PLoS ONE: nedregulering af RPL6 af siRNA Forhindrer spredning og cellecyklusprogression for Human mavekræft cellelinier

Abstrakt

Vores tidligere undersøgelse viste, at menneskelig ribosomale protein L6 (RPL6) var opreguleret i multiresistente gastrisk kræftceller og overekspression af RPL6 kunne beskytte mavekræft fra narkotika-induceret apoptose. Det blev yderligere demonstreret, at opregulering af RPL6 accelereret vækst og forbedret in vitro kolonidannende evne GES celler, mens nedregulering af RPL6 udviste den modsatte effekt. Den foreliggende undersøgelse var designet til at undersøge den potentielle rolle RPL6 i terapi af mavekræft til klinikken. Udtrykket af RPL6 og cyklin E i mavekræft væv og normal maveslimhinden blev evalueret ved immunohistochemisty. Det blev konstateret, at RPL6 og cyklin E blev udtrykt på et højere niveau i mavekræft væv end i normal maveslimhinden og de to var korrelative i mavekræft. Overlevelsestid for postoperative patienter blev analyseret ved Kaplan-Meier-analyse, og det blev konstateret, at patienter med RPL6 positivt udtryk viste kortere overlevelsestid end patienter, der med RPL6 negativt udtryk. RPL6 var dengang genetisk nedreguleret i mavekræft SGC7901 og AGS cellelinier ved siRNA. Det blev påvist, at nedregulering af RPL6 reduceret kolonidannende evne gastriske cancerceller in vitro og reduceret cellevækst in vivo. Desuden kunne nedregulering af RPL6 undertrykke G1 til S faseovergangen i disse celler. Endvidere har vi bevist, at RPL6 siRNA nedreguleret cyclin E-udtryk i SGC7901 og AGS celler. Taget sammen foreslår disse data, at RPL6 var overudtrykt i humane gastriske væv og forårsagede dårlig prognose. Nedregulering af RPL6 kunne undertrykke cellevækst og cellecyklus progression i det mindste ved at nedregulere cyklin E, og som kan anvendes som en ny tilgang til mavekræft terapi

Henvisning:. Wu Q, Gou Y, Wang Q, Jin H, Cui L, Zhang Y, et al. (2011) nedregulering af RPL6 af siRNA Forhindrer spredning og cellecyklusprogression for Human mavekræft cellelinier. PLoS ONE 6 (10): e26401. doi: 10,1371 /journal.pone.0026401

Redaktør: Xin-Yuan Guan, The University of Hong Kong, Kina

Modtaget: August 7, 2011; Accepteret: September 26, 2011; Udgivet: 17 oktober 2011

Copyright: © 2011 Wu et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Denne undersøgelse blev delvist understøttet af tilskud fra National Basic Research Program Kina (nr 2010CB732400, No. 2010CB529300), og National Natural Science Foundation of China (nr 30.801.349). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

mavekræft, med høj moral, var en af ​​de mest ondartede kræftformer i de asiatiske lande. Dens forekomst var en proces med multi-faktorer og multi-trin, der er involveret i ændringer i mange molekyler, herunder aktivering af proto-onkogener, inaktivering af tumorsuppressorgener, ændringer i cellecyklus relaterede proteiner og så videre. I det seneste årti er der fundet et stort antal proto-onkogener og tumor-suppressor gener. På trods af den betragtelige antal gener allerede beskrevne, er nye gener med onkogent potentiale eller tumor-undertrykkende aktiviteter stadig at blive identificeret. Men den molekylære mekanisme af gastrisk carcinogenese forbliver uklar.

