PLoS ONE: downregulation iš RPL6 pagal siRNA slopina proliferaciją ir ląstelinį ciklą Žmogiškųjų Skrandžio vėžio ląstelių Lines

Anotacija

Mūsų Ankstesnis tyrimas atskleidė, kad žmogaus ribosomos baltymų L6 (RPL6) buvo reguliuojama ir daugeliui vaistų atsparių skrandžio vėžio ląstelės ir per išraiška RPL6 gali apsaugoti skrandžio vėžiu nuo narkotikų sukeltos apoptozės. Be to, buvo įrodyta, kad iki-reguliavimo RPL6 paspartino augimą ir stiprinti in vitro kolonijas sudarančių gebėjimas Ges ląstelių, o žemyn reguliavimas RPL6 eksponuojami priešingas rezultatus. Šis tyrimas buvo skirtas ištirti galimą vaidmenį RPL6 terapijoje skrandžio vėžio klinikoje. Iš RPL6 ir ciklino E skrandžio vėžio audiniuose ir normalus skrandžio gleivinės išraiška buvo įvertintas immunohistochemisty. Buvo nustatyta, kad RPL6 ir ciklino E buvo išreikšta aukštesniu lygiu, skrandžio vėžio audiniams, išskyrus, kad įprastu būdu skrandžio gleivinės ir du iš jų buvo koreliatyvus skrandžio vėžio. Išgyvenimo laikas pooperacinių ligonių buvo analizuojami Kaplan- Meier analizė ir nustatyta, kad pacientams, sergantiems RPL6 teigiamą išraiškos parodė trumpesnį išgyvenimo laiko nei pacientų, kurie su RPL6 neigiamą išraišką. RPL6 tada buvo genetiškai žemyn reguliuoja skrandžio vėžio SGC7901 ir AGS ląstelių linijų siRNA. Tai buvo įrodyta, kad žemyn reguliavimas RPL6 sumažinti sugebėjimą suformuoti kolonijas skrandžio vėžio ląsteles in vitro ir sumažinta ląstelių augimą in vivo. Be to, žemyn reguliavimas RPL6 gali slopinti G1 į S fazinio virsmo šiose ląstelėse. Be to, mes liudija, kad RPL6 siRNR žemyn reguliuojama ciklino E išraišką SGC7901 ir AGS ląsteles. Kartu paėmus, šie duomenys rodo, kad RPL6 buvo per išreikšta žmogaus skrandžio audinių ir sukėlė prastas prognozes. Žemyn reguliavimo RPL6 gali slopinti ląstelių augimą ir ląstelių ciklą bent per apačią reguliavimo ciklino E ir kuri gali būti naudojama kaip naują požiūrį į skrandžio vėžio gydymo

nurodomoji dalis:. Vu Q Gou Y Wang Q, Jin yra H, Cui L, Zhang Y, ir kt. (2011) downregulation iš RPL6 iki siRNA slopina proliferaciją ir ląstelinį ciklą Žmogiškųjų Skrandžio vėžio ląstelių linijas. PLoS ONE 6 (10): e26401. Doi: 10,1371 /journal.pone.0026401

redaktorius: Xin juanis Guan, Honkongo universitetas, Kinija

Įstojo: rugpjūčio 7, 2011; Priimta rugsėjo 26, 2011 m Paskelbta: Vasaris 17, 2011

Visos teisės saugomos: © 2011 VU et al., Tai atviros prieigos straipsnis platinama pagal Creative Commons Attribution licencija, kuri leidžia nevaržomai naudotis, paskirstymo ir dauginimąsi bet kokioje laikmenoje sąlygomis, su sąlyga, kad pirmasis autorius ir šaltinis įskaitomos

Finansavimas:. Šis tyrimas buvo iš dalies remiamą dotacijas iš Nacionalinės pagrindinių mokslinių tyrimų programą Kinijos (Nr 2010CB732400, Nr 2010CB529300) ir Nacionalinės Gamtos mokslo fondo Kinijos (Nr 30.801.349). Į finansuotojai neturėjo vaidmenį studijų dizainas, duomenų rinkimo ir analizės, sprendimų skelbti, ar ruošiant rankraštį

konkuruojančių interesų.. Autoriai pareiškė, kad nėra konkuruojantys interesai egzistuoja

Įvadas

Skrandžio vėžys, su aukštos moralės, buvo vienas iš labiausiai piktybinių vėžio Azijos šalyse. Jos atsiradimas buvo procesas su multi-faktorių ir multi-pakopų, susijusių pakitimų daugelyje molekulių, įskaitant aktyvavimo prokalbės onkogenų, nukenksminimo naviku slopintuvas genų, keičiant ląstelės ciklo susijusių baltymų ir pan. Per pastarąjį dešimtmetį, buvo nustatyta, puikus skaičius prokalbės onkogenų bei navikų slopintuvas genų. Nepaisant to, kad didokas skaičius genų jau aprašytų, vis dar yra identifikuojamos naujos genai su onkogeniniam galimų ar naviko slopina veiklą. Tačiau molekulinės mechanizmas skrandžio kancerogenezėje lieka neaiškus.

