Ploche ONE: znižujúce množstvo RPL6 podľa siRNA inhibuje proliferáciu a progresiu bunkového cyklu na žalúdočné rakovinu bunkových línií ľudského

Abstract

Naše predchádzajúce štúdie ukázali, že ľudský ribozomálnu proteín L6 (RPL6) je up-regulovaný u karcinómu žalúdka bunkách multirezistentných a zvýšená expresia RPL6 mohla chrániť karcinómu žalúdka z apoptózy vyvolané liekmi. Ďalej bolo preukázané, že up-regulácia RPL6 zrýchlenie rastu a zvýšenie v kolónie tvoriacich schopnosti in vitro GES buniek, zatiaľ čo down-regulácia RPL6 vykazovali opačné výsledky. Táto štúdia bola navrhnutá tak, aby skúmať potenciálny úlohu RPL6 pri liečbe rakoviny žalúdka na klinike. Expresie RPL6 a cyklin E v žalúdočnej rakovinové tkanive a normálne žalúdočnej sliznici bola hodnotená immunohistochemisty. Bolo zistené, že RPL6 a cyklin E boli vyjadrené na vyššej úrovni v žalúdočnej rakovinové tkanive než v normálnej žalúdočnej sliznici a dva boli korelačné u karcinómu žalúdka. Doba prežitia z pacientov po operácii bol analyzovaný pomocou Kaplan-Meierovej analýzy a zistilo sa, že pacienti s RPL6 pozitívny expresiou preukázala kratší čas prežitia ako pacienti, ktoré sa RPL6 negatívnym výrazom. RPL6 bola potom geneticky down-regulované v žalúdku SGC7901 rakoviny a AGS bunkových línií pomocou siRNA. Bolo preukázané, že down-regulácia RPL6 znižuje schopnosť kolónie buniek karcinómu žalúdka in vitro tvárnenie a znižuje rast buniek in vivo. Okrem toho, down-regulácia RPL6 mohol potlačiť G1 do S fázy prechodu v týchto bunkách. Ďalej sme preukázané, že RPL6 siRNA down-regulované cyklin E expresiu v SGC7901 a AGS buniek. Vzaté dohromady, tieto údaje naznačujú, že RPL6 bol nadmerne exprimovaný v ľudských tkanivách a žalúdočných spôsobilo zlú prognózu. Down-regulácia RPL6 mohol potlačiť rast buniek a progresie bunkového cyklu aspoň cez down-reguláciu cyklin E, a ktoré by mohlo byť použité ako nový prístup k liečbe rakoviny žalúdka

Citácia :. Wu Q, Y Gou, Wang Q, Jin H, Cui L, Zhang Y, et al. (2011) znižujúce množstvo RPL6 podľa siRNA inhibuje proliferáciu a progresiu bunkového cyklu na žalúdočné rakovinu Human bunkových línií. PLoS ONE 6 (10): e26401. doi: 10,1371 /journal.pone.0026401

Editor: Xin-Yuan Guan, The University of Hong Kong, Čína

Prijaté: 7. augusta 2011; Prijaté: 26.septembra 2011; Uverejnené: 17.října 2011

Copyright: © 2011 Wu et al. Toto je článok o otvorený prístup distribuovaný pod podmienkami Creative Commons Attribution licencie, ktorá umožňuje neobmedzené použitie, distribúciu a reprodukciu v nejakom médiu, za predpokladu, že pôvodný autor a zdroj sú pripísané

Financovanie :. Táto štúdia bol podporený v rámci dotácií z Národného programu výskumu Základné Číny (č 2010CB732400, No. 2010CB529300) a Národná prírodná Science Foundation Číny (No. 30801349). Platcovia mal žiadnu úlohu v dizajne štúdie, zber a analýzu dát, rozhodnutie publikovať, alebo prípravu rukopisu

Konkurenčné záujmy: .. Autori vyhlásili, že žiadne konkurenčné záujmy neexistujú

Úvod

karcinóm žalúdka, s vysokou morálkou, bol jedným z najviac zhubných nádorov v ázijských krajinách. Jeho výskyt bol proces s multi-faktormi a multi-krokoch, podieľajúcich sa na zmeny v mnohých molekúl, vrátane aktivácie protoonkogeny, inaktivácia tumor-supresorových génov, zmeny v proteínoch spojených bunkového cyklu a tak ďalej. V posledných desiatich rokoch sa zistilo, že veľké množstvo preto-onkogénov a tumor-supresorových génov. Aj napriek značné množstvo génov už bolo popísané, sú stále identifikované nové gény s onkogénne alebo nádor potlačenie aktivity. Avšak molekulárnej mechanizmus žalúdočnej karcinogenézy zostáva nejasný.