Ribosome er essentielt for proteinsyntese i alle celler, som udgøres af ribosomale RNA'er (rRNA'er) og ribosomale proteiner (RPS). Mange RP'er spiller også forskellige roller, der er uafhængige af protein biosyntese, som kaldes ekstra-ribosomale funktion [1]. Stiger mere forskning vist, at forstyrrelse af proteintranslation deltaget i tumorigenese og mange ribosomale proteiner var dysfunktionel i tumorer, men de mekanismer var stadig ukendt [2]. Det er blevet foreslået, at mange RP'er fungere som haploinsufficient tumorsuppressorer i fisk og mange RPS gener kan også være onkogener i menneskelig art [3]. De tidligste rapport om forholdet mellem RP'er og tumorer blev offentliggjort i 90 s af 20 ^{århundrede, som demonstrerede sammenslutningen af ​​RPS19 med coloncarcinom progression og differentiering [4] .Thereafter, flere og flere RP'er blev fundet dysfunktionel i tumorer , såsom høj ekspression af RPL19 i brysttumorer [5], overekspression af RPL7a og RPL37 i prøver prostata-cancer væv [6], højere udtryk for RPL15 i kræft i spiserøret [7], RP'er så tidlig påvisning markør for humane skællede celle-carcinoma i livmoderhalsen [8], og overekspression af RPL36a forbundet med cellulær proliferation i hepatocellulært carcinom [9] og så videre. Rapporter vedrørende deltagelse af RP'er med carcinogenese stadig stigende [2], [10]. Men de nøjagtige roller RP'er i tumor udvikling er mangfoldige og stadig har brug for yderligere afklaring.}

Tidligere analyserede vi mRNA profiler af en human mavekræft cellelinje SGC7901 og dens multiresistent variant SGC7901 /VCR ved differential vises PCR og undertrykkelse subtraktiv hybridisering [11], [12]. RPL6 blev identificeret som en af ​​de overudtrykte gener i SGC7901 /ADR sammenlignet med SGC7901, der blev yderligere bekræftet ved RT-PCR og Northern blot-analyse [13]. Efterfølgende undersøgelser afslørede, at opregulering af RPL6 beskyttet gastriske cancerceller fra adriamycin-induceret apoptose og øget modstand gastriske cancerceller til flere kemoterapeutiske lægemidler, herunder vincristin, adriamycin, etopsid, cisplatin og 5-fludrouracil [13]. Disse data viste, at RPL6 kunne fremme maligne fænotyper af gastriske kræftceller, som førte os til at gennemføre den efterfølgende undersøgelse for yderligere at udforske den nøjagtige rolle af RPL6 i carcinogenese og udvikling af mavekræft. Så opdagede vi, at genetisk opregulering af RPL6 i GES celler kunne accelerere væksten og forbedre in vitro kolonidannende evne GES celler, mens nedregulering af RPL6 kunne udstille de modsatte resultater. Desuden opregulering af RPL6 kunne fremme G1 til S faseovergangen for GES celler. Yderligere undersøgelser viste, at RPL6 opreguleret cyclin E-ekspression i GES celler [14]. Tilsammen foreslog disse data, at RPL6 kunne fremme maligne fænotyper af gastriske kræftceller og RPL6 kan spille en onkogen rolle i tumorigenese og udvikling af mavekræft, som førte os til at foretage denne undersøgelse til at undersøge den potentielle rolle RPL6 i gen terapi af gastrisk cancer og kan anvendes som en ny tilgang til gastrisk cancerterapi.

Resultater Salg

RPL6 og cyclin E-ekspression i humane gastriske cancer prøver og matches hosliggende ikke neoplastiske væv