Ribosoma yra būtinas baltymų sintezei visose ląstelėse, kurią sudaro Ribosominės RNR (rRNAs) ir ribosomų baltymus (RPS). Daugelis RPS, taip pat vaidina įvairius vaidmenis, kurie yra nepriklausomi nuo baltymų biosintezę, kuris yra vadinamas Papildomas ribosomos funkcija [1]. Didinti daugiau mokslinių tyrimų rodo, kad sutrikimas baltymų vertimo dalyvavo Tumorigenesis ir daug ribosomų baltymus buvo asocialių navikuose, tačiau mechanizmai dar nebuvo žinoma [2]. Buvo pasiūlyta, kad daugelis RPS veikti kaip haploinsufficient auglio slopintuvai žuvies ir daugelis RPS genų taip pat gali būti Onkogeny į žmogiškąjį [3] natūra. Seniausias ataskaita dėl santykių tarp RPS ir navikų buvo paskelbta 90 s 20 ^{amžiuje, kuris parodė RPS19 su storosios žarnos vėžiu progresavimo ir diferenciacijos asociaciją [4] .Thereafter, buvo rasta daugiau ir daugiau RPS asocialių navikuose , pavyzdžiui, didelės raiškos RPL19 į krūties navikų [5], per išraiška RPL7a ir RPL37 prostatos vėžio audinių mėginių [6], aukštojo išraiška RPL15 į stemplės vėžio [7], RPS ankstyva jų diagnostika žymuo žmogaus suragėjusių ląstelių karcinoma gimdos kaklelio [8], ir per-išraiškos RPL36a, susijusios su ląstelių proliferacija buvo kepenų ląstelių karcinoma [9] ir taip toliau. Pranešimų apie RPS su kancerogenezėje asociacija vis dar didėja [2], [10]. Tačiau tikslios vaidmenys RPS navikų vystymąsi, yra įvairi ir vis dar reikia išsamiau paaiškinti.}

Anksčiau, mes analizuojami mRNR profilių žmogaus skrandžio vėžio ląstelių linijos SGC7901 ir jos daugiskaitos atsparus variantas SGC7901 /VCR diferencinės rodomi PGR ir sulaikymas atimama hibridizacija [11], [12]. RPL6 buvo įvardytas kaip vienas iš pernelyg išreikšta genų SGC7901 /ADR, palyginti su SGC7901, kuris dar buvo patvirtintas RT-PGR ir Šiaurės blot analize [13]. Vėlesni tyrimai parodė, kad iki-reguliavimo RPL6 apsaugotas skrandžio vėžio ląsteles nuo adriamicinas sukeltos apoptozės ir sustiprintas skrandžio vėžio ląstelių atsparumą keliais chemoterapiniais vaistais, įskaitant vinkristino, adriamiciną, docetakselis, etopsidas, cisplatinos ir 5-fludrouracil [13]. Šie duomenys rodo, kad RPL6 galėtų skatinti piktybinio fenotipų skrandžio vėžio ląstelių, kurios paskatino mus atlikti tolesnį tyrimą, siekdama toliau nagrinėti tikslią vaidmenį RPL6 į kancerogenezėje ir plėtros skrandžio vėžio. Tada mes pamatėme, kad genetiškai iki-reguliavimo RPL6 į GES ląstelių gali paspartinti ekonomikos augimą ir sustiprinti in vitro sugebėjimą suformuoti kolonijas Ges ląstelių, o žemyn reguliavimas RPL6 galėtų eksponuoti priešingas rezultatus. Be to, iki-reguliavimo RPL6 galėtų skatinti G1 į S fazinio virsmo iš GES ląsteles. Daugiau tyrimas parodė, kad RPL6 iki reguliuojama ciklino E išraišką Ges ląstelių [14]. Kartu paėmus, šie duomenys rodo, kad RPL6 galėtų skatinti piktybinio fenotipų skrandžio vėžio ląstelių ir RPL6 gali vaidinti onkogeninio vaidmenį Tumorigenesis ir plėtros skrandžio vėžiu, kuris leido mums atlikti šią studiją ištirti galimą vaidmenį RPL6 genų terapija skrandžio vėžio ir gali būti naudojamas kaip naują požiūrį į skrandžio vėžio gydymo.

rezultatai

RPL6 ir cikloniniai El išraiška žmogaus skrandžio vėžio egzempliorių ir suderinti gretimų ne navikiniai audiniai

