottrattiva [11], [12]. RPL6 è stato identificato come uno degli oltre-espresso geni in SGC7901 /ADR rispetto al SGC7901, che è stata ulteriormente confermata mediante RT-PCR e analisi Northern blot [13]. Studi successivi hanno rivelato che up-regolazione di RPL6 protetto cellule di cancro gastrico da apoptosi adriamicina indotta e migliorato la resistenza delle cellule di cancro gastrico a più farmaci chemioterapici, tra cui vincristina, adriamicina, etoposide, cisplatino e 5-fludrouracil [13]. Questi dati hanno indicato che RPL6 potrebbe promuovere i fenotipi maligni delle cellule di cancro gastrico, che ci hanno portato a condurre lo studio successivo di esplorare ulteriormente il ruolo esatto di RPL6 nella carcinogenesi e lo sviluppo del cancro gastrico. Poi abbiamo scoperto che geneticamente up-regolazione di RPL6 nelle cellule GES potrebbe accelerare la crescita e migliorare in vitro formazione di colonie capacità delle cellule GES mentre down-regulation di RPL6 potrebbe esporre i risultati opposti. Inoltre, up-regolazione di RPL6 potrebbe promuovere G1 a S fase di transizione delle cellule GES. Ulteriori studi hanno dimostrato che RPL6 up-regolati E l'espressione della ciclina nelle cellule GES [14]. Presi insieme, questi dati suggeriscono che RPL6 potrebbe promuovere i fenotipi maligni delle cellule di cancro gastrico e RPL6 potrebbe svolgere un ruolo oncogenico nella tumorigenesi e lo sviluppo del cancro gastrico, che ci ha portato a condurre questo studio per esplorare il potenziale ruolo di RPL6 nel gene la terapia del cancro gastrico e può essere utilizzato come un nuovo approccio per la terapia del cancro gastrico.

Risultati
espressione

RPL6 e ciclina e in campioni di cancro gastrico umano e dei tessuti non neoplastiche adiacenti abbinati

Per esplorare le relazioni tra RPL6 ed espressione della ciclina e con lo sviluppo del cancro gastrico, abbiamo rilevato RPL6 e ciclina e espressione nei tessuti di cancro gastrico e tessuti umani non neoplastiche adiacenti appaiati per colorazione immunoistochimica. I risultati hanno rivelato che RPL6 e ciclina localizzati quasi nel citoplasma e solo occasionalmente nei nuclei di cellule di cancro gastrico (Fig. 1A). Ulteriori analisi ha scoperto che il rapporto positivo (tra cui esemplari che macchiato) di RPL6 era 84% (46 su 55 pazienti) mentre il rapporto positivo della ciclina E è stata del 75% (41 su 55 pazienti) in campioni di cancro gastrico umano. Il rapporto positivo di entrambi RPL6 e ciclina E è stato del 70% (38 su 55 pazienti) mentre il rapporto negativo (compresi i campioni che non macchia) sia RPL6 e ciclina E è stata dell'11% (6 su 55 pazienti) in campioni di cancro gastrico umano . Il rapporto positivo di entrambi RPL6 e ciclina E è stata del 18% (8 su 55 pazienti) nei tessuti non neoplastiche adiacenti abbinati (dati non riportati). Per quanto riguarda le differenze tra espressione RPL6 ed espressione ciclina in campioni di cancro gastrico umano, non c'era alcuna differenza. Il presente studio ha dimostrato che RPL6 e ciclina E espressioni in campioni di cancro gastrico umano sono stati relativa (Figura 1B, p. ≪ 0,05), che possono svolgere un ruolo di con-generoso nello sviluppo del cancro gastrico e RPL6 e ciclina E può servire come un biomarker per gastrica diagnosi del cancro e un bersaglio per la terapia genica del cancro gastrico. Alla fine del follow-up, il tempo di sopravvivenza dei pazienti sono stati analizzati con il metodo di Kaplan-Meier ei risultati rivelato che durante pazienti che sono stati seguiti, pazienti con sia RPL6 positivo e ciclina E positivo mostrato un tempo di sopravvivenza più breve e più povera prognosi di quelli sia con RPL6 negativo e ciclina e espressione negativa, o quelli con RPL6 positivo e ciclina e negativo o con RPL6 negativo e ciclina espressione positiva rispettivamente (Fig 2 A, p. < 0,01), che può essere rivelato che i pazienti con entrambi RPL6 positivo e ciclina E positivo mostrato prognosi infausta. Si è anche dimostrato che i pazienti con RPL6 espressione negativa mostrato tempo di sopravvivenza più lungo di RPL6 quelli positivi (Figura 2B, p. ≪ 0,01), e pazienti con ciclina E espressione positiva mostrato prognosi infausta (fig 2C, p. ≪ 0,01). Pertanto, una conclusione si può trarre che RPL6 può servito come biomarker per valutare la prognosi dei pazienti affetti da cancro gastrico.