ribozómov je nevyhnutný pre syntézu bielkovín vo všetkých bunkách, ktorá je tvorená z ribozomálnej RNA (rRNA) a ribozomálnu proteíny (RPS). Mnoho RPR tiež hrajú rôzne role, ktoré sú nezávislé biosyntézy proteínu, ktorý sa nazýva extra-ribozomálnu funkcie [1]. Zvyšujúci sa ďalší výskum preukázal, že porucha translácie proteínu podieľala na vzniku nádorov a mnoho ribozomálnu proteíny boli dysfunkčné v nádoroch, ale mechanizmy boli doteraz neznáme [2]. Bolo navrhnuté, že veľa RPR pôsobiť ako haploinsufficient nádorové supresormi v rybách a mnoho RPR génov môžu byť tiež onkogény v ľudskom druhu [3]. Najstaršia správa o vzťahoch medzi RPR a nádorov bol publikovaný v 90. rokoch 20. ^{th storočia, ktorá preukázala asociáciu RPS19 s výhradou progresie karcinómu hrubého čreva a diferenciácie [4] .Thereafter bolo zistené, že viac a viac RPR dysfunkčné v nádoroch , ako napríklad vysokú expresiou RPL19 v nádoroch prsníka [5], zvýšená expresia RPL7a a RPL37 vo vzorkách prostaty, rakovina tkaniva [6], vyššie expresiu RPL15 v rakoviny pažeráka [7], RPR ako včasnú detekciu markeru ľudského spinocelulárneho karcinóm krčka maternice [8], a zvýšená expresia RPL36a spojených s bunkovou proliferáciou v hepatocelulárnym karcinómom [9], a tak ďalej. Správy týkajúce sa pridružení RPR s karcinogenéze boli stále zvyšuje [2], [10]. Avšak, presnej úlohy RPR vo vývoji nádoru sú rozmanité a je ešte potrebné ďalšie objasnenie.}

Predtým sme analyzovali mRNA profily ľudského karcinómu žalúdka bunkové línie SGC7901 a jeho multirezistentnej variant SGC7901 /VCR diferenciálnymi zobrazí PCR a potlačenie subtraktívnu hybridizácia [11], [12]. RPL6 bol identifikovaný ako jeden z viac ako exprimované génov v SGC7901 /ADR v porovnaní s SGC7901, ktorá bola ďalej potvrdená pomocou RT-PCR a Northern blot analýzy [13]. Ďalšie štúdie ukázali, že up-regulácia RPL6 chránenej buniek karcinómu žalúdka z adriamycinové apoptóze a zvýšenú odolnosť buniek karcinómu žalúdka do viacerých chemoterapeutických liečiv, vrátane vinkristín, adriamycín, etopside, cisplatinou a 5-fludrouracil [13]. Tieto údaje naznačujú, že RPL6 by mohla podporiť malígne fenotypy buniek karcinómu žalúdka, ktoré nás viedli k vykonanie následnej štúdii s cieľom ďalej skúmať presný úlohu RPL6 v karcinogenéze a rozvoju rakoviny žalúdka. Potom sme zistili, že geneticky up-regulácia RPL6 v GES buniek by mohol urýchliť rast a zvýšiť in vitro kolónie tvoriacich schopnosť GES buniek, zatiaľ čo down-regulácia RPL6 mohol vykazovať opačné výsledky. Okrem toho up-regulácia RPL6 mohol podporiť G1 do S fázy prechodu GES buniek. Ďalšie štúdie preukázali, že RPL6 up-regulované cyklin E expresiu v GES bunkách [14]. Dohromady tieto údaje naznačujú, že RPL6 by mohla podporiť malígne fenotypy buniek karcinómu žalúdka a RPL6 by mohli zohrať onkogénne úlohu pri vzniku nádorov a vznikom rakoviny žalúdka, čo nás viedlo na vykonanie tejto štúdie, aby preskúmala potenciálny úlohu RPL6 v géne terapia rakoviny žalúdka a môže byť použitý ako nový prístup k liečbe rakoviny žalúdka.

Výsledky

RPL6 a cyklin E expresie v ľudských vzorkách s karcinómom žalúdka a spárované priľahlé non-neoplastické tkaniva