Jei norite sužinoti tarp RPL6 ir cikloniniai E išraiškos santykius su skrandžio vėžio vystymąsi, mes nustatėme, RPL6 ir cikloniniai E išraišką žmogaus skrandžio vėžio audiniuose ir suderinti gretimų ne navikinių audinių iki imunohistocheminį dažymo. Tyrimo rezultatai atskleidė, kad RPL6 ir cyclinE lokalizuota beveik citoplazmoje ir tik retkarčiais branduolyje skrandžio vėžio ląstelių (pav. 1A). Tolesnė analizė nustatė, kad teigiamas santykis (įskaitant egzempliorių, kad tamsintas) ir RPL6 buvo 84% (46 iš 55 pacientų), o teigiamas santykis ciklino E buvo 75% (41 iš 55 pacientų) žmogaus skrandžio vėžio egzempliorių. Teigiamas santykis tiek RPL6 ir ciklino E buvo 70% (38 iš 55 pacientų), o neigiamas santykis (įskaitant egzemplioriams, kurie nebuvo dažais) tiek RPL6 ir ciklino E buvo 11% (6 iš 55 pacientų) žmonėmis skrandžio vėžio egzempliorių , Teigiamas santykis tiek RPL6 ir ciklino E buvo 18% (8 iš 55 pacientų) yra suderintų gretimų ne navikinių audinių (duomenys neparodyti). Kaip tarp RPL6 saviraiškos ir cyclinE išraiškos skirtumus žmogaus skrandžio vėžio egzempliorių, nebuvo jokio skirtumo. Šis tyrimas parodė, kad RPL6 ir cikloniniai E išraiškos žmogaus skrandžio vėžio egzemplioriai buvo santykinis (pav 1B, P.. ≪ 0,05), kuris gali žaisti CON-turtinga vaidmenį skrandžio vėžio ir RPL6 ir ciklino E plėtrai gali tarnauti kaip biologinis skrandžio vėžio diagnostikos ir genų tikslo skrandžio vėžio gydymo. Tuo sekti pabaigos išgyvenimo laikas pacientų buvo analizuojami Kaplan- Meier metodu ir rezultatai parodė, kad pacientų, kurie buvo stebimi metu pacientai, sergantys tiek RPL6 teigiamas ir ciklino E teigiamą parodė trumpesnį išgyvenimo laikas ir skurdesnių prognozę nei tie, su tiek RPL6 neigiamas ir cikloniniai El neigiamas išraiška, arba tiems, su RPL6 teigiamas ir cikloniniai El neigiamas arba RPL6 neigiamas ir cyclinE teigiamą išraiška atitinkamai (2 pav A, p. < 0,01), kuris gali būti atskleidė, kad pacientai, sergantys tiek RPL6 teigiamas ir CIKLONAS El teigiamas parodė prastą prognozę. Jis taip pat parodė, kad pacientams, sergantiems RPL6 neigiamos išraiškos parodė išgyventi ilgiau laiko negu RPL6 teigiamus (2B pav, p. ≪ 0,01), ir pacientams, sergantiems ciklino E teigiamas išraiška parodė, prastos prognozės (pav 2C, p. ≪ 0,01). Todėl galima daryti išvadą, kad RPL6 gali tarnavo kaip biologinis žymuo įvertinti skrandžio vėžiu sergančių pacientų prognozę.

išraiška RPL6 skrandžio vėžio ląstelių linijų ir jos dariniai

Jei toliau tyrinėti potencialų vaidmenį RPL6 genų terapijos skrandžio vėžio, SGC7901 ir AGS ląstelės buvo pernešta su RPL6 konkrečių siRNA ir buvo pagamintas mišrios baseinas G418 atsparių ląstelių variantų. Į G418 atsparių variantų slėpimas RPL6 konkrečių siRNA buvo atitinkamai vadinamas SGC7901-siRPL6-1, AGS-siRPL6-1 ir SGC7901-siRPL6-2, AGS-siRPL6-2. Į G418 atsparus ląstelės slėpimas peštynės siRNA plazmidžių buvo sukurta kaip SGC7901-siControl ir AGS-siControl atitinkamai. Kaip parodyta 3A pav, RPL6 išraiška buvo gerokai žemyn reguliuojama SGC7901-siRPL6-1, AGS-siRPL6-1 ir SGC7901-siRPL6-2, AGS-siRPL6-2 ląstelių, lyginant su tėvinės ląstelės ir kontrolinėse duobutėse. Šioje studijoje, SGC7901-siRPL6-2 ir AGS-siRPL6-2 parodė efektyvesnes slopinamąjį rezultatus, kurie parodė, kad SGC7901-siRPL6-2 ir AGS-siRPL6-2 ląstelės gali būti naudojamas kaip gera ląstelių modelio paaiškinti potencialo vaidmuo RPL6 genų terapijos skrandžio vėžio klinikoje.

downregulation iš RPL6 slopinti skrandžio vėžio ląstelių augimą in vitro

Jei studijuoti ar žemyn reguliavimas RPL6 išraiškos gali slopinti SGC7901 augimą ir AGS ląstelės, tėvinės ląstelės, valdymo elementai ir jų variantai buvo pasėjamos į kultūros plokštės ir jų augimas buvo stebimas kasdien su MTT. Kaip rodo augimo kreivės 3b pav, kontrolės (SGC7901-siControl ir AGS-siControl) ląstelės parodė panašų augimo tempą iki tėvų (SGC7901 ir AGS) ląstelės atitinkamai, o SGC7901-siRPL6-1, AGS-siRPL6-1 ir SGC7901 -siRPL6-2, AGS-siRPL6-2 ląstelės eksponuojami mažesnį augimą nei kontrolinių ląstelių ir SGC7901-siRPL6-2, AGS-siRPL6-2 ląstelės parodė mažiausią augimo tempą (pav 3B, p. < 0,05). Tvirtinimo nepriklausomas augimas šių ląstelių toliau buvo analizuojami su minkšta agaro kolonija formavimo metodu. Nustatyta, kad SGC7901-siRPL6-1, AGS-siRPL6-1 ir SGC7901-siRPL6-2, AGS-siRPL6-2 ląstelės gaminamos daug mažiau ląstelių kolonijų minkštu agaro nei jų tėvų ląstelių ir kontrolinėse duobutėse (pav 3C, p. ≪ 0,05), ląstelės pavadintas SGC7901-siRPL6-2 ir AGS-siRPL6-2 gaminamas mažiausiai kolonijas. Šie duomenys rodo, kad žemyn reguliavimas RPL6 gali slopinti skrandžio vėžio ląstelių augimą ir slopina kolonija formavimo gebėjimas SGC7901 ir AGS ląsteles.