L'espressione di RPL6 in linee cellulari di cancro gastrico e dei suoi derivati ​​

Per esplorare ulteriormente il ruolo potenziale di RPL6 nella terapia genica del cancro gastrico, le cellule SGC7901 e AGS sono state trasfettate con specifici RPL6 siRNA ed è stato prodotto il pool misto di varianti cellulari G418-resistenti. Le varianti G418 resistenti ospitano specifici siRNA-RPL6 sono stati quindi chiamati come SGC7901-siRPL6-1, AGS-siRPL6-1 e SGC7901-siRPL6-2, AGS-siRPL6-2. Le cellule G418-resistenti che ospitano scramble plasmidi siRNA sono stati progettati come rispettivamente SGC7901-siControl e AGS-siControl. Come mostrato in figura 3A, espressione RPL6 era significativamente down-regolato in SGC7901-siRPL6-1, AGS-siRPL6-1 e SGC7901-siRPL6-2, le cellule AGS-siRPL6-2 rispetto alle cellule parentali e le cellule di controllo. Nel presente studio, SGC7901-siRPL6-2 e AGS-siRPL6-2 mostrato risultati inibitori più efficaci, che hanno indicato che le cellule SGC7901-siRPL6-2 e AGS-siRPL6-2 potrebbero essere utilizzati come un buon modello cellulare di chiarire il potenziale ruolo della RPL6 nella terapia genica del cancro gastrico per clinica.

l'abbassamento del RPL6 sopprimere la crescita delle cellule del cancro gastrico in vitro

per studiare se down-regolazione dell'espressione RPL6 potrebbe inibire la crescita di SGC7901 e cellule AGS, cellule parentali, cellule di controllo e le loro varianti sono state seminate in piastre di coltura e la loro crescita è stata monitorata ogni giorno con saggio MTT. Come indicato dalle curve di crescita in figura 3B, di controllo (SGC7901-siControl e AGS-siControl), le cellule hanno mostrato un tasso di crescita simile a quella dei genitori (SGC7901 e AGS), le cellule rispettivamente, mentre SGC7901-siRPL6-1, AGS-siRPL6-1 e SGC7901 cellule -siRPL6-2, AGS-siRPL6-2 esposti tasso di crescita inferiore rispetto alle cellule di controllo, e SGC7901-siRPL6-2, le cellule AGS-siRPL6-2 hanno mostrato il tasso più basso di crescita (Fig 3B, p. < 0,05). La crescita ancoraggio-indipendente di queste cellule è stato ulteriormente analizzato con morbido saggio di formazione di colonie di agar. E 'stato rivelato che SGC7901-siRPL6-1, AGS-siRPL6-1 e SGC7901-siRPL6-2, le cellule AGS-siRPL6-2 prodotti molto meno colonie di cellule in agar morbido rispetto ai loro cellule parentali e le cellule di controllo (Fig 3C, P <.; 0.05), le cellule denominate con SGC7901-siRPL6-2 e AGS-siRPL6-2 prodotte colonie meno. Questi dati suggeriscono che down-regulation dei RPL6 potrebbe sopprimere la crescita delle cellule del cancro gastrico ed inibire la capacità formazione di colonie di cellule SGC7901 e AGS.