Ak chcete preskúmať vzťahy medzi RPL6 a cyklin E výraz s rozvojom rakoviny žalúdka, sme zistili RPL6 a cyklin E expresiu v ľudských rakovinových tkanív a žalúdočných uzavreté okolitom normálnom tkanive imunohistochemickým farbením. Výsledky odhalili, že RPL6 a cyklin lokalizované v cytoplazme a takmer len občas v jadrách vo buniek karcinómu žalúdka (obr. 1A). Ďalšie analýzy zistili, že pozitívny pomer (vrátane vzoriek, ktoré zafarbené) z RPL6 bola 84% (46 z 55 pacientov), ​​zatiaľ čo pozitívny pomer cyklin E bola 75% (41 z 55 pacientov) v ľudských vzorkách s karcinómom žalúdka. Pozitívny pomer oboch RPL6 a cyklin E bola 70% (38 z 55 pacientov), ​​zatiaľ čo negatívne pomer (vrátane vzoriek, ktoré neboli škvrna) oboch RPL6 a cyklin E bola 11% (6 z 55 pacientov) v ľudských vzorkách s karcinómom žalúdka , Pozitívny pomer oboch RPL6 a cyklin E bola 18% (8 zo 55 pacientov) u odpovedajúcich okolitom normálnom tkanív (dáta nie sú uvedené). Pokiaľ ide o rozdiely medzi RPL6 expresiu a expresiu cyklin v ľudských vzorkách s karcinómom žalúdka, nebol zistený žiadny rozdiel. Táto štúdia preukázala, že RPL6 a cyklin E výrazy v ľudských vzorkách s karcinómom žalúdka boli relatívne (obr 1B, p. ≪ 0,05), čo môže hrať con-veľkorysý úlohu vo vývoji karcinómu žalúdka a RPL6 a cyklin E môže slúžiť ako biomarker pre žalúdočné diagnostike rakoviny a génovej cieľ pre terapiu rakoviny žalúdka. Na konci sledovanie, doba prežitia pacientov boli analyzované metódou Kaplan-Meier a výsledky odhalili, že v priebehu pacientov, ktorí boli sledovaní, pacienti s oboma RPL6 pozitívne a cyklin E pozitívne vykazovali kratšiu dobu prežitia a horšiu prognózu ako tí, s oboma RPL6 negatívne a cyklin E negatívne expresie, alebo tie, ktoré sa RPL6 pozitívne a cyklin E negatívne alebo s RPL6 negatívne a cyklin pozitívne expresie v danom poradí (obrázok 2 a, p. < 0,01), čo môže byť odhalené, že pacienti s oboma RPL6 pozitívne a cyklin E pozitívne ukázal zlú prognózu. Je tiež preukázané, že pacienti s RPL6 negatívnym výrazom ukázal dlhšiu dobu prežitia než RPL6 pozitívnych (obr 2B, str. ≪ 0,01), a pacienti s cyklin E pozitívnym výrazom ukázal zlou prognózou (Obr 2C, p. ≪ 0,01). Preto nemožno urobiť záver, že RPL6 môže slúžil ako biomarkeru pre vyhodnotenie prognózu pacientov s karcinómom žalúdka.

Vyjadrenie RPL6 v žalúdočných rakovinových bunkových línií a jej deriváty

Ak chcete ďalej preskúmať potenciálny úloha RPL6 v génovej terapii rakoviny žalúdka, SGC7901 a AGS bunky boli transfekovány RPL6 špecifické siRNA a bol vyrobený zmesový pool G418-rezistentných variantov buniek. K G418 rezistentné varianty nesúcich RPL6 špecifické siRNA boli primerane pomenované ako SGC7901-siRPL6-1, AGS-siRPL6-1 a SGC7901-siRPL6-2, AGS-siRPL6-2. Tieto G418 rezistentné bunky nesúce zakódované siRNA plazmidy boli navrhnuté ako SGC7901-siControl a AGS-siControl resp. Ako je znázornené na obrázku 3A, RPL6 expresia významne bola down-regulované v SGC7901-siRPL6-1, AGS-siRPL6-1 a SGC7901-siRPL6-2, AGS-siRPL6-2 buniek v porovnaní s rodičovskými bunkami a kontrolné bunky. V tejto štúdii, SGC7901-siRPL6-2 a AGS-siRPL6-2 ukázal účinnejší inhibičný výsledky, ktoré ukázali, že bunky SGC7901-siRPL6-2 a AGS-siRPL6-2 by mohol byť použitý ako dobrý model bunkovej objasniť potenciál úloha RPL6 v génovej terapii rakoviny žalúdka na kliniku.

upregulace RPL6 potláčať žalúdočné rast nádorových buniek in vitro

pre štúdium, či down-regulácia expresie RPL6 môže blokovať rast a SGC7901 AGS bunky, rodičovskej bunky v kontrolných bunkách, a ich varianty boli vrúbľovať do kultivačných doštičiek a ich rast bol monitorovaný každý deň s MTT testom. Ako je uvedené v rastových kriviek na obrázku 3B, kontrola (SGC7901-siControl a AGS-siControl) bunky vykazovali podobnú mieru rastu na rodičovskú (SGC7901 a AGS) buniek v tomto poradí, zatiaľ čo SGC7901-siRPL6-1, AGS-siRPL6-1 a SGC7901 -siRPL6-2, AGS-siRPL6-2 bunky vykazovali nižší tempo rastu ako v kontrolných bunkách, a SGC7901-siRPL6-2, AGS-siRPL6-2 bunky vykazovali najnižšiu tempo rastu (obr 3B, str. < 0,05). Ukotvenie nezávislý rast týchto buniek bola ďalej analyzovaná pomocou testu tvorby kolónií mäkké agaru. Bolo zistené, že SGC7901-siRPL6-1, AGS-siRPL6-1 a SGC7901-siRPL6-2, AGS-siRPL6-2 bunky vyrobené oveľa menej bunkových kolónií na mäkkom agare, než ich materské bunky a kontrolné bunky (obrázok 3C, p <.; 0.05), bunky pomenované s SGC7901-siRPL6-2 a AGS-siRPL6-2 produkoval najmenej kolónie. Tieto údaje naznačujú, že down-regulácia RPL6 mohol potlačiť rast nádorových buniek žalúdočnej a inhibujú schopnosť tvorby kolónií z SGC7901 a AGS buniek.