RPL6 siRNR slopino Tumorigenesis skrandžio vėžio ląstelėse in vivo

Jei Taip pat patvirtinkite su RPL6 poveikį Tumorigenesis skrandžio vėžio, naviko formavimasis tyrimas buvo atliktas nuogas pelių. SGC7901, AGS ir SGC7901-siRPL-2, AGS-siRPL6-2 ląstelės buvo po oda pasėta į dešinę arba į kairę viršutinėje užpakalinėje athymic nuogas pelių vienoje vietoje. (Pav. 4A ir C) keturių savaičių, pelės žuvo ir persodinami augliai buvo pašalintų ir naviko dydis buvo įvertintas (pav 4B ir D, p. ≪ 0,05). Nebuvo labai sumažėjo dydžių audiniuose, į RPL6 žemyn reguliuoja ląstelių. Šie duomenys rodo, kad trankyti-žemyn RPL6 gali slopinti skrandžio vėžio ląstelių tumorigenezei in vivo ir RPL6 gali vaidinti svarbų vaidmenį skatinant piktybinį augimą skrandžio vėžio ląstelių in vivo.

RPL6 sulėtėjo G1-S fazinis virsmas SGC7901 ląstelės

Jei atskleisti mechanizmus, sukeliančius slopinančią vaidmenį RPL6 skrandžio vėžio ląstelių augimą, buvo analizuojamas RPL6 poveikis ląstelių ciklo paskirstymo SGC7901 ląstelių (5a pav.). Kaip parodyta 5B pav, SGC7901-siRPL6-1 ląstelės parodė šiek tiek padidėjusią procentą G1 fazėje sumažėjo procentą S fazėje, o SGC7901-siRPL6-2 ląstelės nuotraukos rodomos gerokai padidėjo procentas G1 fazėje sumažėjo procentą S fazėje (p < 0,05 ), palyginti su tėvų ląstelių ir kontrolinėse duobutėse. Tai rodo, kad RPL6 konkrečių siRNR gali sulėtinti G1-S perėjimą SGC7901 ląsteles.

RPL6 žemyn reguliuojama išraišką ciklino E skrandžio vėžio ląsteles tuo baltymų lygio pervežimas

Jis yra gerai žinomas kad G1-S progresavimo yra kontroliuojama cikloniniai D /CDK4 ir cikloniniai E /CDK2 kompleksų, kurie reglamentuoja INK4 šeimos narių, p21 ir p27, atitinkamai. Šių reguliavimo institucijų SGC7901 ir AGS ląstelių ir jo variantai išraiška lėmė Vakarų dėmė analizė. Kaip nurodyta 6 paveiksle, išraiška ciklino E buvo gerokai žemyn reguliuojama SGC7901-siRPL6-2 ir AGS-siRPL6-2 ląsteles. Išraiškos CDK2, P16, P21 ir P27 buvo nepakitęs SGC7901 ir AGS ląstelių variantų. Šie duomenys rodo, kad žemyn reguliavimo RPL6 sumažino ciklino E SGC7901 ir AGS ląstelių išraiška, kuri gali apibrėžti galimą vaidmenį RPL6 ir ciklino E skrandžio vėžio ir RPL6 plėtros gali naudoti kaip genų tikslo skrandžio vėžio klinikoje.

Diskusijos

Šis tyrimas parodė, kad RPL6 ir cikloniniai El buvo per išreikštas skrandžio vėžio audiniuose ir yra teigiama koreliacija tarp jų skrandžio vėžio audiniuose. Tolesni rezultatai parodė, kad pacientams, sergantiems RPL6 neigiamos išraiškos parodė išgyventi ilgiau laiko nei tie, su RPL6 teigiamą išraiškos, kurie leidžia manyti, kad RPL6 teigiami pacientai parodė prastą prognozę. Tolesni tyrimai parodė, kad žemyn reguliavimo RPL6 pagal RPL6-konkretų siRNA slopina proliferaciją ir tvirtinimo nepriklausomas augimą skrandžio vėžio ląstelių linijų in vitro, represuoti ląstelinį ciklą ir slopino ciklino E išraiška, be to, triuškinantis iš RPL6 iki RPL6 konkrečių siRNA slopino navikų susidarymo galimybė skrandžio vėžio ląstelėse in vivo.