RPL6 siRNA tumorigenesi inibito di cellule di cancro gastrico in vivo

Per confermare ulteriormente gli effetti della RPL6 sulla tumorigenesi del cancro gastrico, saggio di formazione del tumore è stata eseguita in topi nudi. SGC7901, AGS e SGC7901-siRPL-2, le cellule AGS-siRPL6-2 sono stati inoculati in via sottocutanea destra oa sinistra parte superiore della schiena di topi nudi atimici in un unico sito. (. 4A Fig e C) Quattro settimane più tardi, i topi sono stati uccisi ed i tumori trapiantati sono stati asportati e le dimensioni del tumore sono stati valutati (Fig 4B e D, p. ≪ 0,05). C'è stata una significativa riduzione di dimensioni di xenotrapianti in RPL6 cellule down-regolato. Questi dati hanno indicato che knock-down di RPL6 potrebbe sopprimere gastrica tumorigenesi cellula tumorale in vivo e RPL6 possono svolgere un ruolo chiave nel promuovere la crescita maligna delle cellule di cancro gastrico in vivo.

RPL6 decelerato G1-S fase di transizione SGC7901 cellule

Per scoprire i meccanismi alla base il ruolo soppressivo di RPL6 nella crescita delle cellule del cancro gastrico, sono stati analizzati gli effetti di RPL6 sulla distribuzione del ciclo cellulare delle cellule SGC7901 (Fig. 5A). Come mostrato in figura 5B, cellule SGC7901-siRPL6-1 mostrato lieve aumento della percentuale di fase G1 e diminuzione percentuale della fase S, mentre le cellule SGC7901-siRPL6-2 espressa significativamente aumentata percentuale di fase G1 e diminuzione percentuale della fase S (P < 0,05 ) rispetto alle cellule parentali e le cellule di controllo. Questi hanno indicato che siRNA RPL6-specifica potrebbe rallentare la transizione G1-S di SGC7901 cellule.

RPL6 down-regolato espressione della ciclina E nelle cellule di cancro gastrico a livello proteico

E 'ben noto che la progressione G1-S è controllato da ciclina D /CDK4 e ciclina complessi e /CDK2, che sono regolati da membri della famiglia INK4, p21 e p27, rispettivamente. L'espressione di questi regolatori di SGC7901 e cellule AGS e le sue varianti sono stati determinati mediante analisi Western Blot. Come indicato in figura 6, espressione della ciclina E è risultata significativamente down-regolato nelle cellule AGS-siRPL6-2 SGC7901-siRPL6-2 e. Espressioni di CDK2, p16, p21 e p27 sono rimasti invariati in SGC7901 e AGS varianti cellulari. Questi dati suggeriscono che down-regolazione del RPL6 diminuito l'espressione della ciclina E nelle cellule SGC7901 e AGS, che potrebbe delineare il ruolo potenziale di RPL6 e ciclina E nello sviluppo del cancro gastrico e RPL6 può usato come bersaglio gene per il cancro gastrico in la clinica.

Discussione

il presente studio ha dimostrato che RPL6 e ciclina e sono stati oltre-espresso nei tessuti di cancro gastrico e non vi è una correlazione positiva tra di loro nei tessuti di cancro gastrico. Follow-up risultati hanno rivelato che i pazienti con RPL6 espressione negativa mostrato tempo di sopravvivenza più lungo rispetto a quelli con RPL6 espressione positiva, che ha suggerito che i pazienti positivi RPL6 hanno mostrato prognosi infausta. Ulteriori ricerche hanno dimostrato che down-regolazione di RPL6 da RPL6-specifici siRNA inibito la proliferazione e ancoraggio-indipendente crescita delle linee di cellule di cancro gastrico in vitro, represso progressione del ciclo cellulare e soppresse E espressione della ciclina, inoltre, atterramento di RPL6 da specifici siRNA-RPL6 soppresso capacità formazione del tumore delle cellule di cancro gastrico in vivo.