RPL6 siRNA inhibovala vzniku nádorov z buniek karcinómu žalúdka in vivo

ďalej potvrdzujú účinky RPL6 na tumorigenezi karcinómu žalúdka, test tvorba nádoru bola vykonaná u nahých myší. SGC7901, AGS a SGC7901-siRPL-2, AGS-siRPL6-2 bunky boli podkožne vrúbľovať do pravej alebo ľavej hornej časti chrbta athymických holých myší na jednom mieste. (Viď obr. 4A a C) O štyri týždne neskôr boli myši zabité a transplantované nádory boli vybraté a veľkostí nádorové boli vyhodnotené (obr 4B a D, p. ≪ 0,05). Došlo k výraznému zníženiu veľkosti xenoimplantátů v RPL6 down-regulované bunky. Tieto dáta ukázali, že knock-down z RPL6 mohol potlačiť žalúdočné rakovinových buniek tumorigenezi in vivo a RPL6 môže hrať kľúčovú úlohu pri podpore malígne rast buniek karcinómu žalúdka in vivo.

RPL6 spomalil G1-S fáze prechodu SGC7901 bunky

Ak chcete odhaliť základné mechanizmy supresívnu úlohu RPL6 v žalúdku rastu nádorových buniek, boli analyzované dopady RPL6 na distribúciu bunkového cyklu SGC7901 buniek (obr. 5A). Ako je znázornené na obrázku 5B, SGC7901-siRPL6-1 bunky vykazovali trochu zvýšiť percento G1 fázy a zníženie percenta S fáze, zatiaľ čo SGC7901-siRPL6-2 bunky zobrazené výrazne zvýšil podiel G1 fázy a zníženie percenta S-fázy (P menšia ako 0,05 ) v porovnaní s rodičovskými bunkami a kontrolné bunky. Tie ukázali, že RPL6 špecifické siRNA mohol spomaliť G1-S prechod SGC7901 buniek.

RPL6 down-regulovaná expresia cyklin E vo buniek karcinómu žalúdka na úrovni proteínu

Je dobre známe, že progresie G1-S je ovládaný cyklin D /CDK4 a cyklin E /CDK2 komplexy, ktoré sú upravené INK4 členmi rodiny, p21 a p27, resp. Expresie týchto regulátorov v SGC7901 a AGS buniek a jeho variantov bola stanovená analýzou Western blot. Ako je uvedené na obrázku 6, expresia cyklin E štatisticky významne down-regulované v SGC7901-siRPL6-2 a AGS-siRPL6-2 buniek. Prejavy CDK2, p16, p21 a p27 boli v nezmenenej podobe variantoch SGC7901 a AGS buniek. Tieto údaje naznačujú, že down-regulácia RPL6 znížil expresiu cyklin E v SGC7901 a AGS buniek, ktoré by mohli plasticky potenciálna úlohu RPL6 a cyklin E vo vývoji karcinómu žalúdka a RPL6 sa môže použiť ako cieľového génu pre žalúdočné rakoviny u klinika.

Diskusia

Táto štúdia preukázala, že RPL6 a cyklin E boli nadmerne exprimované v žalúdočných rakovinových tkanivách a je v žalúdočných rakovinových tkanivách pozitívna korelácia medzi nimi. Následné Výsledky ukázali, že pacienti s RPL6 negatívnym výrazom ukázal dlhšiu dobu prežitia ako pacienti s RPL6 pozitívnym výrazom, ktorý navrhol, že RPL6 pozitívnych pacientov ukázali zlú prognózu. Ďalšie výskumy preukázali, že down-regulácia RPL6 podľa RPL6-špecifické siRNA inhibovala proliferáciu a ukotvenie nezávislý rast žalúdočných nádorových bunkových línií in vitro, potláčaný progresiu bunkového cyklu a potlačila cyklin E výraz navyše vyraďujúce RPL6 podľa RPL6 špecifickej siRNA potlačená tvorba schopnosť nádor buniek karcinómu žalúdka in vivo.

