Plos ONE: downregulation od RPL6 s siRNA zavira proliferacijo in Cell cikla napredovanje človeške želodčne rakave celične linije

Povzetek

Naša predhodna študija je pokazala, da je bil človek ribosomske protein L6 (RPL6) reguliran v pojavom odporna na raka želodca celice in prekomernega izražanja RPL6 bi zaščitili raka želodca pred apoptozo z drogami povzroča. Poleg tega je bilo dokazano, da up-regulacijo RPL6 pospešeno rast in okrepljeno vitro tvorijo kolonije sposobnost dobrega okoljskega stanja celic, medtem ko navzdol ureditev RPL6 razstavil nasprotne rezultate. Sedanja Študija je bila zasnovana, da razišče morebitno vlogo RPL6 pri zdravljenju raka želodca za kliniko. Izraz RPL6 in ciklin E v želodcu tkivih raka in normalno želodčne sluznice je bila ocenjena z immunohistochemisty. Ugotovljeno je bilo, da so bili RPL6 in ciklin E izražena na višji ravni v želodcu tumorskih tkivih, kot da je v normalnem želodčne sluznice in dva sta ekvivalenta, rak želodca. Preživetje čas pooperacijskih bolnikih smo analizirali z analizo Kaplan-Meier in je bilo ugotovljeno, da bolniki s RPL6 pozitivnega izražanja pokazala krajši čas preživetja kot pri bolnikih, ki z RPL6 negativnim izrazom. RPL6 je nato gensko navzdol urejeno v želodčni SGC7901 raka in linije AGS celic s siRNA. Dokazano je bilo, da navzdol ureditev RPL6 zmanjšana sposobnost tvorjenja kolonij želodčnih rakastih celic in vitro in zmanjša rast celic in vivo. Poleg tega bi lahko navzdol ureditev RPL6 zatreti G1 do S faznega prehoda v teh celicah. Poleg tega smo priča, da RPL6 siRNA navzdol urejeno ciklin E izraz v SGC7901 in AGS celic. Če povzamemo, ti podatki kažejo, da je bilo RPL6 prekomerno izražene v človeških želodčnih tkivih in povzroča slabo prognozo. Dol-ureditev RPL6 mogel zatreti rast celic in napredovanju celičnega ciklusa vsaj prek navzdol regulacijo ciklin E, in ki se lahko uporablja kot nov pristop k zdravljenju raka želodca

Navedba. Wu Q, Gou Y, Wang Q Jin H, Cui L Zhang Y, et al. (2011) downregulation od RPL6 s siRNA zavira proliferacijo in Cell cikla napredovanje človeške želodčne rakave celične linije. PLoS ONE 6 (10): e26401. doi: 10,1371 /journal.pone.0026401

Urednik: Xin-yuan Guan, The University of Hong Kong, Kitajska

Prejeto: 7. avgust 2011; Sprejeto: 26. september 2011; Objavljeno: 17. oktober 2011

Copyright: © 2011 Wu et al. To je odprtega dostopa članek razširja pod pogoji Creative Commons Attribution License, ki omogoča neomejeno uporabo, distribucijo in razmnoževanje v katerem koli mediju, pod pogojem, da prvotni avtor in vir knjižijo

Financiranje:. Ta študija je podprl delno z donacijami v državnem Temeljni raziskovalni program Kitajske (št 2010CB732400, št 2010CB529300) in National Natural Science Foundation Kitajske (št 30801349). Med financerji imel nobene vloge pri oblikovanju študije, zbiranje in analizo podatkov, sklep, da se objavi, ali pripravi rokopisa

nasprotujočimi si interesi.. Avtorji so izjavili, da ne obstajajo konkurenčni interesi

Uvod

rak želodca, z visoko moralo, je bil eden najbolj malignih rakov v azijskih državah. Njen pojav je bil proces, multi-faktorji in multi-korakov, ki so vključene v spremembe v številnih molekul, vključno z aktivacijo proto-onkogeni, deaktivacijo tumor-zaviralnih genov, spremembe v proteinov povezanih celičnega ciklusa in tako naprej. V zadnjem desetletju je bilo ugotovljeno veliko število proto-onkogeni in tumor genov, zaviralcev. Kljub precejšen število genov že opisanih, so še vedno identificirati nove gene s onkogenih potencialnih ali tumorskih-zatiranje aktivnosti. Vendar pa je molekularni mehanizem želodca rakotvornost ostaja nejasna.