Nel nostro precedente studio, i geni espressi in modo differenziale associati al multidrug resistance delle cellule di cancro gastrico sono state isolate mediante differential display RT-PCR e ibridazione sottrattiva [11], [ ,,,0],12]. RPL6, un componente della subunità grande del ribosoma, era quindi isolato come clone sovraespressa in cellule di cancro gastrico multiresistenti [11]. È stato dimostrato che RPL6 potrebbe proteggere le cellule del cancro gastrico da chemioterapici apoptosi indotta da farmaci [13]. Questi dati suggeriscono che RPL6 potrebbe coinvolgere nella regolazione del fenotipo maligno di cancro gastrico. Ulteriore studio è stato progettato per esplorare il ruolo del RPL6 nella tumorigenesi e lo sviluppo del cancro gastrico, e ha suggerito che i risultati up-regolazione di RPL6 accelerato la crescita e in colonie vitro la formazione di capacità delle cellule GES, mentre down-regulation dei RPL6 esposto risultati opposti. Inoltre, up-regolazione di RPL6 accelerato G1 a S fase di transizione di cellule GES almeno attraverso up-regolazione dell'espressione della ciclina E mentre down-regulation dei RPL6 ha mostrato risultati opposti [14]. Presi insieme, questi dati suggeriscono che RPL6 potrebbe svolgere un ruolo oncogenico nella tumorigenesi e lo sviluppo del cancro gastrico e potrebbe essere utilizzato come un nuovo approccio alla terapia genica del cancro gastrico.

Al giorno d'oggi, l'aumento più pazienti sono morti di cancro a causa di i fenotipi maligni di loro. La terapia del cancro disturbato persone in tutto il mondo. Oltre a chemioterapia e trattamento di chirurgia, la terapia genica è un nuovo e promettente trattamento del cancro. Uno dei metodi più comunemente utilizzati per la terapia genica è l'interferenza dell'RNA (RNAi). RNAi, un meccanismo di silenziamento genico altamente conservata svolge un ruolo importante nella regolazione dell'espressione genica. Silenziamento genico da un meccanismo post-trascrizionale che coinvolge omologhi RNA a doppio filamento è stato scoperto in sistemi artificiali dove RNA a doppio filamento (dsRNA) è stato introdotto tramite iniezione o per l'espressione di costrutti transgenici. Questo fenomeno avviene piccoli RNA interferenti (siRNA) nel citoplasma di cellule di mammifero. Nella tecnologia siRNA, due meccanismi di fornitura sono stati considerati, la consegna diretta del nucleotide siRNA sintetico e l'introduzione di un DNA plasmide (pDNA), che codifica un costrutto breve tornante (shRNA) che sarebbe enzimaticamente degradata in siRNA [15]. SiRNA giocato i suoi ruoli inibitori facendo corrispondere con le sequenze di mRNA e inibito la conseguente espressione di mRNA e la traduzione, e ha lavorato come regolazione negativa. Al giorno d'oggi, sempre più scienziati hanno scoperto che abbattuto l'espressione genica con siRNA potrebbe sopprimere in modo significativo la crescita tumorale e metastasi. inibitore X-linked di proteine ​​apoptosi (XIAP), un importante membro degli inibitori della proteina dell'apoptosi (IAP) di famiglia, è coinvolto nel controllo della divisione cellulare, la proliferazione cellulare e l'inibizione della apoptosi [16], [17]. Down-regulation dei XIAP da siRNA potrebbe sopprimere in modo significativo la proliferazione delle cellule tumorali e di sensibilizzare le cellule tumorali agli agenti chemioterapici [18], [19]. Osteopontina (OPN) di proteine, che è stato over-espresso nella maggior parte dei pazienti affetti da cancro gastrico e associata con la sua patogenesi, ha svolto un ruolo importante nella proliferazione, invasione, metastasi e la sopravvivenza del cancro gastrico [20]. Poi down-regulation di OPN da OPN-specifici siRNA significativamente inibito la crescita, la migrazione e l'invasione delle cellule di cancro gastrico [21]. CML66, un antigene tumorale romanzo che ha avuto un ruolo oncogeno, era finita-espressi nella maggior parte delle linee di cellule di cancro e tumori [22], abbattendo la sua espressione da CMl66-specifici siRNA significativamente inibito la proliferazione, invasione e metastasi delle cellule HeLa sia in vivo e in vitro [23]. FABP5, che codifica acido grasso cutaneo binding protein (C-FABP), è up-regolato nel cancro della prostata e agisce come un oncogene putativo. Down-regulation dei FABP5 da siRNA efficacemente inibito la crescita delle cellule del cancro alla prostata-specific FABP5 in topi nudi [24]. Inoltre, quando RPS13 proteina ribosomiale che ha migliorato gastrica linea di cellule di cancro crescita SGC7901 è stato abbattuto da specifici RPS13 siRNA, è la crescita delle cellule ha inibito significativamente SGC7901 e colonie capacità formano in vitro e soppresso capacità formazione di tumori nel topo nudo [25]. La ricerca precedente ha anche scoperto che la consegna sistemica di siRNA via atelocollagen, che si rivolge in particolare i tumori, è sicura e fattibile per la terapia del cancro nel cancro della prostata [26]. Pertanto, le prove sopra suggerito che siRNA, inibendo l'espressione genica potrebbe essere un nuovo approccio per la terapia del cancro e rendere la terapia genica del cancro fattibile per il trattamento clinico.