V našej predchádzajúcej štúdii, rozdielne exprimované gény spojené s mnohopočetnou liekovou rezistenciou nádorových buniek žalúdka boli izolované pomocou diferenčné zobrazovacie RT-PCR a subtraktívnu hybridizácii [11], [ ,,,0],12]. RPL6, súčasť veľkej podjednotky ribozómu, tak bol izolovaný ako klon nadmerne exprimovaný v rakovinových bunkách multirezistentných žalúdočné [11]. Bolo preukázané, že by mohla chrániť RPL6 buniek karcinómu žalúdka z chemoterapeutickým apoptózy vyvolanej liekmi [13]. Tieto údaje naznačujú, že by mohlo zahŕňať RPL6 v regulácii malígneho fenotypu karcinómu žalúdka. Ďalšia štúdia bola navrhnutá tak, aby skúmať úlohu RPL6 v tumorigenezi a rozvoju rakoviny žalúdka, a výsledky naznačujú, že up-regulácia RPL6 zrýchlený rast a in vitro kolónii schopnosť GES buniek, zatiaľ čo down-regulácia RPL6 vystavený opačné výsledky tvarovanie. Tiež up-regulácia RPL6 zrýchlil G1 do S fázy prechodu GES buniek aspoň prostredníctvom up-regulácia expresie cyklín E, zatiaľ čo down-regulácia RPL6 ukázal opačné výsledky [14]. Vzaté dohromady, tieto údaje naznačujú, že by mohli zohrávať RPL6 onkogénne úlohu pri vzniku nádorov a rozvoj rakoviny žalúdka a môže slúžiť ako nový prístup ku génovej terapii rakoviny žalúdka.

V súčasnej dobe rastúcej viac pacientov zomrelo na rakovinu, pretože malígne fenotypy nimi. Rakovina terapia narušenej ľudí po celom svete. Vedľa chemoterapie a liečbu chirurgia, génová terapia je nový a sľubný liečby rakoviny. Jednou z najčastejšie používaných metód pre génovú terapiu je RNA interferencia (RNAi). RNAi, vysoko konzervovaná umlčanie génu mechanizmus hrá dôležitú úlohu v regulácii génovej expresie. Umlčanie génov pomocou post-transkripčného mechanizmu zahŕňajúceho homológnej dvouřetězcovou RNA bol prvýkrát objavený v umelých systémoch, kde bol zavedený double strand RNA (dsRNA) po injekcii, alebo expresiou transgénnych konštruktov. K tomuto javu dochádza malú interferujúce RNA (siRNA) v cytoplazme buniek cicavcov. V technológii siRNA, boli považované za dva vykonávacie mechanizmy, priama dodávka syntetické siRNA nukleotidu a zavedenie plazmidmi DNA (pDNA), ktorý kóduje krátku vlásenka konštrukt (zhrnie), ktorá by bola enzymaticky degradovaná do siRNA [15]. Sírne hral jeho inhibičný role porovnaním so sekvenciami mRNA a inhibujú následnej expresie mRNA a transláciu, a pracoval ako negatívne reguláciu. V dnešnej dobe stále viac a viac vedci zistili, že zrazil génovej expresie siRNA môže významne potláča rast nádoru a metastáz. X-viazaná inhibítor apoptózy proteínu (XIAP), významného člena inhibítorov apoptózy proteínu (IAP) rodinných príslušníkov, sa podieľa na regulácii bunkového delenia, množenia sa a inhibícia apoptózy [16], [17]. Down-regulácia XIAP o siRNA môže významne potlačiť proliferáciu nádorových buniek a citlivosť nádorových buniek k chemoterapeutickým činidlám [18], [19]. Osteopontínu (OPN), proteín, ktorý bol nadmerne exprimované u väčšiny pacientov s rakovinou žalúdka a spojené s jeho patogenéze, hrá dôležitú úlohu v proliferácii, inváziu, metastázy a prežívanie karcinómu žalúdka [20]. Potom down-regulácia OPN podľa OPN-špecifickú siRNA významne inhibujú rast, migráciu a inváziu buniek karcinómu žalúdka [21]. CML66, nový nádorový antigén, ktorý hrá onkogénne úlohu, bol nadmerne exprimovaný vo väčšine bunkových línií karcinómu a rakoviny [22], zrážanie jeho expresiu CMl66 špecifickú siRNA významne inhibujú proliferáciu, invázia a metastázovaniu buniek Hela a to ako v vivo a in vitro pokusoch [23]. FABP5, ktorý kóduje kožné mastnú kyselinu viažuci proteín (C-FABP), je up-regulovaný u karcinómu prostaty a pôsobí ako putativní onkogén. Down-regulácia FABP5 podľa FABP5 špecifickej siRNA efektívne inhibuje rast buniek rakoviny prostaty u nahých myší [24]. Okrem toho, keď ribozomálnu proteín, ktorý zvyšuje RPS13 karcinómu žalúdka bunkové línie SGC7901 rast bol zrazený RPS13 špecifickú siRNA, významne inhibovala SGC7901 bunkového rastu a schopnosti tvorby kolónií in vitro a potlačiť schopnosť tvorby tumorov u nahých myší [25]. Predchádzajúce výskumy tiež zistili, že systémové podanie siRNA prostredníctvom atelokolagénu, ktorá sa špecificky zameriava na nádory, je bezpečné a uskutočniteľné pre liečbu rakoviny v karcinómu prostaty [26]. Z tohto dôvodu, dôkaz vyššie naznačujú, že siRNA, inhibíciu génovej expresie môže byť nový prístup k liečbe rakoviny a aby génová terapia rakoviny možné pre klinickú liečbu.