for at udforske forholdet mellem RPL6 og cyklin E udtryk med udviklingen af ​​mavekræft, opdaget vi RPL6 og cyklin E-ekspression i humane mavekræft væv og matchede tilstødende ikke-neoplastiske væv ved immunhistokemisk farvning. Resultaterne viste, at RPL6 og cyclin lokaliseret næsten i cytoplasmaet og kun lejlighedsvis i kerner i gastriske cancerceller (fig. 1a). Yderligere analyse opdagede, at den positive forhold (herunder prøveemner, der farves) af RPL6 var 84% (46 af 55 patienter), mens den positive forhold mellem cyclin E var 75% (41 af 55 patienter) i humane gastriske cancer prøver. Den positive forhold mellem både RPL6 og cyclin E var 70% (38 af 55 patienter), mens den negative forhold (herunder prøveemner, der farvede ikke) af både RPL6 og cyclin E var 11% (6 ud af 55 patienter) i humane gastriske cancer prøver . Den positive forhold mellem både RPL6 og cyclin E var 18% (8 af 55 patienter) i matchede tilstødende ikke neoplastiske væv (data ikke vist). Som for forskellene mellem RPL6 udtryk og cyclin udtryk i humane mavekræft prøver, var der ingen forskel. Den foreliggende undersøgelse viste, at RPL6 og cyklin E udtryk i menneskelige gastrisk kræft prøver var relative (Fig 1B, s. ≪ 0,05), som kan spille en con-generøs rolle i udviklingen af ​​mavekræft og RPL6 og cyklin E kan tjene som en biomarkør for gastrisk cancer diagnose og et gen mål for gastrisk cancerterapi. Ved afslutningen af ​​opfølgningen, blev overlevelsestiden for de patienter, analyseret ved Kaplan-Meier-metoden, og resultaterne viste, at i patienter, der blev fulgt op, patienter med både RPL6 positiv og cyclin E positive udviste en kortere overlevelsestid og dårligere prognose end de med både RPL6 negative og cyklin E negative udtryk, eller dem med RPL6 positive og cyklin E negative eller med RPL6 negativ og cyclin positivt udtryk (fig 2 A, s. < 0,01), hvilket kan afsløres, at patienter med både RPL6 positive og cyclin E positiv viste dårlig prognose. Det er også påvist, at patienter med RPL6 negativ udtryk viste længere overlevelsestid end RPL6 positive (Fig 2B, s. ≪ 0,01), og patienter med cyklin E positivt udtryk viste dårlig prognose (Fig 2C, s. ≪ 0,01). Derfor kan der drages konklusioner, at RPL6 kan serveres som biomarkør for at vurdere prognosen for mavecancerpatienter.

Angivelse af RPL6 i gastrisk cancer cellelinjer og dets derivater

For yderligere at undersøge potentielle rolle RPL6 i genterapi af mavekræft, blev SGC7901 og AGS-celler transficeret med RPL6-specifikke siRNA og det blandede pulje af G418-resistente celle varianter blev produceret. G418-resistente varianter huser RPL6-specifikke siRNA blev derfor navngivet som SGC7901-siRPL6-1, AGS-siRPL6-1 og SGC7901-siRPL6-2, AGS-siRPL6-2. G418-resistente celler, der huser kapløbet siRNA plasmider blev designet som SGC7901-siControl og AGS-siControl hhv. Som vist i figur 3A, RPL6 udtryk var signifikant nedreguleret i SGC7901-siRPL6-1, AGS-siRPL6-1 og SGC7901-siRPL6-2, AGS-siRPL6-2 celler sammenlignet med stamcellerne og kontrol celler. I den foreliggende undersøgelse SGC7901-siRPL6-2 og AGS-siRPL6-2 viste mere effektive inhibitoriske resultater, som viste, at SGC7901-siRPL6-2 og AGS-siRPL6-2 celler kan anvendes som en god celle model til at belyse potentialet rolle RPL6 i genterapi af mavekræft til klinikken.