Nel presente studio, espressioni di RPL6 e ciclina E in gastrica tessuti tumorali e tessuti non neoplastiche adiacenti abbinati sono stati rilevati ed i risultati hanno indicato che RPL6 e ciclina e ha mostrato l'espressione più alta nei tessuti di cancro gastrico che in tessuti non neoplastici adiacenti abbinati. Inoltre, vi è una correlazione tra l'espressione RPL6 e ciclina E nei tessuti di cancro gastrico, che ha suggerito che essi possono svolgere un ruolo con-generoso nello sviluppo del cancro gastrico e RPL6 potrebbero servire come biomarcatori per la diagnosi del cancro gastrico. Follow-up risultati hanno dimostrato che i pazienti con entrambe le RPL6 espressioni positive positive e ciclina E hanno mostrato un tempo di sopravvivenza più breve e prognosi peggiore rispetto al controllo corrispondente e ha anche indicato che i pazienti con RPL6 espressione negativa mostrato tempo di sopravvivenza più lunga e migliore la prognosi di pazienti con RPL6 espressione positiva, che ha suggerito che RPL6 può servito come biomarker per il cancro gastrico la prognosi e un bersaglio per la terapia genica del cancro gastrico in clinica.

per esplorare ulteriormente il potenziale fattibilità di RPL6 come bersaglio la terapia genica del cancro gastrico in clinica, abbiamo bussato giù espressione RPL6 in SGC7901 e cellule AGS da specifici RPL6 siRNA, i risultati hanno mostrato che la down-regolazione di RPL6 in linee cellulari di cancro gastrico parentali (SGC7901 e AGS) la crescita delle cellule in modo efficace e inibito in vitro colonia capacità di formazione. Inoltre, l'analisi del ciclo cellulare indicato che down-regulation dei RPL6 decelerato G1 a S fase cellule di cancro gastrico. Analisi Western Blot ha dimostrato che RPL6 inibito la progressione del ciclo cellulare attraverso down-regolazione di esperimenti di formazione ciclina E. tumore nei topi nudi ha suggerito che down-regulation dei RPL6 potrebbe sopprimere la formazione di tumori in vivo.