V tejto štúdii, výrazy RPL6 a cyklin E v žalúdku boli zistené rakovina tkaniva a zodpovedajúce priľahlé non-neoplastické tkaniva a výsledky ukázali, že RPL6 a cyklin E vykazovali vyššiu expresiu v rakovinové tkanive žalúdka, ako u zodpovedajúcich okolitom normálnom tkanív. Okrem toho, existuje vzájomný vzťah medzi RPL6 a cyklin E expresie v karcinómu žalúdka tkanivách, ktoré naznačujú, že môžu hrať con-veľkorysý úlohu v rozvoji rakoviny žalúdka a RPL6 môže slúžiť ako biomarker pre diagnostiku rakoviny žalúdka. Následné výsledky preukázali, že pacienti s oboma RPL6 pozitívne a cyklin E pozitívne výrazy ukázali, kratšia doba prežitia a horšiu prognózu než zodpovedajúce kontrolné a tiež uvedené, že pacienti s RPL6 negatívne expresie vykazovali dlhší čas prežitia a lepšiu prognózu než pacienti s RPL6 pozitívne expresiou, ktorý navrhol, že RPL6 môže slúžil ako biomarkeru pre prognózu žalúdočné rakoviny a génovej ciele pre liečbu rakoviny žalúdka v klinike.

Ak chcete ďalej skúmať potenciálne realizovateľnosť RPL6 sú génovej terapie cieľ rakovinou žalúdka v klinike zrazil nadol RPL6 expresiu v SGC7901 a AGS buniek RPL6 špecifické siRNA, výsledky ukázali, že negatívne reguláciu RPL6 u karcinómu žalúdka rodičovských bunkových línií (SGC7901 a AGS) účinne inhibuje rast buniek a in vitro kolónie schopnosť tvarovania. Ďalej analýza bunkového cyklu ukázala, že down-regulácia RPL6 spomalil G1 do S fázy buniek karcinómu žalúdka. Western blot analýza ukázala, že RPL6 inhibuje progresiu bunkového cyklu cez down-reguláciu experimentov cyklin E. nádorových formácie v holých myší navrhli, že down-regulácia RPL6 mohol potlačiť tvorbu nádorov in vivo.

cyklín E, čo je kľúčový bunka cyklus proteín, ktorý hrá kľúčovú úlohu v G1-S prechodu bol v neporiadku v mnohých rôznych nádorov [27], [28], [29], [30], [31]. Predchádzajúce výskumy ukázali, že cyklin E bol dôležité molekuly v vzniku nádorov. V tejto štúdii sme zistili, že cyklin E výraz, spolu s RPL6 bola vyššia v rakovina žalúdka u tkanív, než je v prispôsobených okolitom normálnom tkanív, z ktorých vyplýva, rolu cyklin E, ktorú hrá v rozvoji rakoviny žalúdka. Ďalšie výskumy preukázali, že RPL6 ovplyvnený rast buniek reguláciou cyklin E, ktorý ukázal, že vysoká expresia cyklin E zrýchlený rast buniek, zatiaľ čo nízka expresia cyklin E spomalilo proliferáciu buniek. Cyklin E a RPL6 môže hrať kon-veľkorysý úlohu vo vývoji rakoviny žalúdka.

Na záver, táto štúdia preukázala, že RPL6 a cyklin expresie boli spojené navzájom v žalúdočných rakovinových tkanivách a môže hrať kon- veľkorysé úloha v rozvoji rakoviny žalúdka, ktorý navrhol, že RPL6 môžu použiť ako diagnostický nástroj rakoviny žalúdka. Následná kontrola analýza dát ukázala, že pacienti s RPL6 negatívnym výrazom ukázal dlhšiu dobu prežitia a lepšiu prognózu než pacienti s pozitívnym výrazom RPL6 po operácii, ktoré naznačujú, že RPL6 slúžil ako biomarker pre žalúdočné rakoviny prognózu a nové génovej cieľ pre terapiu rakoviny žalúdka. Ďalšie štúdie ukázali, že down-regulácia expresie RPL6 RPL6 špecifické siRNA inhibovala SGC7901 rast buniek a schopnosť tvorby kolónií in vitro, spomalil SGC7901 buniek G1 do S fázy prechodu, a potlačiť tvorbu nádorov in vivo. Na záver, naša súčasná Štúdia potvrdila, že RPL6 siRNA by mohlo byť použité ako nový prístup k liečbe rakoviny žalúdka na klinike.

materiáloch a metódach

Ethics Prehlásenie

V prípade tkanivových vzoriek všetci pacienti boli informovaní súhlas s použitím nadbytočných patologických vzoriek na výskumné účely. Protokoly použité v tejto štúdii boli schválené ochrane nemocnice ľudských subjektov výboru. Využitie ľudských tkanív bol schválený inštitucionálnu etickou komisiou štvrtého Vojenské lekárskej univerzity a bol prispôsobený Helsinskej deklarácie, a s platnými právnymi predpismi. Pacienti, ktoré ponúkajú vzorky pre štúdium podpísaný informovaný súhlas formulárov. Pre výskumu na zvieratách, sú všetky postupy pokusov na zvieratách boli vykonané v súlade s pokynmi pre inštitucionálnych Animal Care and Use Výboru Experiment zvierat stredu štvrtého Vojenskej lekárskej univerzity. ID schválenia pre používanie zvierat bol No. 10218 experimentom Zviera Centrum štvrtého Military Medical University.