mūsų ankstesniame tyrime, skirtingai išreikšti genai, susiję su atsparumu skrandžio vėžio ląstelių vaistams buvo izoliuoti naudojant skirtumas ekrano RT-PGR ir atimtiniam hibridizacija [11], [ ,,,0],12]. RPL6, dėl didelio subvieneto ribosomos komponentas, buvo išskiriamas kaip klono, per-išreikštą daugeliui vaistų atspari skrandžio vėžio ląstelių [11]. Tai buvo įrodyta, kad RPL6 gali apsaugoti skrandžio vėžio ląsteles nuo chemoterapinių vaistų sukeltos apoptozės [13]. Šie duomenys rodo, kad RPL6 gali prireikti atsižvelgiant į piktybinės fenotipo skrandžio vėžio reguliavimą. Daugiau tyrimas buvo skirtas išnagrinėti galimybę RPL6 vaidmenį Tumorigenesis ir plėtros skrandžio vėžio, ir rezultatai rodo, kad iki-reguliavimo RPL6 paspartino augimą ir in vitro sugebėjimą suformuoti kolonijas Ges ląstelių o žemyn reguliavimas RPL6 eksponuojami priešingas rezultatus. Be to, iki-reguliavimo RPL6 paspartino G1 į S fazinio virsmo iš GES ląstelių bent per viršų-reguliavimo cikloniniai E išraiška, o žemyn reguliavimo RPL6 parodė priešingus rezultatus [14]. Kartu paėmus, šie duomenys rodo, kad RPL6 gali vaidinti onkogeninio vaidmenį Tumorigenesis ir plėtros skrandžio vėžio ir gali tarnauti kaip naują požiūrį į genų terapijos skrandžio vėžio.

Šiandien vis daugiau pacientų mirė nuo vėžio, nes piktybinio fenotipų iš jų. Vėžys terapija sutrikdyta žmonių visame pasaulyje. Be to chemoterapijos ir chirurgijos gydymo, genų terapija yra naujas ir perspektyvus vėžio gydymas. Vienas iš dažniausiai naudojamų metodų, skirti genų terapijai yra RNR interferencijos (RNRi). RNRi, labai užkonservuoti genų slopinimo mechanizmas vaidina svarbų vaidmenį genų ekspresijos reguliavimas. Genai yra nuslopinami iki post-transkripcijos mechanizmą įtraukiant homologinės dvigubai RNR pirmą kartą buvo atrastas dirbtinėse sistemose, kur buvo įvesta dviguba gija RNR (dsRNR) per injekuojant arba išraiškos transgeninių darinių. Šis reiškinys įvyksta sirnr (siRNA) į žinduolių ląstelių citoplazmoje. Be siRNA technologija, buvo apsvarstytos dvi pristatymo mechanizmus, tiesioginis pristatymas iš sintetinių siRNA nukleotido ir diegiant plazmidės DNR (pDNA), koduojančio trumpas segtukas konstruktą (shRNR), kad būtų fermentais skaidomas į siRNA [15]. SiRNA suvaidino savo slopinamąjį vaidmenis suderintu su mRNR sekų ir slopinamas reglamentuoti iRNR raiška ir vertimo, ir dirbo kaip neigiamas reglamentą. Šiandien vis daugiau ir daugiau mokslininkų atrado, kad nuvertė genų ekspresiją siRNA gali žymiai slopinti auglio augimą ir metastazes. X chromosoma susijusi inhibitorius apoptozės baltymų (XIAP), svarbiu nariu apoptozės baltymų inhibitorių (TPA) šeimos, dalyvauja kontroliuojant ląstelių dalijimąsi, ląstelių proliferacija ir slopinimo apoptozės [16], [17]. Žemyn reguliavimo XIAP pagal siRNA gali žymiai slopinti proliferaciją vėžinių ląstelių ir atkreipti auglio ląsteles chemoterapiniais preparatais [18], [19]. Osteopontinu (OPN) baltymų, kurie buvo per daug išreikštas skrandžio vėžiu sergančių pacientų dauguma ir susijęs su jos patogenezę, suvaidino svarbų vaidmenį platinimu, invazijos, metastazių ir išlikimo skrandžio vėžio [20]. Tada žemyn reguliavimo OPN pagal OPN specifinio siRNA smarkiai slopino augimo, migracijos ir invazija skrandžio vėžio ląstelių [21]. CML66, romanas naviko antigenų, kurie vaidino onkogeninio vaidmenį, buvo per daug išreikštas vėžio ląstelių linijų ir vėžio dauguma [22], numušti savo ekspresiją CMl66 konkrečių siRNR žymiai slopinamas platinimu, invazija ir metastazių HeLa tiek vivo ir in vitro eksperimentuose [23]. FABP5, kuri koduoja odos riebalų rūgštis surišantį baltymą (C-FABP), yra iki reguliuojama prostatos vėžio ir veikia kaip spėjamame onkogeno. Žemyn reguliavimo FABP5 pagal FABP5 konkrečių siRNA dauginimąsi veiksmingai slopina prostatos vėžio ląstelių augimu nuogas pelių [24]. Be to, kai ribosomos baltymų RPS13 kuris tvirtesnis skrandžio vėžio ląstelių linijos SGC7901 augimą partrenkė RPS13 konkrečių siRNA, tai žymiai slopinamas SGC7901 ląstelių augimą ir sugebėjimą suformuoti kolonijas in vitro ir slopino navikų susidarymo galimybę nuogas pele [25]. Ankstesni tyrimai taip pat nustatė, kad sisteminė pristatymas siRNA per atelocollagen, kuri konkrečiai skirta auglius, yra saugus ir įmanomas vėžio gydymo prostatos vėžio [26]. Todėl įrodymų pirmiau pasiūlyta, kad siRNR, slopindamas genų ekspresiją gali būti naujoviškas požiūris į vėžio gydymo ir padaryti genų terapiją vėžio įmanoma klinikiniam gydymui.