La ciclina E, una cellula chiave proteine ​​ciclo che ha giocato un ruolo chiave in transizione G1-S era in disordine in molti tumori diversi [27], [28], [29], [30], [31]. Precedenti ricerche hanno dimostrato che la ciclina E è una molecola importante nella tumorigenesi. Nel presente studio, abbiamo scoperto che l'espressione della ciclina E, insieme con RPL6 era maggiore nei tessuti di cancro gastrico umano da quello in abbinati tessuti non neoplastici adiacenti, che hanno suggerito il ruolo della ciclina E ha giocato nello sviluppo del cancro gastrico. Ulteriori ricerche hanno dimostrato che RPL6 influenzato la crescita delle cellule regolando ciclina E, che ha dimostrato che un'alta espressione della ciclina E ha accelerato la crescita cellulare, mentre una bassa espressione della ciclina E decelera la proliferazione cellulare. Ciclina E e RPL6 possono svolgere ruoli con-generoso nello sviluppo del cancro gastrico

In conclusione., Il presente studio ha dimostrato che l'espressione RPL6 e ciclina sono stati associati con l'altro nei tessuti di cancro gastrico e che potrebbe svolgere con- ruoli generosi nello sviluppo del cancro gastrico, che ha suggerito che RPL6 può utilizzato come strumento diagnostico nel cancro gastrico. Follow-up analisi dei dati ha dimostrato che i pazienti con RPL6 espressione negativa mostrato tempo di sopravvivenza più lunga e migliore la prognosi di pazienti con RPL6 espressione positiva dopo l'intervento, il che suggerisce che RPL6 servito come biomarker per il cancro gastrico la prognosi e un obiettivo gene romanzo per la terapia del cancro gastrico. Ulteriore studio ha indicato che down-regolazione dell'espressione RPL6 da RPL6-specifici siRNA inibito SGC7901 la crescita cellulare e nella capacità formazione di colonie in vitro, decelerato SGC7901 cella G1 a S transizione di fase, e ha soppresso la formazione di tumori in vivo. In conclusione, il nostro studio attuale ha confermato che RPL6 siRNA potrebbe essere utilizzato come un nuovo approccio per la terapia del cancro gastrico per clinica.

Materiali e Metodi

Etica Dichiarazione

Per i campioni di tessuto , tutti i pazienti sono stati informati il ​​consenso ad utilizzare i campioni patologici in eccesso per scopi di ricerca. I protocolli utilizzati in questo studio sono stati approvati dalla protezione dell'ospedale del comitato soggetti umani. L'uso di tessuti umani è stato approvato dal Comitato Etico della Quarta Università Medica Militare ed è stato conforme alla Dichiarazione di Helsinki e alla legislazione locale. I pazienti che offrono campioni per lo studio firmato moduli di consenso informato. Per la ricerca sugli animali, tutte le procedure per la sperimentazione animale sono stati eseguiti in conformità con le linee guida istituzionali cura degli animali e del Comitato uso del centro Animal Esperimento della Quarta Università Medica Militare. L'ID autorizzazione per l'utilizzo degli animali è stato numero 10218 da Esperimento Centro Animal della Quarta Università Medica Militare.

I campioni di tessuto e linee cellulari

I campioni di tessuto incorporati con paraffina sono stati raccolti da 55 pazienti con cancro gastrico che ha subito gastrectomia nel nostro ospedale tra il 2004 e il 2009. Tutti i casi di cancro gastrico e tessuti non tumorali adiacenti sono stati diagnosticati clinicamente e patologicamente. I dati sulle caratteristiche clinico-patologici e prognosi dei pazienti sono stati raccolti e analizzati in modo retrospettivo. Un totale di 55 pazienti sono stati seguiti fino alla fine dell'anno 2009 e due di loro sono stati persi durante il periodo di follow-up. gastrica linea di cellule di adenocarcinoma umano SGC7901 è stato ottenuto dalla Academy of Military Medical Science, AGS è stato ottenuto dalla Shanghai Cell Bank (Shanghai, Cina). Le due linee di cellule sono state conservate nel nostro istituto. Tutte le linee cellulari sono state mantenute in RPMI1640 (Invitrogen, Carlsbad, CA) supplementato con 10% inattivato al calore vitello siero fetale (FCS) a 37 ° C con 5% di CO _{2 in un incubatore umidificato (Forma Scientific, Marietta, OH).}