Vzorky tkanív a bunkových línií

Tkanivové vzorky s vstavanými parafínu boli zozbierané od 55 pacientov s rakovina žalúdka, ktorí podstúpili gastrektómii v našej nemocnici v rokoch 2004 a 2009. Všetky prípady rakoviny žalúdka a priľahlých normálnom tkanive bolo diagnostikovaných klinicky a patologicky. Údaje o klinicko-funkcií a prognózy pacientov boli zhromaždené a analyzované retrospektívne. Celkovo 55 pacientov bolo sledovaných až do konca roku 2009 a dvaja z nich boli v priebehu ďalšieho sledovania stratí. Ľudský adenokarcinóme žalúdka bunkové línie SGC7901 bola získaná z Akadémie Vojenskej lekárskej vedy, AGS bola získaná od Šanghaja bunkovej banky (Shanghai, Čína). Obe bunkové línie boli zachované v našom ústave. Všetky bunkové línie boli udržiavané v RPMI 1640 (Invitrogen, Carlsbad, CA), doplnenom 10% tepelne inaktivovaným fetálnym teľacím sérom (FCS) pri 37 ° C s 5% CO _{2 vlhké s inkubátora (Forma Scientific, Marietta, OH).}

Imunohistochemické vyšetrenie a imunohistochemická scoring

zbavené parafínu a rehydratované rezy boli premyté v čerstvej vode po dobu 10 minút. získanie antigénu teplo vyvolané bola vykonávaná po dobu 20 minút pri teplote 95 ° C s 10 mM citrátového pufra sodným (pH 6,0). Potom, čo bola sklíčka schladí na teplotu miestnosti po dobu 40 minút, boli blokované v 3% peroxidu vodíka po dobu 20 minút a potom sa v normálnom kozím sére zvažujúcemu kvapaliny po dobu 40 minút. Potom, že sa nechajú reagovať cez noc pri teplote 4 ° C s primárnymi protilátkami proti IgG, RPL6 a cyklin (Santa Cruz). Po rewarming po dobu 40 minút, boli potom nechá reagovať s druhými protilátkami (Zhongshan Goldenbridge Biotechnology Co.Ltd) na ďalších 40 minút pri teplote miestnosti. Potom produkty boli vyvinuté s 3,3'-Diaminobenzidine a kontrastne hematoxylínom. Scoring bol dokončený v odbornom patológ a vedec, ktorý sa zaslepeným klinické a patologické informácií. V prípade nezrovnalostí, sa dosiahol konsenzus o konferencie. Pomery pozitívnych buniek (0 až +3) a farbenie intenzitách (0 až +3) boli hodnotené oddelene pri zväčšení x 200. Prvý z nich sa vypočíta spočítaním počtu zafarbených nádorových buniek z celkového počtu nádorových buniek, napríklad vtedy, keď boli zafarbené 25% z celkového počtu buniek, podiel polčas 1, a 50% sa rovná + 2, 75% zodpovedá do +3, 0% sa rovná 0. vyhodnocovanie intenzita bola vyhodnotená podľa farby farebného nádorových buniek jadra, konkrétne, skóre 0 znamená, achromatické, 1 znamená oranžovo, 2 znamená, žlté, a 3 znamená hnedej. Kombinovaná bodovanie + 1 ~ + 2 boli definované "negatívny", a + 3 ~ + 6 boli považované za "pozitívny".