nedregulering af RPL6 undertrykker mavekræft cellevækst in vitro

for at undersøge om nedregulering af RPL6 udtryk kunne hæmme væksten af ​​SGC7901 og AGS celler, parentale celler, kontrolceller og deres varianter blev podet i dyrkningsplader og deres vækst blev monitoreret hverdag med MTT-assay. Som det fremgår af vækstkurverne i figur 3B, kontrol (SGC7901-siControl og AGS-siControl) celler viste en tilsvarende vækstrate til forældreorlov (SGC7901 og AGS) celler, hvorimod SGC7901-siRPL6-1, AGS-siRPL6-1 og SGC7901 -siRPL6-2, AGS-siRPL6-2 celler udviste lavere vækst end Kontrol celler, og SGC7901-siRPL6-2 viste AGS-siRPL6-2 celler den laveste vækstrate (fig 3B, s. < 0,05). Den forankringsuafhængig vækst af disse celler blev yderligere analyseret med blød agar-kolonidannelse assayet. Det blev afsløret, at SGC7901-siRPL6-1, AGS-siRPL6-1 og SGC7901-siRPL6-2, AGS-siRPL6-2 celler produceres meget mindre celle kolonier i blød agar end deres forældre celler og kontrol celler (Fig 3C, s <.; 0,05), celler navngivet med SGC7901-siRPL6-2 og AGS-siRPL6-2 producerede de mindst kolonier. Disse data antydede, at nedregulering af RPL6 kunne undertrykke gastrisk vækst kræftcelle og hæmmer kolonidannelse evne SGC7901 og AGS celler.

RPL6 siRNA hæmmede tumorigenese af gastriske kræftceller in vivo

Til yderligere bekræfte virkningerne af RPL6 på tumorigenese af gastrisk cancer, blev tumordannelse assay udført i nøgne mus. SGC7901, AGS og SGC7901-siRPL-2 blev AGS-siRPL6-2 celler subkutant podes i højre eller venstre øvre ryg af athymiske nøgne mus på et enkelt sted. (. Figur 4A og C) Fire uger senere blev musene dræbt og de transplanterede tumorer blev udskåret og tumorstørrelser blev evalueret (figur 4B og D, s. ≪ 0,05). Der var et signifikant fald i størrelser af xenografter i RPL6 nedreguleret celler. Disse data viste, at knock-down af RPL6 kunne undertrykke mavekræft celle tumorigenese in vivo og RPL6 kan spille en central rolle i at fremme den maligne vækst af gastriske kræftceller in vivo.

RPL6 faldt G1-S fase overgang SGC7901 celler

for at afdække mekanismerne bag undertrykkende rolle RPL6 i gastrisk vækst kræftcelle, blev virkningerne af RPL6 på cellecyklus distribution af SGC7901 analyserede celler (fig. 5A). Som vist i figur 5B viste SGC7901-siRPL6-1 celler let øget procentdel af G1-fasen og nedsat procentdel af S-fasen, mens SGC7901-siRPL6-2 celler udviste signifikant forøget procentdel af G1-fasen og nedsat procentdel af S-fasen (P < 0,05 ) sammenlignet med parentale celler og kontrolceller. Disse viste, at RPL6-specifikke siRNA kunne aftage G1-S overgang SGC7901 celler.

RPL6 nedreguleret udtryk for cyklin E i gastriske cancerceller på proteinniveauet

Det er velkendt at G1-S progression styres af cyclin D /CDK4 og cyclin E /CDK2-komplekser, som er reguleret af INK4 familiemedlemmer, p21 og p27 hhv. Ekspressionen af ​​disse regulatorer i SGC7901 og AGS celler og dets varianter blev bestemt ved Western Blot-analyse. Som angivet i figur 6, ekspression af cyclin E var betydeligt nedreguleret i SGC7901-siRPL6-2 og AGS-siRPL6-2 celler. Udtryk af CDK2, p16, p21 og p27 var uændret i SGC7901 og AGS celle varianter. Disse data antydede, at nedregulering af RPL6 faldt ekspressionen af ​​cyclin E i SGC7901 og AGS celler, som kan afgrænse den potentielle rolle for RPL6 og cyclin E i udviklingen af ​​mavekræft og RPL6 kan anvendes som et gen mål for gastrisk cancer hos klinikken.