immunoistochimica e immunoistochimica punteggio

deparaffinate e sezioni reidratati sono stati lavati in acqua dolce per 10 minuti. Calore indotta recupero dell'antigene è stata eseguita per 20 minuti a 95 ° C con tampone citrato di sodio 10 mM (pH 6.0). Dopo i vetrini sono stati raffreddati a temperatura ambiente per 40 minuti, sono stati bloccati in perossido di idrogeno al 3% per 20 minuti e poi in normale liquido confinare capra siero per 40 minuti. Dopo questo, sono stati autorizzati a reagire durante la notte a 4 ° C con anticorpi primari per IgG, RPL6 e ciclina (Santa Cruz). Dopo il riscaldamento per 40 minuti, sono stati poi reagito con seconde anticorpi (Zhongshan Goldenbridge Biotecnologie CO.LTD) per altri 40 minuti a temperatura ambiente. Poi i prodotti sono stati sviluppati con 3,3 'Diaminobenzidina e di contrasto con ematossilina. Scoring è stata completata da un patologo specialista e uno scienziato che non erano a conoscenza delle informazioni cliniche e patologiche. In caso di discrepanza, un consenso è stato raggiunto dalla conferenza. Le proporzioni di cellule positive (da 0 a +3) e le intensità di colorazione (0 a +3) sono stati valutati separatamente ad un ingrandimento di 200 ×. Il primo è stato calcolato contando il numero di cellule tumorali colorate tra il numero totale di cellule tumorali, per esempio, quando il 25% delle cellule totali erano macchiati, il punteggio percentuale era +1, e il 50% pari a +2, 75% eguali a +3, 0% è uguale a 0. il punteggio intensità è stata valutata dal colore della macchiato nucleo delle cellule tumorali, in particolare, il punteggio 0 significa acromatica, +1 significa ambra, +2 significa giallo, e +3 significa marrone. punteggio combinato + 1~ + 2 sono stati definiti "negativi", e + 3~ + 6 sono stati considerati "positivo".

Edilizia plasmidi e trasfezione

Due coppie di tornanti small interfering RNA (siRNA ) oligo per RPL6 sono stati progettati secondo le linee guida di progettazione siRNA di Takara Biotechnology Co., Ltd. Confronta sequenze bersaglio al database genoma umano in una ricerca BLAST per eliminare dalla considerazione qualsiasi sequenza bersaglio con 21 paia di basi di omologia contigua ad altre sequenze codificanti . Per oligo-1, il senso: 5'-GATCCGGAGAAGGTTCTCGCAACTTTCAAGAGAAGTTGCGAGAACCTTCTCCTTTTTTGGAAA-3 ', antisenso: 5'AGCTTTTCCAAAAAAGGAGAAGGTTCTCGCAACTTCTCTTGAAAGTTGCGAGAACCTTCTCCG-3'; per oligo-2, il senso: 5'-GATCCGTCGAGTTCCTCTACGAAGATTCAAGAGATCTTCGTAGAGGAACTCGATTTTTTGGAAA-3 ', antisenso: 5'-AGCTTTTCCAAAAAATCGAGTTCCTCTACGAAGATCTCTTGAATCTTCGTAGAGGAACTCGACG-3'; Un duplex scramble DNA è stato progettato anche come controllo, per oligo-1, il senso: 5'-GATCCGGTGAGATCTTCGACACAGTTCAAGAGACTGTGTCGAAGATCTCACCTTTTTTGGAAA-3 ', antisenso: 5'-AGCTTTTCCAAAAAAGGTGAGATCTTCGACACAGTCTCTTGAACTG TGTCGAAGATCTCACCG-3'. Per ricottura per formare duplex DNA, 0,01 M ciascuno di senso e antisenso oligonucleotidi sono stati utilizzati. I duplex sono stati diluiti e poi legatura con pSilencer3.1-H1 neo vettore (Takara Biotechnology (Dalian) Co., Ltd). I prodotti sono stati trasformati in celle DH5α-competenti. colonie Ampicillina resistenti sono stati scelti, identificato per restrizione digestione, e in seguito confermate mediante sequenziamento del DNA. Secondo le istruzioni del fabbricante, siRNA plasmidi di RPL6 sono state trasfettate in SGC7901 cellule utilizzando Lipofectamine 2000 reagente (Invitrogen, Carlsbad, CA), rispettivamente. Ventiquattro ore dopo la trasfezione, G418 (400 mcg /ml) è stata aggiunta nel terreno di coltura per stabilire cloni stabili. I cloni misti sono stati espansi per ulteriori 2 mesi. Le cellule SGC7901 e AGS (chiamati anche cellule parentali) esprimono stabilmente RPL6 esogena sono stati nominati come SGC7901-siRPL6-1, AGS-siRPL6-1 e SGC7901-siRPL6-2, AGS-siRPL6-2. E cellule trasfettate con siControl sono stati nominati come SGC7901-siRPL6 Controllo e AGS-siRPL6 controllo (chiamati anche cellule di controllo).