Ribosom je bistvenega pomena za sintezo beljakovin v vseh celicah, ki je podlaga za ribosomske RNA (rRNAs) in ribosomske beljakovine (RPP). Veliko RPS prav tako igrajo različne vloge, ki so neodvisni od beljakovin biosinteze, ki se imenuje ekstra ribosomne ​​Funkcija [1]. Povečanje več raziskav je pokazala, da je motnja prevajanja beljakovin sodelovali v tumorigeneze in veliko ribosomskih proteini so disfunkcionalne v tumorjih, vendar so mehanizmi so še vedno neznani [2]. Predlagano je bilo, da je veliko RPS deluje kot haploinsufficient tumorja valov v rib in veliko RPP genov lahko tudi onkogeni v človeški naravi [3]. Najstarejši poročilo o odnosih med RPS in tumorjev je bil objavljen v 90-ih od 20 ^{th stoletja, ki je pokazala, da združenje RPS19 z napredovanje karcinoma kolona in diferenciacije [4] .Thereafter so našli več RPP disfunkcionalne v tumorjih , kot je visoka izraz RPL19 v tumorjih dojke [5], prekomerno izražanje RPL7a in RPL37 v vzorcih prostate, rak tkiva [6], višji izraz RPL15 raka na požiralniku [7], RPS že označevalca odkrivanje človeškega ploščatocelični karcinom materničnega vratu [8], in prekomerno ekspresijo RPL36a povezanega s celično proliferacijo v hepatocelularnega karcinoma [9] in tako naprej. Poročila o pridružitvi RPP z rakotvornost še vedno narašča [2], [10]. Vendar pa natančne vloge RPP v razvoj tumorjev so različni in še vedno potrebujejo dodatna pojasnila.}

Pred tem smo analizirali profile mRNA človeške želodčne rak celične linije SGC7901 in njene multidrug odporna varianta SGC7901 /VCR z diferencialno prikaže PCR in zatiranje odštevalni hibridizacija [11], [12]. RPL6 opredeljena kot ena od preveč izražen genov v SGC7901 /ADR v primerjavi z SGC7901, ki ga je še dodatno potrdil RT-PCR in Northern blot analizo [13]. Kasnejše študije so pokazale, da je up-regulacijo RPL6 zaščiten želodčne rakavih celic, adriamicinsko inducirane apoptoze in večjo odpornost želodčne rakavih celic na več citostatikov, vključno vinkristin, adriamicin, etopsida, cisplatina in 5-fludrouracil [13]. Ti podatki kažejo, da bi lahko RPL6 spodbujanje maligni fenotipi želodčnih rakave celice, ki nas je privedla do izvede naknadno študijo za nadaljnje raziskovanje natančno vlogo RPL6 v kancerogenosti in razvoj raka želodca. Potem smo ugotovili, da bi lahko gensko regulacijo navzgor RPL6 v ges celicah pospeši rast in krepitev vitro sposobnost tvorjenja kolonij ges celic, medtem ko bi lahko navzdol ureditev RPL6 kažejo ravno nasprotno. Poleg tega, up-regulacijo RPL6 bi spodbujali G1 v S fazo tranzicije ges celic. Nadaljnja raziskava je pokazala, da RPL6 reguliran ciklin E izraza v ges celic [14]. Če povzamemo, ti podatki kažejo, da bi lahko RPL6 spodbujanje maligni fenotipi želodčne rakavih celic in RPL6 lahko igrajo onkogenega vlogo pri tumorigeneze in razvoj raka želodca, ki nas je vodila za izvedbo te študije, da razišče morebitno vlogo RPL6 v genu zdravljenje raka na želodcu in se lahko uporablja kot nov pristop k zdravljenju raka želodca.

Rezultati

RPL6 in ciklin E izraz v človeške želodčne vzorcih raka poveže sosednje ne-neoplastične tkiva