Šiame tyrime išraiškos RPL6 ir cikloniniai E skrandžio vėžio audinių ir suderintus gretimų ne navikiniai audiniai buvo aptikta ir rezultatai parodė, kad RPL6 ir cikloniniai El parodė didesnę raišką skrandžio vėžio audiniuose negu suderintų gretimų ne navikinių audinių. Be to, yra koreliacija tarp RPL6 ir cikloniniai E raiškos skrandžio vėžio audiniuose, kurie leidžia manyti, kad jie gali žaisti CON-turtinga vaidmenį skrandžio vėžio vystymuisi ir RPL6 gali tarnauti kaip skrandžio vėžio diagnostikos biologinis žymuo. Tolesni rezultatai parodė, kad pacientams, sergantiems abiejų RPL6 teigiamų ir cikloniniai E teigiamų posakių parodė trumpesnis išlikimo laikas ir skurdesnių prognozė nei atitinkamas kontrolės ir taip pat nurodė, kad pacientams, sergantiems RPL6 neigiamos išraiškos parodė išgyventi ilgiau laiko ir geriau prognozę nei pacientams, sergantiems RPL6 teigiamą išraiška, kuris teigė, kad RPL6 gali tarnavo kaip skrandžio vėžio prognozei ir genų tikslo skrandžio vėžio gydymo klinikoje biologinis žymuo.

Jei toliau tirti galimą pagrįstumą RPL6 kaip genų terapija tikslą skrandžio vėžio klinikoje, mes išjudinti žemyn RPL6 raiškos SGC7901 ir AGS ląstelėmis RPL6 konkrečių siRNA, rezultatai parodė, kad žemyn reguliavimo RPL6 skrandžio vėžio tėvų ląstelių linijas (SGC7901 ir AGS) efektyviai inhibuoja ląstelių augimą ir in vitro kolonijas sudarančių galimybes. Be to, ląstelės ciklo analizė parodė, kad žemyn reguliavimas RPL6 sulėtėjo G1 į S fazę skrandžio vėžio ląsteles. Vakarų dėmė analizė parodė, kad RPL6 slopina ląstelinį ciklą per žemyn reguliavimo cikloniniai E. navikų susidarymo eksperimentų nuogas pelėmis parodė, kad žemyn reguliavimas RPL6 gali slopinti auglio susidarymą in vivo.

cikloniniai E pagrindinis ląstelių ciklas baltymas, kuris vaidino pagrindinius vaidmenis G1-S perėjimo buvo sutrikimas įvairiais navikais [27], [28], [29], [30], [31]. Ankstesni tyrimai parodė, kad cikloniniai El buvo svarbus molekulės Tumorigenesis. Šioje studijoje, mes atradome, kad cikloniniai E išraišką, kartu su RPL6 buvo didesnis žmogaus skrandžio vėžio audiniuose negu suderintų gretimų ne navikinių audinių, kurie pasiūlė cikloniniai vaidmenį El vaidmenį skrandžio vėžio vystymąsi. Tolesni tyrimai parodė, kad RPL6 įtakos ląstelių augimą reguliuojant ciklino E, kuris parodė, kad aukštos raiškos ciklino E paspartino ląstelių augimą, o žemas išraiška ciklino E sulėtėjo ląstelių proliferaciją. CIKLONAS E ir RPL6 gali žaisti CON-turtinga vaidmenis skrandžio vėžio vystymąsi.

Taigi, dabartinis tyrimas parodė, kad RPL6 ir cyclinE išraiška buvo susiję vieni su kitais skrandžio vėžio audiniuose ir jie gali žaisti pa- turtinga vaidmenis skrandžio vėžio vystymąsi, kurie leidžia manyti, kad RPL6 gali naudojama kaip diagnostikos priemonė skrandžio vėžio. Tolesni duomenų analizė parodė, kad pacientams, sergantiems RPL6 neigiamos išraiškos parodė išgyventi ilgiau laiko ir geriau prognozę nei pacientams, sergantiems RPL6 teigiamą išraiškos po operacijos, kuri pasiūlė, kad RPL6 tarnavo kaip skrandžio vėžio prognozei biologinis žymuo ir naują genų tikslo skrandžio vėžio gydymo. Daugiau tyrimas parodė, kad žemyn reguliavimo RPL6 išraiška pagal RPL6 konkrečių siRNR slopinamas SGC7901 ląstelių augimą ir in vitro kolonija formavimo galimybes, sulėtėjo SGC7901 ląstelių G1 į S fazinio virsmo ir slopino naviko formavimąsi in vivo. Taigi, mūsų dabartinis tyrimas patvirtino, kad RPL6 siRNAs gali būti naudojamas kaip naują požiūrį į skrandžio vėžio terapijos klinikoje.