diskussion

den foreliggende undersøgelse viste, at RPL6 og cyklin E var overudtrykt i mavekræft væv, og der er en positiv sammenhæng mellem dem i mavekræft væv. Opfølgende resultater viste, at patienter med RPL6 negativ udtryk viste længere overlevelsestid end dem med RPL6 positivt udtryk, som foreslog, at RPL6 positive patienter viste dårlig prognose. Yderligere forskning viste, at nedregulering af RPL6 af RPL6-specifikke siRNA hæmmede spredning og forankring-uafhængig vækst af gastrisk kræft cellelinjer in vitro, undertrykt cellecyklusprogression og undertrykt cyklin E udtryk, Desuden knockdown af RPL6 ved RPL6-specifikke siRNA undertrykt tumordannelse evne gastriske cancerceller in vivo.

i vores tidligere undersøgelse, differentielt udtrykte gener associeret med multilægemiddelresistens af mavekræft celler blev isoleret ved anvendelse af differential display RT-PCR og subtraktiv hybridisering [11], [ ,,,0],12]. RPL6, en komponent af den store underenhed af ribosom, var således isolerede som en klon overudtrykt i multiresistente gastriske cancerceller [11]. Det blev påvist, at RPL6 kunne beskytte gastriske kræftceller fra kemoterapeutisk lægemiddel-induceret apoptose [13]. Disse data antydede, at RPL6 kunne inddrage i reguleringen af ​​den maligne fænotype af mavekræft. Yderligere undersøgelse blev designet til at udforske rolle RPL6 i tumorigenese og udvikling af mavekræft, og resultater foreslog, at opregulering af RPL6 accelereret vækst og in vitro kolonidannende evne GES celler mens nedregulering af RPL6 udstillet modsatte resultater. Også opregulering af RPL6 accelereret G1 til S faseovergangen for GES celler i det mindste gennem opregulering af cyclin E-udtryk, mens nedregulering af RPL6 viste modsatte resultater [14]. Tilsammen disse data antydede, at RPL6 kunne spille en onkogen rolle i tumorigenese og udvikling af mavekræft og kunne tjene som en ny tilgang til genterapi af mavekræft.