Če želite raziskati odnose med RPL6 in ciklin E izražanja z razvojem raka želodca, smo zaznali RPL6 in ciklin E izraz v človeške želodčne tkiv rakom in izravnanih sosednjih non-neoplastične tkivih imunohistokemičnim barvanjem. Rezultati so pokazali, da RPL6 in cyclinE lokalizirane skoraj v citoplazmi in le občasno v jedrih v želodčnih rakavih celic (sl. 1A). Nadaljnja analiza je odkrila, da je bil pozitiven razmerje (vključno osebkov, ki obarvajo) od RPL6 84% (46 od 55 bolnikov), medtem ko je bilo pozitivno razmerje ciklin E 75% (41 od 55 bolnikov) v človeškem želodcu vzorcih raka. Pozitivno razmerje tako RPL6 in ciklin E je bila 70% (38 od 55 bolnikov), medtem ko je bilo negativno razmerje (vključno s primerki, ki niso madež), tako RPL6 in ciklin E 11% (6 od 55 bolnikov) v človeške želodčne vzorcih raka . Pozitivno razmerje obeh RPL6 in ciklin E, je bila 18% (8 od 55 bolnikov) v izravnanih sosednjih non-neoplastičnih tkiv (podatki niso prikazani). V zvezi z razlikami med RPL6 izražanja in cyclinE izražanja v človeške želodčne vzorcih raka, ni bilo nobene razlike. Sedanja študija je pokazala, da so bili RPL6 in ciklin E izrazi v človeške želodčne vzorcih raka sorodnik (slika 1B, p. ≪ 0,05), ki lahko igrajo con-radodaren vlogo pri nastanku raka želodca in RPL6 in ciklin E lahko služijo kot biomarkerjev za želodčne diagnozo raka in cilju genski terapiji raka želodca. Na koncu spremljanje, so čas preživetja bolnikov, ki so analizirali z metodo Kaplan-Meier, rezultati pa so pokazali, da pri bolnikih, ki so spremljana, bolniki s tako RPL6 pozitivno in ciklin E pozitivno pokazala krajši čas preživetja in slabšo prognozo kot tisti z obema RPL6 negativen in ciklin E negativen izraz, ali pa tiste, ki imajo RPL6 pozitiven in ciklin E negativna ali RPL6 negativno in cyclinE pozitivnega izražanja oz (slika 2 A, str. < 0,01), ki se lahko pokazala, da bolniki s tako RPL6 pozitiven in ciklin E pozitiven pokazala slabo prognozo. To je pokazala tudi, da bolniki z RPL6 negativno izražanja pokazala daljši čas preživetja kot RPL6 pozitivnimi (slika 2B, str. ≪ 0,01), in bolniki s ciklin E pozitivnega izražanja pokazala slabo prognozo (slika 2C, str. ≪ 0,01). Zato lahko ugotovimo, da lahko RPL6 služil kot biomarker za ocenjevanje prognozo bolnikov z rakom želodca.

Izražanje RPL6 v želodcu raka celičnih linijah in njeni derivati ​​

Da bi še dodatno raziskati potencialna vloga RPL6 v genski terapiji raka želodca, je bilo SGC7901 in AGS celice transfekciji s RPL6 specifične siRNA in mešani bazen variant G418 odpornih celic je bil proizveden. V G418 odporne variante zatočišča siRNA RPL6 specifične so bili ustrezno imenovan SGC7901-siRPL6-1, AGS-siRPL6-1 in SGC7901-siRPL6-2, AGS-siRPL6-2. V G418 odporna celice zatočišča žoga siRNA plazmidov so bili zasnovani kot SGC7901-siControl in AGS-siControl oz. Kot je prikazano na sliki 3A je RPL6 izraz občutno navzdol urejeno v SGC7901-siRPL6-1, AGS-siRPL6-1 in SGC7901-siRPL6-2, AGS-siRPL6-2 celic v primerjavi s starševske celice in kontrolnih celic. V tej študiji, SGC7901-siRPL6-2 in AGS-siRPL6-2 pokazala učinkovitejše zaviralne rezultate, ki so pokazali, da bi se celice SGC7901-siRPL6-2 in AGS-siRPL6-2 uporablja kot dober model celic za pojasnitev potencial vloga RPL6 v genski terapiji raka želodca za kliniko.

downregulation od RPL6 zavirajo rast želodčni rak celic in vitro

Da bi preučili, ali bi navzdol ureditev RPL6 izražanja zavira rast SGC7901 in AGS celice, starševski celice, kontrolne celice in njihove variante smo posejali v kulturi plošče in njihova rast je spremljala vsak dan z MTT testom. Kot je navedeno v rastnih krivulj na sliki 3b, nadzor (SGC7901-siControl in AGS-siControl) celice so pokazali podobno stopnjo rasti do starševskega (SGC7901 in AGS) celic oziroma, ker SGC7901-siRPL6-1, AGS-siRPL6-1 in SGC7901 -siRPL6-2, AGS-siRPL6-2 celice razstavljene nižjo stopnjo rasti kot nadzor celic in SGC7901-siRPL6-2, AGS-siRPL6-2 celice pokazala najnižjo stopnjo rasti (slika 3B, str. < 0,05). Rast sidrišče neodvisna od teh celic je bila nadalje analizirana z mehkim agar testom tvorbe kolonije. Izkazalo se je, da SGC7901-siRPL6-1, AGS-siRPL6-1 in SGC7901-siRPL6-2, AGS-siRPL6-2 celice proizvajajo veliko manj kolonije celic v mehkem agarju kot njihove starševske celice in kontrolnih celic (slika 3C, str. < 0,05), celice, imenovane s SGC7901-siRPL6-2 in AGS-siRPL6-2 proizvaja najmanj kolonije. Ti podatki kažejo, da bi lahko navzdol ureditev RPL6 zavirajo rast želodčni rak celic in zavira možnost za nastanek kolonij SGC7901 in AGS celic.