Medžiagos ir metodai

Etika pareiškimas

audinių pavyzdžių , visi pacientai buvo informuoti sutikimą naudoti perteklines patologinių mėginių tyrimų tikslais. Naudojami šiame tyrime protokolai buvo patvirtintas ligoninės apsaugoti žmogaus dalykai komitetas. Žmogaus audinių naudojimas buvo patvirtintas institucinio vertinimo tarybos ketvirtosios Karo medicinos universiteto ir buvo atitiko Helsinkio deklaraciją, ir vietos įstatymus. Pacientai, siūlančių mėginius tyrime pasirašė informuoto asmens sutikimą formas. Gyvūnų tyrimų, visa tvarka eksperimentų su gyvūnais buvo atliekami laikantis institucinės gyvūnų globos ir vaistų komiteto gaires eksperimento Gyvūnų centro ketvirtosios Karo medicinos universitete. Patvirtinimo ID naudojant gyvūnus buvo Nr 10218 eksperimentas Gyvūnų centro ketvirtosios Karo medicinos universitete.

Audinių mėginiai ir ląstelių linijos

Audinių mėginiai įterptųjų su parafinu buvo renkami iš 55 pacientų, sergančių skrandžio vėžys, kuris patyrė pašalintas skrandis mūsų ligoninėje tarp 2004 ir 2009. Visos skrandžio vėžio bei gretimų ne navikų audiniuose bylos buvo diagnozuota kliniškai ir patologiškai. Duomenys apie klinikos funkcijų ir prognozes pacientų buvo surinkti ir retrospektyviai išanalizuoti. 55 pacientai buvo stebimi iki 2009 metų pabaigos, o du iš jų buvo prarasta per vėlesnio stebėjimo laikotarpiu. Žmogaus skrandžio adenokarcinoma ląstelių linija SGC7901 buvo gauta iš Karo medicinos mokslų akademijos, AGS buvo gauta iš Šanchajaus Mobilusis bankas (Šanchajus, Kinija). Du ląstelių linijos buvo išsaugojęs mūsų institute. Visi mobilieji linijos buvo prižiūrimi RPMI1640 (Invitrogen, Karlovi Varai, Kalifornija) papildytas 10% šilumos inaktyvuotas serumas iš veršiuko embriono (FCS) 37 ° C 5% CO _{2 drėgnoje inkubatoriuje ( "Forma" Mokslo, Marietta OH).}

imunohistocheminis ir imunohistocheminis atsakomają

Deparaffinized ir rehidrataciją skyriai buvo plaunami švariu vandeniu 10 minučių. Šilumos sukelta antigenas paieška buvo atlikta 20 minučių 95 ° C temperatūroje su 10 mM citrato natrio buferio (pH 6,0). Po to, kai skaidres buvo atšaldytas iki kambario temperatūroje 40 minučių, jie buvo užblokuotas 3% vandenilio peroksido 20 minučių ir tada įprastu ožkos serumo gebančiais skysčio 40 minučių. Po to, kai šis, jie buvo leista reaguoti per naktį 4 ° C temperatūroje su pirminių antikūnų IgG, RPL6 ir cyclinE (Santa Cruz). Po to, kai rewarming 40 minučių, jie buvo po to reaguoja su antrojo antikūnų (Zhongshan Goldenbridge biotechnologijos CO.LTD) dar 40 minučių kambario temperatūroje. Tada produktai buvo sukurti su 3,3'-diaminobenzidinu ir counterstained hematoksilinu. Balai buvo baigtas specialistas patologas ir mokslininkas, kuris buvo apakinti, kad klinikinės ir patologinės informaciją. Esant neatitikimui, sutarimas buvo pasiektas konferencijos. Į teigiamų ląstelių (nuo 0 iki +3) ir dažymo intensyvumo (nuo 0 iki +3) proporcijos buvo atskirai vertinti esant × 200 priartinimas. Buvęs buvo apskaičiuojamas skaičiuojant vitražas vėžinių ląstelių skaičių tarp visų naviko ląstelių, pavyzdžiui, kai 25% visų ląstelių buvo tamsintas, proporcija rezultatas buvo 1, ir 50% yra lygus +2, 75% lygu +3, 0% yra lygus 0. intensyvumas balais įvertino vitražas naviko ląstelės branduolyje spalvos, ypač, rezultatas 0 reiškia achromatinis, 1 reiškia, gintaro, 2 reiškia, geltona, ir 3 tai rudos. Kombinuoti atsakomają + 1~ +2 buvo apibrėžta "neigiamas" ir + 3~ +6 buvo laikomas "teigiamas".