I dag, stigende flere patienter døde af kræft på grund af de maligne fænotyper af dem. Kræft terapi forstyrrede mennesker verden over. Udover kemoterapi og kirurgi behandling, genterapi er en ny og lovende kræftbehandling. En af de mest almindeligt anvendte fremgangsmåder til genterapi er RNA-interferens (RNAi). RNAi, et stærkt konserveret gendæmpning mekanisme spiller en vigtig rolle i reguleringen af ​​genekspression. Gene silencing ved en post-transkriptionel mekanisme, der involverer homolog dobbeltstrenget RNA blev først opdaget i kunstige systemer, hvor dobbelt-strenget RNA (dsRNA) blev indført ved injektion eller ved ekspression af transgene konstruktioner. Dette fænomen opstår ved små interfererende RNA (siRNA) i cytoplasmaet af pattedyrceller. I siRNA teknologi blev to doseringsmekanismer overvejet, direkte levering af syntetisk siRNA nukleotid og introduktion af et plasmid-DNA (pDNA), som koder en kort hårnål-konstruktion (shRNA), som ville være enzymatisk nedbrudt til siRNA [15]. SiRNA spillede sine hæmmende roller ved at matche med de sekvenser af mRNA og hæmmede den deraf mRNA udtryk og oversættelse, og arbejdede som en negativ regulering. I dag har flere og flere forskere opdaget, at bankede ned genekspression ved siRNA væsentlig grad kan undertrykke tumorvækst og metastase. X-bundet inhibitor af apoptose protein (XIAP), et vigtigt medlem af inhibitorer af apoptose protein (IAP) familie, er involveret i kontrollen af ​​celledeling, celleproliferation og inhibering af apoptose [16], [17]. Nedregulering af XIAP af siRNA i væsentlig grad kan undertrykke proliferation af tumorceller og sensibilisere tumorceller til kemoterapeutiske stoffer [18], [19]. Osteopontin (OPN) protein, som blev overudtrykt i de fleste mavecancerpatienter og forbundet med dens patogenese, spillede en vigtig rolle i proliferation, invasion, metastase og overlevelse af gastrisk cancer [20]. Derefter nedregulering af OPN af OPN-specifikke siRNA signifikant hæmmede væksten, migration og invasion af gastriske cancerceller [21]. CML66, et hidtil ukendt tumorantigen der spillede et onkogent rolle, var overudtrykt i de fleste cancercellelinier og cancere [22], vælte dets ekspression af CMl66-specifikke siRNA signifikant inhiberede proliferation, invasion og metastase af HeLa-celler både i vivo og in vitro forsøg [23]. FABP5, som koder kutan fedtsyrebindende protein (C-FABP), er opreguleret i prostatacancer og virker som en formodet onkogen. Nedregulering af FABP5 ved FABP5-specifikke siRNA inhiberes effektivt prostatakræft cellevækst i nøgne mus [24]. Desuden, når ribosomale protein RPS13 som forbedret gastrisk cancercellelinie SGC7901 væksten blev slået af RPS13-specifikke siRNA, det signifikant inhiberede SGC7901 cellevækst og kolonidannende evne in vitro og undertrykte tumordannelse evne hos nøgne mus [25]. Tidligere forskning fandt også, at systemisk levering af siRNA via atelokollagen, som specifikt er rettet mod tumorer, er sikkert og muligt for kræftbehandling i prostatacancer [26]. Derfor beviser ovenfor antydet, at siRNA, ved at inhibere genekspression kunne være en ny tilgang til cancerterapi og gøre genterapi af cancer muligt for klinisk behandling.

I den foreliggende undersøgelse, udtryk for RPL6 og cyclin E i gastrisk cancervæv og den matchende hosliggende ikke neoplastiske væv blev påvist, og resultaterne viste, at RPL6 og cyclin E udviste højere ekspression i gastrisk cancer væv end i matchede tilstødende ikke neoplastiske væv. Endvidere er der en sammenhæng mellem RPL6 og cyklin E udtryk i gastrisk kræft væv, der foreslog, at de kan spille en con-generøs rolle i udviklingen af ​​mavekræft og RPL6 kunne tjene som biomarkør for mavekræft diagnose. Opfølgende resultater viste, at patienter med både RPL6 positive og cyklin E positive udtryk viste en kortere overlevelsestid og dårligere prognose end den tilsvarende kontrol, og også viste, at patienter med RPL6 negativ udtryk viste længere overlevelsestid og bedre prognose end patienter med RPL6 positivt udtryk, der foreslog, at RPL6 kan serveres som biomarkør for mavekræft prognose og et gen mål for mavekræft behandling i klinikken.

for yderligere at udforske potentialet muligheden for RPL6 som mål for mavekræft i klinikken genterapi, vi bankede ned RPL6 ekspression i SGC7901 og AGS celler ved RPL6-specifikke siRNA, viste resultaterne, at nedregulering af RPL6 i gastrisk cancer parentale cellelinier (SGC7901 og AGS) effektivt inhiberede cellevækst og in vitro kolonidannende evne. Endvidere cellecyklus-analyse, at nedregulering af RPL6 decelereret G1 til S-fasen af ​​gastriske cancerceller. Western blot analyse viste, at RPL6 inhiberede cellecyklusprogression via nedregulering af cyclin E. tumordannelse eksperimenter i nøgne mus tydede på, at nedregulering af RPL6 kunne undertrykke tumordannelse in vivo.