RPL6 siRNA zaviral tumorigeneze želodčnih rakavih celic in vivo

nadalje potrjujejo učinke RPL6 na tumorigeneze raka želodca, je tvorba tumorja test izvedli pri golih miših. SGC7901, AGS in SGC7901-siRPL-2, so AGS-siRPL6-2 celice podkožno vcepimo v desni ali levi zgornji zadnji gole miši na enem mestu. (. Slika 4A in C) Štiri tedne kasneje, je bilo ubitih miši in so izrezali presajene tumorjev in velikosti tumorja so bile ocenjene (slika 4B in D, p. ≪ 0,05). Se je občutno zmanjšanje velikosti ksenograftih v RPL6 navzdol urejeno celice. Ti podatki kažejo, da knock navzdol od RPL6 lahko zavirajo želodčni rak celic tumorigeneze vivo in RPL6 lahko igrajo ključno vlogo pri spodbujanju maligne rasti želodčnih rakavih celic in vivo.

RPL6 upočasnila G1-S fazni prehod SGC7901 celice

Če želite odkriti mehanizme, ki podpirajo omejevalno vlogo RPL6 rasti želodca rakave celice, so bili analizirani učinki RPL6 na porazdelitev celičnega cikla SGC7901 celic (sl. 5A). Kot je prikazano na sliki 5B, SGC7901-siRPL6-1 celice pokazala nekoliko večjo odstotek G1 fazi in zmanjšal odstotek S fazi, medtem ko je na zaslonu prikazano SGC7901-siRPL6-2 celic močno povečal delež G1 fazi in zmanjšal odstotek S faze (P < 0,05 ) v primerjavi s starševske celice in nadzor celic. Ti so pokazali, da bi lahko RPL6 specifične siRNA upočasnila G1-S prehod z dne SGC7901 celic.

RPL6 navzdol regulirano ekspresijo ciklin E v želodcu rakavih celic na ravni proteina

To je dobro znano da G1-s napredovanje je pod nadzorom ciklin D /CDK4 in ciklin E /CDK2 kompleksov, ki jih ureja INK4 družinskih članov, p21 in p27, oz. Izraz teh regulatorjev v SGC7901 in AGS celic in njenih variant smo določili z analizo Western Blot. Kot je prikazano na sliki 6, je bil izraz ciklin E občutno navzdol urejeno v SGC7901-siRPL6-2 in AGS-siRPL6-2 celic. Izrazi CDK2, P16, p21 in p27 je bilo v SGC7901 in AGS variant celic nespremenjena. Ti podatki kažejo, da dol ureditev RPL6 zmanjšala izražanje ciklin E v SGC7901 in AGS celic, ki bi lahko opredeljene tudi potencialno vlogo RPL6 in ciklin E pri razvoju raka želodca in RPL6 lahko uporablja kot cilj gena za raka želodca v kliniki.

Pogovor

Ta študija je pokazala, da so bili RPL6 in ciklin E prekomerno izražen v želodcu tkivih raka in obstaja pozitivna korelacija med njimi v želodcu tkivih raka. So sledili rezultati so pokazali, da bolniki z RPL6 negativno izražanja pokazala daljši čas preživetja kot tisti z RPL6 pozitivno izražanja, ki je predlagal, da RPL6 pozitivnih bolnikih je pokazala slabo prognozo. Nadaljnje raziskave so pokazale, da dol ureditev RPL6 ga RPL6-posebne siRNA zaviral rast proliferacije in pritrdišča neodvisen želodčnih linij rakavih celic in vitro, potlačeno potek celičnega ciklusa in zatreti ciklin E izraz poleg tega rasklapanje za RPL6 s RPL6 specifične siRNA zatreti tumor tvorba sposobnost želodčnih rakavih celic in vivo.