plazmidovej konštrukcie a transfekční

Dva páry vlásenka malé interferujúce RNA (siRNA ) oligo pre RPL6 boli navrhnuté v súlade s pokynmi siRNA dizajnu firmy Takara Biotechnology Co., Ltd. si porovnajte cieľovej sekvencie do databázy ľudského genómu pri vyhľadávaní BLAST vylúčiť z úvah žiadnu cieľovú sekvenciu s 21 párov báz homológie priliehať k iným kódujúcich sekvencií , Pre oligo-1, sense: 5'-GATCCGGAGAAGGTTCTCGCAACTTTCAAGAGAAGTTGCGAGAACCTTCTCCTTTTTTGGAAA-3 'antisencie: 5'AGCTTTTCCAAAAAAGGAGAAGGTTCTCGCAACTTCTCTTGAAAGTTGCGAGAACCTTCTCCG-3'; pre oligo-2, sense: 5'-GATCCGTCGAGTTCCTCTACGAAGATTCAAGAGATCTTCGTAGAGGAACTCGATTTTTTGGAAA-3 'antisencie: 5'-AGCTTTTCCAAAAAATCGAGTTCCTCTACGAAGATCTCTTGAATCTTCGTAGAGGAACTCGACG-3'; Ťahanice DNA duplex bol tiež navrhnutý ako kontrola, na oligo-1, sense: 5'-GATCCGGTGAGATCTTCGACACAGTTCAAGAGACTGTGTCGAAGATCTCACCTTTTTTGGAAA-3 'antisencie: 5'-AGCTTTTCCAAAAAAGGTGAGATCTTCGACACAGTCTCTTGAACTG TGTCGAAGATCTCACCG-3'. Pre žíhanie k vytvoreniu DNA duplex, 0,01 M každej zo sense a AONů boli použité. Tieto duplexy boli rozpustené a potom spojil s pSilencer3.1-H1 neo vektor (Takara Biotechnology (Dalian) CO., LTD). Tieto produkty boli transformované do DH5a-kompetentných buniek. Ampicilín rezistentné kolónie boli vybrané, identifikované štiepenia štiepením, a ďalej potvrdila sekvenovaním DNA. Podľa inštrukcií výrobcu, siRNA plazmidy RPL6 boli transfekovány do SGC7901 buniek použitím Lipofectamine 2000 činidlo (Invitrogen, Carlsbad, CA), resp. Dvadsaťštyri hodín po transfekciu, G418 (400 ug /ml) bol pridaný do kultivačného média na stanovenie stabilných klonov. Zmesné klony sa expandovali počas ďalších 2 mesiacov. V SGC7901 a AGS bunky (nazývané aj rodičovské bunky) stabilne exprimujúce exogénne RPL6 boli pomenované ako SGC7901-siRPL6-1, AGS-siRPL6-1 a SGC7901-siRPL6-2, AGS-siRPL6-2. A bunky prenesené s siControl boli pomenované ako SGC7901-siRPL6 Control a AGS-siRPL6 Control (nazývané aj kontrolné bunky).

testu proliferácie buniek

3- (4,5-dimetyl-thiazol-2- yl) -2,5-difenyl-tetrazolium bromidu (MTT), test bol vykonaný pre vyhodnotenie účinku RPL6 na proliferáciu buniek, ako bolo opísané skôr [32]. Absorbancia pri 490 nm (A490) každej jamky bol čítaný na reader BP800 (Biohit, Helsinki, Fínsko). Každý experiment bol vykonaný v quadruplicates a sa opakuje 3 krát.

mäkké agarové testy tvorby kolónií

Soft test tvorby kolónií agar sa určovali bunkového rastu potenciálu na ukotvenie nezávislý. Dvanástim jamkové doštičky boli naplnené 0,5 ml 0,5% ušľachtilý agar (Invitrogen) v RPMI 1640 doplnenom 10% teľacím sérom, ako spodná vrstva a nechá stuhnúť pri teplote 4 ° C cez noc. Celkovo 200 buniek bolo suspendované v 0,25 ml 0,3% agaróza a schovať na agarové dole. Dosky pre kultiváciu buniek sa udržiavali po dobu 2 týždňov v CO _{2 inkubátora. Počet kolónií bol počítaný pod mikroskopom.}

tumorigenicity u nahých myší

Tvorba nádoru bola vykonaná s cieľom vyhodnotiť účinky na RPL6 skúšky na tvorbu nádorov in vivo. BALBI /c nahých myší zo 4 až 6 týždňov boli poskytnuté Shanghai Cancer Institute a sídli v mikro-odpojovač klietkach za pretlaku vzduchu, a udržiavaná pri konštantnej teplote (22 ° C) a vlhkosti vzduchu pre štúdium skúšky na tvorbu nádorov. Približne 3 x 10 ^{6 buniek v log fáze boli zhromaždené a subkutánne podali do hornej zadnej časti Balb /c nahých myší. Najmenej tri nahé myši boli použité pre každú skupinu. Myši boli zabité 4 týždne neskôr a bola hodnotená hmotnosť nádoru každej myši. Všetky postupy pokusov na zvieratách boli vykonané v súlade s pokynmi pre inštitucionálnych Animal Care and Use Výboru Experiment zvierat stredu štvrtého Military Medical University.}

bunkového cyklu analýza

Pre analýzu bunkového cyklu fáza distribúcie, SGC7901 a jeho varianty v log fáze zozbieraného a premyté dvakrát ľadovo chladným PBS. Bunkové pelety boli fixované v 70% etanolu, spracuje sa s RNázou A (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN) a zafarbené propidium jodidu (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO).

• Ploche ONE: DNA Repair Gene APE1 T1349G polymorfizmus a riziko rakoviny žalúdka v čínskej Population
• Ploche ONE: Strata proteínu promyelocytovej leukémie v rakoviny žalúdka: Dôsledky pre IP-10 expresie a infiltrujúcej nádor Lymphocytes