cyclin E, en central celle cyklus protein, der spillede vigtige roller i G1-S overgang var i uorden i mange forskellige tumorer [27], [28], [29], [30], [31]. Tidligere forskning viste, at cyclin E var en vigtig molekyle i tumorigenese. I den foreliggende undersøgelse, opdagede vi, at cyclin E-ekspression, sammen med RPL6 var højere i humane gastriske cancer væv end i matchede hosliggende ikke neoplastiske væv, som foreslået rolle cyclin E spiller for udviklingen af ​​gastrisk cancer. Yderligere forskning viste, at RPL6 påvirket cellevækst ved at regulere cyclin E, som viste, at høj ekspression af cyclin E accelereret cellevækst mens lav ekspression af cyclin E decelereret celleproliferation. Cyclin E og RPL6 kan spille con-generøse roller i udviklingen af ​​mavekræft.

Som konklusion den foreliggende undersøgelse viste at RPL6 og cyclin-ekspression var forbundet med hinanden i gastrisk cancer væv, og de kan spille kon- generøse roller i udviklingen af ​​mavekræft, som foreslog, at RPL6 kan anvendes som et diagnostisk redskab i gastrisk kræft. Opfølgning dataanalyse viste, at patienter med RPL6 negativ udtryk viste længere overlevelsestid og bedre prognose end patienter med RPL6 positivt udtryk postoperativt, som foreslog, at RPL6 tjente som en biomarkør for mavekræft prognose og en roman gen mål for mavekræft terapi. Yderligere undersøgelse viste, at nedregulering af RPL6 udtryk ved RPL6-specifikke siRNA hæmmede SGC7901 cellevækst og in vitro kolonidannelse evne, aftog SGC7901 celle G1 til S faseovergang, og undertrykte tumordannelse in vivo. Som konklusion vores nuværende undersøgelse bekræftede, at RPL6 siRNAs kan anvendes som en ny tilgang til gastrisk cancer terapi for klinikken.

Materialer og metoder Salg

etiske retningslinjer

I vævsprøver blev alle patienter informeret samtykke til at bruge overskydende patologiske prøver til forskningsformål. Protokollerne anvendt i denne undersøgelse blev godkendt af hospitalets beskyttelse af personmotiver Udvalg. Brugen af ​​humane væv blev godkendt af institutionelle gennemgang bestyrelsen for fjerde Military Medical University og blev tilpasset til Helsingfors-erklæringen, og med lovgivning. Patienter, der tilbyder prøver til studiet underskrevet informeret samtykke formularer. For dyr forskning, blev alle procedurer for dyreforsøg udført i overensstemmelse med de institutionelle Animal Care og brug Udvalg retningslinjer for Experiment Animal centrum af den fjerde Military Medical University. Godkendelsen ID for at bruge dyrene blev nr 10218 af Experiment Animal center for Fjerde Military Medical University.

Vævsprøver og cellelinier

Vævsprøver indlejret med paraffin blev indsamlet fra 55 patienter med mavekræft, der undergik gastrektomi i vores hospital mellem 2004 og 2009. Alle tilfælde af mavekræft og tilstødende ikke-tumorvæv blev diagnosticeret klinisk og patologisk. Data om klinisk-patologiske træk og prognoser af patienterne blev opsamlet og analyseret retrospektivt. I alt 55 patienter blev fulgt op indtil udgangen af ​​år 2009, og to af dem blev tabt under opfølgningsperioden. Menneskelig gastrisk adenocarcinom cellelinje SGC7901 blev opnået fra Academy of Military Medical Science, blev AGS opnået fra Shanghai Cell Bank (Shanghai, Kina). De to cellelinier blev bevaret i vores institut. Alle cellelinier blev opretholdt i RPMI1640 (Invitrogen, Carlsbad, CA) suppleret med 10% varmeinaktiveret føtalt kalveserum (FCS) ved 37 ° C med 5% CO _{2 i en fugtig inkubator (Forma Scientific, Marietta, OH).}