v naši prejšnji študiji različno izražene gene, povezane z multiplo odpornostjo želodčnih rakavih celic smo izolirali s pomočjo razlika prikaza RT-PCR in odštevalni hibridizacijo [11], [ ,,,0],12]. RPL6, sestavni del velike podenote ribosoma je tako izoliran kot klona pretirano izražena v pojavom odporna na želodčno rakavih celic [11]. Dokazano je bilo, da bi RPL6 zaščito želodčne rakavih celic kemoterapevtskim apoptozo zaradi droge [13]. Ti podatki kažejo, da bi lahko RPL6 vključiti v ureditev maligni fenotip raka želodca. Nadaljnja raziskava je bila zasnovana, da razišče vlogo RPL6 v tumorigeneze in razvoj raka želodca, rezultati pa kažejo, da up-regulacijo RPL6 pospešila rast in vitro koloniji sposobnost tvorjenja ges celic, medtem navzdol ureditev RPL6 razstavo nasprotne rezultate. Prav tako up-regulacijo RPL6 pospešeno G1 v S fazo prehoda dobrega okoljskega stanja celic vsaj z up-regulacijo ciklin E izražanja, medtem ko dol ureditev RPL6 pokazala nasprotne rezultate [14]. Če povzamemo, ti podatki kažejo, da bi lahko RPL6 igrajo onkogenega vlogo pri tumorigeneze in razvoj raka želodca in lahko služi kot nov pristop k genske terapije raka želodca.

Danes narašča več bolnikov umrl zaradi raka zaradi maligne fenotipe od njih. Rak terapija moti ljudi po vsem svetu. Poleg kemoterapijo in zdravljenje kirurgije, genska terapija je nova in obetavna zdravljenje raka. Ena izmed najbolj pogosto uporabljenih metod za gensko terapijo je interferenčno RNA (RNAi). RNAi, zelo ohranjen mehanizem gen za dušenje zvoka igra pomembno vlogo pri regulaciji genske ekspresije. Gen za dušenje zvoka s post-transkripcijske mehanizem vključuje homologno dvojno vijačnico RNA je bila prvič odkrili v umetnih sistemih, kjer je bil uveden dvojni verižnega RNA (dsRNA) z injekcijo ali z ekspresijo transgenih konstruktov. To se pojavi, ki jih male interferenčne RNA (siRNA) v citoplazmi celic sesalcev. V siRNA tehnologijo, sta se upoštevali dve mehanizmi, neposredna dobava sintetičnih siRNA nukleotidov in uvedba plazmidne DNA (pDNA) kodiranje kratek Ostra konstrukt (shRNA), da bi bilo encimsko razgradi v siRNA [15]. SiRNA igral svoje zaviralne vloge z usklajenimi s sekvencami mRNA in zaviral posledično mRNA izražanja in prevajanja, in delal kot negativno uredbe. Danes, več znanstveniki odkrili, da podrli izražanje genov s siRNA lahko znatno zavirajo rast tumorja in metastaz. -X vezana zaviralec apoptoze beljakovin (XIAP), pomemben član inhibitorjev apoptoze beljakovin (IAP) družine, ki je vključena v kontrolo celične delitve, proliferacijo celic in inhibicijo apoptoze [16], [17]. Dol-ureditev XIAP ga siRNA lahko bistveno zavre proliferacijo tumorskih celic in senzibilizirati tumorske celice s kemoterapevtiki [18], [19]. Osteopontinom (OPN), protein, ki se je preveč izražena v večini bolnikov z rakom želodca in povezana s patogenezo, igral pomembno vlogo pri jedrskega orožja, invazije, metastaze in preživetje raka želodca [20]. Potem navzdol ureditev OPN, ki ga OPN-specifične siRNA močno zaviral rast, migracije in invazijo želodčnih rakavih celic [21]. CML66, roman tumor antigen, ki je imel onkogenega vlogo, je bilo konec, izražena v večini rakavih celic linij in raka [22], podreti svoj izraz, ki ga CMl66 specifične siRNA močno zaviral orožja, invazija in metastaze HeLa celic tako v vivo in in vitro poskusih [23]. FABP5, ki kodira kožno maščobne kisline vezavo proteinov (C-FABP), je do regulirane pri raku prostate in deluje kot domnevne onkogena. Dol-ureditev FABP5 ga siRNA učinkovito inhibira prostate rast rakavih celic FABP5 specifična v golih miših [24]. Še več, ko je bil ribosomske protein RPS13 kar naj bi povečalo raka celična linija želodca SGC7901 rast podrli s RPS13 specifične siRNA, it rast bistveno zaviral SGC7901 celic in sposobnost tvorjenja kolonij in vitro in zatreti nastanek tumorja sposobnosti pri golih miših [25]. Prejšnja Raziskave so pokazale tudi, da je sistemska dostava siRNA preko atelocollagen, ki je posebej namenjen tumorjev, varno in izvedljivo za terapijo raka pri raku prostate [26]. Zato je dokaz zgoraj predlagal, da siRNA, z zaviranjem izražanje genov je lahko nov pristop k zdravljenju raka in da gensko zdravljenje raka izvedljivo za klinično zdravljenje.