La proliferazione cellulare saggio

3- (4,5-dimetiltiazol-2- il) -2,5-difenil-tetrazolio bromuro (MTT) è stata eseguita per valutare l'effetto della RPL6 sulla proliferazione cellulare, come precedentemente descritto [32]. L'assorbanza a 490 nm (A490) di ogni pozzetto è stato letto su un lettore per micropiastre BP800 (Biohit, Helsinki, Finlandia). Ogni esperimento è stato eseguito in quadruplicates ed è stato ripetuto per 3 volte.

saggi formazione di colonie soft agar

saggio di formazione di colonie soft agar stata utilizzata per determinare il potenziale di crescita delle cellule ancoraggio-indipendente. Dodici pozzetti sono state riempite con 0,5 ml di 0,5% agar nobile (Invitrogen) in RPMI1640 supplementato con 10% di siero bovino come strato di fondo e lascia solidificare a 4 ° C durante la notte. Un totale di 200 cellule sono state sospese in 0,25 ml di 0,3% agarosio e seminati su agar fondo. piastre di coltura cellulare sono stati mantenuti per 2 settimane in una CO _{2 incubatore. Il numero di colonie è stato contato al microscopio.}

tumorigenicità in nude topo

formazione del tumore è stata condotta per valutare gli effetti di RPL6 sulla tumorigenicità in vivo. BALB /c topi nudi di 4 a 6 settimane sono stati forniti da Shanghai Cancer Institute ed alloggiato in gabbie micro-sezionatore sotto pressione positiva, e mantenuta ad una temperatura costante (22 ° C) e umidità per lo studio tumorigenicità. Circa 3 × 10 ^{6 celle in fase di log sono stati raccolti e iniettato per via sottocutanea nella parte superiore della schiena di BALB /c topi nudi. Almeno tre topi nudi sono stati usati per ogni gruppo. I topi sono stati uccisi dopo 4 settimane e il peso del tumore di ogni topo è stata valutata. Tutte le procedure per la sperimentazione animale sono stati eseguiti in conformità con le linee guida istituzionali cura degli animali e del Comitato uso del centro Animal Esperimento della Quarta Università Medica Militare.}

ciclo cellulare analisi

Per l'analisi del ciclo cellulare distribuzione di fase, SGC7901 e le sue varianti in fase di log sono state raccolte e lavate due volte con PBS ghiacciato. pellet cellulari sono stati fissati in etanolo al 70%, trattato con RNasi A (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN) e colorati con ioduro di propidio (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO).

• PLoS ONE: La riparazione del DNA Gene APE1 T1349G polimorfismo e rischio di cancro gastrico in una popolazione cinese
• PLoS ONE: perdita della proteina leucemia promielocitica in cancro gastrico: implicazioni per IP-10 Espressione e Tumor-linfociti infiltranti