plazmidžių statybos ir transfekcija

Dvi poros segtukas sirnr (siRNR ) oligos už RPL6 buvo sukurtas pagal siRNR dizaino gairių TAKARA Biotechnology Co., Ltd palyginkite tikslines sekas su žmogaus genomo duomenų bazėje sprogimo paieškos pašalinti iš išnagrinėti visus tikslinę seką 21 bazių porų homologijos greta kitų kodavimo sekos , Dėl oligo-1, jausmas: 5'-GATCCGGAGAAGGTTCTCGCAACTTTCAAGAGAAGTTGCGAGAACCTTCTCCTTTTTTGGAAA-3 ", Priešprasminis: 5'AGCTTTTCCAAAAAAGGAGAAGGTTCTCGCAACTTCTCTTGAAAGTTGCGAGAACCTTCTCCG-3"; už oligo-2, prasme: 5'-GATCCGTCGAGTTCCTCTACGAAGATTCAAGAGATCTTCGTAGAGGAACTCGATTTTTTGGAAA-3 ', Priešprasminis: 5'-AGCTTTTCCAAAAAATCGAGTTCCTCTACGAAGATCTCTTGAATCTTCGTAGAGGAACTCGACG-3'; Peštynės DNR dvipusis taip pat buvo sukurta kaip kontrolės, už oligo-1, jausmas: 5'-GATCCGGTGAGATCTTCGACACAGTTCAAGAGACTGTGTCGAAGATCTCACCTTTTTTGGAAA-3 ", Priešprasminis: 5'-AGCTTTTCCAAAAAAGGTGAGATCTTCGACACAGTCTCTTGAACTG TGTCGAAGATCTCACCG-3". Dėl išdegimo suformuoti DNR dupleksus, 0,01 M kiekvienas jausmą ir priešprasmės oligos buvo naudojami. Į dupleksus buvo skiedžiamas ir tuomet susiūta su pSilencer3.1-H1 Neo vektorius (TAKARA biotechnologijos (Dalian) co., Ltd). Produktai buvo paverstas DH5α-kompetentingų ląsteles. Ampicilinui-atsparus kolonijos buvo pasirinktas, žymimas restrikcijos virškinimą, ir toliau patvirtina DNR sekos. Pagal gamintojo nurodymus, siRNA plazmidės iš RPL6 buvo pernešta į SGC7901 ląstelių naudojant Lipofectamine 2000 reagentą (Invitrogen, Karlovi Varai, CA), atitinkamai. Dvidešimt keturias valandas po transfekciją, G418 (400 mikrogramų /ml) buvo pridėta į kultūros terpę, kuriant stabilias klonai. Mišrios klonai buvo išplėstas dar 2 mėnesius. Į SGC7901 ir AGS ląstelės (taip pat vadinamas tėvų ląstelių) stabiliai išreikšti exogenic RPL6 buvo vadinamas SGC7901-siRPL6-1, AGS-siRPL6-1 ir SGC7901-siRPL6-2, AGS-siRPL6-2. Ir ląstelės transfektuotose siControl buvo vadinamas SGC7901-siRPL6 kontrolės ir AGS-siRPL6 kontrolės (taip pat vadinamas kontrolinių ląstelių).

ląstelių proliferacija tyrimas

3- (4,5-dimetiltiazol-2 il) -2,5-difenil-tetrazolio bromidas (MTT) tyrimą, buvo atliekama siekiant įvertinti RPL6 poveikį ląstelių proliferacijos kaip buvo aprašyta anksčiau [32]. Absorbcija esant 490 nm (A490) kiekvieno šulinio buvo skaityti apie mikroplašu skaitytuvas BP800 (BIOHIT, Helsinkis, Suomija). Kiekvienas eksperimentas buvo atliktas quadruplicates ir buvo pakartota 3 kartus.

Minkšti agaras kolonija formavimo tyrimai

Minkštas agaras kolonija formavimas tyrimas buvo siekiama nustatyti tvirtinimo nepriklausomas ląstelių augimo potencialą. Dvylika duobučių lėkšteles buvo užpildytos su 0,5 ml 0,5% tauriųjų agaro (Invitrogen) į RPMI1640 papildyti su 10% veršiuko serumo kaip apatinis sluoksnis ir leidžiama sukietėti, esant 4 ° C temperatūroje per naktį. 200 ląstelių, kad bendras buvo sustabdytos 0,25 ml 0,3% agarozės ir pasėjamos ant dugno agaro. Ląstelių kultūrų plokštės išliko 2 savaites CO _{2 inkubatoriaus. buvo skaičiuojamas kolonijų skaičius mikroskopu.}

tumorogeniš- nuogas pelės

Naviko formavimas buvo atliekamas siekiant įvertinti RPL6 poveikį tumorogeniš- in vivo. Balb /c nuogas pelės nuo 4 iki 6 savaičių teikė Šanchajaus vėžio instituto ir laikyti mikro-Isolator narveliuose teigiamą oro slėgį, ir palaikoma pastovi temperatūra (22 ° C) ir drėgmės už tumorogeniš- tyrimas. Maždaug 3 × 10 ^{6 ląstelės at žurnalo etape buvo surinkti ir švirkščiamas po oda į viršutinę nugaros BALB /c nuogas pelių. Bent trys nuogas pelių buvo naudojami kiekvienai grupei. Pelės žuvo 4 savaičių ir buvo įvertintas navikas svoris kiekvienos pelės. Visos procedūros eksperimentų su gyvūnais buvo atliekami laikantis institucinės gyvūnų globos ir vaistų komiteto gaires eksperimento Gyvūnų centro ketvirtosios Karo medicinos universitete.}

Mobilaus ryšio ciklo analizė

analizę ląstelės ciklo etapas platinimas, SGC7901 ir jo variantai at žurnalo etape buvo surinktos ir išplauti du kartus ledinio PBS. Mobilaus ryšio granulės buvo nustatytas 70% etanolio, gydomi RNaze A (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN) ir tamsintas su propidiumo jodido (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO).

• PLoS ONE: DNR remontas Genų APE1 T1349G polimorfizmas ir rizikos skrandžio vėžio į Kinijos gyventojų
• PLoS ONE: praradimas promielocitine leukoze Baltymai skrandžio vėžiu: Pasekmės IP 10 išraiška ir naviko infiltruojanti limfocitų