V tej študiji, izraze RPL6 in ciklin E v želodcu so odkrili raka tkiva in izravnana sosednje ne-neoplastične tkiva in rezultati so pokazali, da RPL6 in ciklin E je pokazala višje izražanje v želodčnih rakavih tkivih kot v izravnanih sosednjih ne-neoplastične tkiva. Poleg tega, da je korelacija med RPL6 in ciklin E izražanja v želodčnih tkivih z rakom, ki je predlagal, da se lahko igrajo con-radodaren vlogo pri nastanku raka želodca in RPL6 bi ga lahko uporabili kot biomarker za želodčne diagnozo raka. So sledili rezultati pokazali, da bolniki z obema RPL6 pozitivnimi in ciklin E pozitivnih izrazov pokazala krajši čas preživetja in slabša napoved od ustrezne kontrole in je tudi navedla, da bolniki s RPL6 negativno izražanja pokazala daljši čas preživetja in boljšo prognozo kot pri bolnikih z RPL6 pozitivnega izražanja, ki je predlagal, da se lahko RPL6 služil kot biomarker za želodčne prognozo raka in ciljnega gena za želodčne zdravljenju raka na kliniki.

da bi še dodatno raziskati morebitno izvedljivost RPL6 kot cilj za gensko zdravljenje raka želodca v kliniki, smo potrkali dol RPL6 izražanja v SGC7901 in AGS celic, ki ga RPL6 specifične siRNA, rezultati so pokazali, da dol ureditev RPL6 v raka želodca celičnih linijah starševskih (SGC7901 in AGS) rast učinkovito blokiranem celic in vitro sposobnost tvorjenja kolonij. Nadaljnja analiza celičnega cikla je pokazala, da navzdol ureditev RPL6 upočasnilo G1 do S fazo želodca rakavih celic. Western blot analiza je pokazala, da RPL6 zaviral napredovanje celičnega ciklusa z zmanjšanjem števila ciklin E. tumor poskusih ustanovitveni pri golih miših kažejo, da bi lahko navzdol ureditev RPL6 zatreti nastanek tumorjev in vivo.

ciklin E, ki je ključna celica cikel proteina, ki igra ključno vlogo pri G1-S prehodom bil motnjo v različnih tumorjih [27] [28] [29] [30] [31]. Predhodna raziskava je pokazala, da je bil ciklin E pomembna molekula tumorigeneze. V tej raziskavi smo ugotovili, da ciklin E izraz, skupaj z RPL6 je bila višja v človeške želodčne rakavih tkiv, kot da se ujemajo sosednjih ne-neoplastične tkiv, ki kažejo, vlogo ciklina E igral v razvoj raka želodca. Nadaljnje raziskave so pokazale, da RPL6 vpliva na rast celic, ki jih ureja ciklin E, ki je pokazala, da visoka izraz ciklin E pospešena rast celic, medtem ko nizka izraz ciklin E zavira proliferacijo celic. Ciklin E in RPL6 lahko igrajo con-velikodušno vlogo pri razvoju raka želodca.

Skratka, ta študija je pokazala, da so bili RPL6 in cyclinE izraz povezana drug z drugim v želodcu tkiva raka in ki bi jo lahko igrajo po- velikodušno vlogo pri razvoju raka želodca, ki nakazujejo, da je lahko RPL6 uporabljajo kot diagnostično orodje za rakom želodca. Spremljanje Analiza podatkov je pokazala, da bolniki z RPL6 negativno izražanja pokazala daljši čas preživetja in boljšo prognozo kot pri bolnikih z RPL6 pozitivno izražanja operaciji, ki nakazujejo, da RPL6 služil kot biomarker za želodčne prognozo raka in nove genske cilj za terapijo raka želodca. Nadaljnja raziskava je pokazala, da dol ureditev RPL6 izražanja, ki ga RPL6 specifične siRNA zaviral SGC7901 rast celic in vitro sposobnost tvorjenja kolonij, upočasnila SGC7901 celic G1 v S fazo tranzicije, in zatreti nastanek tumorjev in vivo. Skratka, naša sedanjost raziskava je potrdila, da se lahko RPL6 siRNAs uporablja kot nov pristop k zdravljenju raka želodca za kliniko.

Materiali in metode

Etika Izjava

Za vzorcev tkiva so vsi bolniki obveščeni soglasje za uporabo presežne patoloških primerkov za raziskovalne namene. Protokoli, ki se uporabljajo v tej študiji so bili odobreni z zaščito bolnišnice o ljudeh odbora. Uporaba človeških tkiv je odobril Institutional Review Board četrtega vojaške Medical University in je skladna s Helsinške deklaracije, in z zakonodajo. Bolniki, ki ponujajo vzorce za študije podpisal premišljene oblike soglasij. Za raziskave na živalih, so izvedli vse postopke za poskuse na živalih v skladu s smernicami za institucionalno varstvo živali in uporaba odborov centra Poskus živali četrtega vojaške Medical University. ID odobritev za uporabo živali je številka 10.218, ki jih Experiment Center živali četrtega vojaške Medical University.

vzorci tkiva in celične linije

tkivne vzorce vgrajenih s parafinom Zbrali smo 55 bolnikov z želodčni rak, ki je doživel želodca v naši bolnišnici je med letoma 2004 in 2009. Vsi primeri raka želodca in sosednjih non-tumorskih tkivih so diagnosticirali klinično in patološko. Podatki o clinicopathological lastnosti in prognoze bolnikov so bili zbrani in analizirani za nazaj. Skupno 55 bolnikov je sledil vse do konca leta 2009, in dva od njih je bilo izgubljenih med nadaljevalnim obdobjem. Human želodca adenokarcinom celično linijo SGC7901 je bila pridobljena na Akademiji za vojaške medicinske znanosti, je AGS dobimo iz Shanghai Cell banke (Shanghai, Kitajska). Dve celične linije so bile ohranjene v našem zavodu. Vse celične linije so bile vzdrževane v RPMI1640 (Invitrogen, Carlsbad, CA), dopolnjenem z 10% toplotno inaktiviramo fetalnega telečjega seruma (FCS), pri 37 ° C s 5% CO _{2 v navlaženem inkubatorju (Forma Scientific, Marietta, OH).}

Imunohistokemija in Imunohistokemijsko sedaj

Deparaffinized in hidracijo oddelki speremo v sladki vodi 10 minut. Preiskovalna antigen toplotno inducirano smo izvedli v 20 minutah pri 95 ° C z 10 mM citratom natrijevega pufra (pH 6,0). Potem ko so bile drsi ohladimo pri sobni temperaturi 40 minut, so bile v 3% vodikovega peroksida blokirali 20 minut in nato pri normalni koza serumu neprepustni tekočino za 40 minut. Po tem, bi jim bilo omogočeno, da se odzovejo čez noč pri 4 ° C s primarnimi protitelesi za IgG, RPL6 in cyclinE (Santa Cruz). Po Ponovno segrevanje 40 minut, so bile nato reagira z drugim protitelesi (Zhongshan Goldenbridge Biotechnology co.ltd) za nadaljnjih 40 minut pri sobni temperaturi. Nato so bili izdelki, razviti z 3,3'-diaminobenzidine in jih nasprotno s hematoksilinom. Sedaj je bila zaključena specialist patolog in znanstvenik, ki so bili slepi za klinične in patološke informacij. V primeru neskladja, je bilo doseženo soglasje s konference. Deleži pozitivnih celic (0 do +3) in obarvanje intenzivnosti (0 do +3) so ocenjevali ločeno pri povečavi × 200. Prvi je bil izračunan s štetjem števila obarvanih tumorskih celic med skupnim številom tumorskih celic, na primer, ko smo obarvali 25% vseh celic, rezultat delež je 1, in 50% enaka do +2, 75% pogoja je enako na +3, 0% enaka 0. sedaj intenzivnost je bila ocenjena po barvi obarvanih tumorskih celic jedra, še posebej, rezultat 0 pomeni akromatski, 1 pomeni, oranžno, 2 pomeni, rumena in 3 pomeni rjava. Kombinirana sedaj + 1~ + 2 so bile opredeljene "negativno" in + 3~ + 6 je štela za "pozitivno".

plazmida gradnjo in transfekciji

Dva para Ostra mala motečih RNA (siRNA ) oligo za RPL6 so bile oblikovane v skladu s smernicami siRNA zasnove Takara Biotechnology Co., Ltd primerjaj ciljnih zaporedij genoma baze podatkov prehrano pri iskanju BLAST izločijo iz obravnave vsako ciljno zaporedje s 21 baznih parov homologijo stika z drugimi kodiranje zaporedij . Za oligo-1 občutek: 5'-GATCCGGAGAAGGTTCTCGCAACTTTCAAGAGAAGTTGCGAGAACCTTCTCCTTTTTTGGAAA-3 'protismerni: 5'AGCTTTTCCAAAAAAGGAGAAGGTTCTCGCAACTTCTCTTGAAAGTTGCGAGAACCTTCTCCG-3'; pri oligo-2, občutek: 5'-GATCCGTCGAGTTCCTCTACGAAGATTCAAGAGATCTTCGTAGAGGAACTCGATTTTTTGGAAA-3 'protismerni: 5'-AGCTTTTCCAAAAAATCGAGTTCCTCTACGAAGATCTCTTGAATCTTCGTAGAGGAACTCGACG-3'; A žoga DNA duplex je bil zasnovan tudi kot kontrolo za oligo-1, občutek: 5'-GATCCGGTGAGATCTTCGACACAGTTCAAGAGACTGTGTCGAAGATCTCACCTTTTTTGGAAA-3 ', protismiselni: 5'-AGCTTTTCCAAAAAAGGTGAGATCTTCGACACAGTCTCTTGAACTG TGTCGAAGATCTCACCG-3 ". Za žarjenje, da tvorijo DNK dupleksov, 0,01 M vsako smiselnimi in protismiselnimi oligov so bili uporabljeni. Dvojniki razredčimo in nato ligiramo z pSilencer3.1-H1 neo vektor (Takara Biotechnology (Dalian) Co., Ltd). Izdelke so se spremenile v DH5α-kompetentnih celic. so bili izbrani Ampicillin odporna kolonije, označene z omejitev prebavo in dodatno potrjuje zaporedja DNK. V skladu z navodili proizvajalca, so siRNA plazmidi za RPL6 transfektirali v SGC7901 celic z uporabo Lipofectamine 2000 reagenta (Invitrogen, Carlsbad, CA), oz. Štiriindvajset ur po transfekciji smo G418 (400 mg /ml) dodamo v mediju kulture za oblikovanje stabilne klone. Mešani klone smo razširili za dodatnih 2 meseca. V SGC7901 in AGS celice (imenovane tudi starševskih celic) stabilno izražanje eksogenih RPL6 so bili imenovani kot SGC7901-siRPL6-1, AGS-siRPL6-1 in SGC7901-siRPL6-2, AGS-siRPL6-2. In transfektiranih s siControl so bili imenovani kot SGC7901-siRPL6 nadzor in AGS-siRPL6 nadzor (imenovane tudi kontrolne celice).

Cell širjenje test

3- (4,5-dimetiltiazol-2- il) -2,5-difenil-tetrazolijevega bromida (MTT) test smo izvedli za ovrednotenje učinka RPL6 na celično proliferacijo, kot je prej opisano [32]. Absorbanco pri 490 nm (A490) v vsako vdolbinico smo prebrali na bralcu mikroplošča BP800 (BIOHIT, Helsinki, Finska). Vsak poskus je bil izveden v quadruplicates in smo ponovili 3-krat.

Mehki agar nastajanje kolonij testi

Mehki agar oblikovanje kolonija test smo uporabili za določitev potenciala rasti celic sidrišča neodvisen. Dvanajst jamicami so bile napolnjene z 0,5 ml 0,5% plemenita agar (Invitrogen) v RPMI1640 dopolnjene z 10% telečjim serumom kot spodnji sloj in strdi pri 4 ° C preko noči. Skupaj 200 celic smo suspendirali v 0,25 ml 0,3% agaroze in zasejemo na agar dna. Celičnih kultur plošče so se ohranili za 2 tedna v CO _{2 inkubatorja. Število kolonij smo prešteli pod mikroskopom.}

tumorjev pri golih miši

tumorja formacija je bila izvedena za oceno učinkov RPL6 na tumorjev in vivo. BALB /c golih miši od 4 do 6 tednov, so posredovali Shanghai Cancer Institute in nameščene v mikro-izolator kletkah pod pozitivnim zračnega tlaka, in vzdrževati pri konstantni temperaturi (22 ° C) in vlažnosti za študij tumorjev. Približno 3 x 10 ^{6 celic v fazi log so bili zbrani in injiciramo subkutano v zgornjem delu hrbta v BALB /c golih miših. Vsaj tri golih miši smo uporabili za vsako skupino. Miši smo ubili 4 tedne kasneje je bila ocenjena teža tumorja posamezne miši. Vsi postopki za poskuse na živalih so bile izvedene v skladu s smernicami za institucionalno varstvo živali in uporaba odborov centra Poskus živali četrtega vojaške Medical University.}

Cell ciklusu

Za analizo celičnega cikla porazdelitev faza SGC7901 in njegove izpeljanke v fazi log požanjemo in dvakrat sprali z ledeno mrzlo PBS. Celične pelete so bile določene v 70% etanola, obdelamo z RNazo A (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN) in obarvamo z propidijevim jodidom (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO).

• Plos ONE: The popravilo DNA Gene APE1 T1349G polimorfizma in tveganja želodca raka v kitajski Population
• Plos ONE: Izguba Protein promielocitno levkemijo želodčnega raka: Posledice za IP-10 izražanja in tumor-infiltracije Lymphocytes