Immunhistokemi og immunhistokemisk scoring

afparaffineres og rehydrerede snit blev vasket i ferskvand i 10 minutter. Varmeinduceret antigen-genvinding blev udført i 20 minutter ved 95 ° C med 10 mM citrat natrium (pH 6,0). Efter objektglassene blev afkølet ved stuetemperatur i 40 minutter, blev de blokeret i 3% hydrogenperoxid i 20 minutter og derefter i normalt gedeserum begrænse væske i 40 minutter. Herefter blev de tilladt at reagere natten over ved 4 ° C med primære antistoffer for IgG, RPL6 og cyclin (Santa Cruz). Efter genopvarmning i 40 minutter, de blev derefter omsat med sekundære antistoffer (Zhongshan Goldenbridge Biotechnology CO.LTD) i yderligere 40 minutter ved stuetemperatur. Så produkterne er udviklet med 3,3'-diaminobenzidin og modfarvet med hæmatoxylin. Scoring blev afsluttet af en specialist, patolog og en videnskabsmand, der var blindet for den kliniske og patologiske oplysninger. I tilfælde af uoverensstemmelse blev opnået enighed ved konferencer. Andelene af positive celler (0 til +3) og farvningsintensiteter (0 til +3) blev vurderet separat ved en forstørrelse på x 200. Førstnævnte blev beregnet ved at tælle antallet af farvede tumorceller blandt det totale antal tumorceller, for eksempel når 25% af totale celler blev farvet, andelen nu var +1, og 50% svarer til +2, 75% svarer til +3, 0% svarer til 0. intensiteten scoring blev bedømt ved farven af ​​farvede tumor cellekernen, specifikt score 0 betyder akromatisk, +1 betyder rav, +2 betyder gul og +3 betyder brun. Kombineret scoring + 1~ + 2 blev defineret "negative", og + 3~ + 6 blev betragtet som "positive".

Plasmidkonstruktion og transfektion

To par hårnål små interfererende RNA (siRNA ) oligoer for RPL6 blev designet efter de siRNA design guidelines for TaKaRa Biotechnology Co., Ltd. Sammenligne målsekvenser til det menneskelige genom database i en BLAST søgning for at fjerne fra sine overvejelser enhver målsekvens med 21 basepar homologi støder op til andre sekvenser . For oligo-1, sense: 5'-GATCCGGAGAAGGTTCTCGCAACTTTCAAGAGAAGTTGCGAGAACCTTCTCCTTTTTTGGAAA-3 ', antisense: 5'AGCTTTTCCAAAAAAGGAGAAGGTTCTCGCAACTTCTCTTGAAAGTTGCGAGAACCTTCTCCG-3'; for oligo-2, sense: 5'-GATCCGTCGAGTTCCTCTACGAAGATTCAAGAGATCTTCGTAGAGGAACTCGATTTTTTGGAAA-3 ', antisense: 5'-AGCTTTTCCAAAAAATCGAGTTCCTCTACGAAGATCTCTTGAATCTTCGTAGAGGAACTCGACG-3'; En scramble DNA-duplex blev også designet som kontrol, for oligo-1, sense: 5'-GATCCGGTGAGATCTTCGACACAGTTCAAGAGACTGTGTCGAAGATCTCACCTTTTTTGGAAA-3 ', antisense: 5'-AGCTTTTCCAAAAAAGGTGAGATCTTCGACACAGTCTCTTGAACTG TGTCGAAGATCTCACCG-3'. Til annealing til dannelse af DNA-duplekser, 0,01 M hver af sense- og antisense-oligoer blev anvendt. De rækkehuse blev fortyndet og derefter ligeret med pSilencer3.1-H1 neo vektor (Takara Bioteknologi (Dalian) Co., Ltd). Produkterne blev transformeret ind DH5a-kompetente celler. Ampicillinresistente kolonier blev valgt, der er konstateret ved restriktionsspaltning, og yderligere bekræftet ved DNA-sekventering. Ifølge producentens instruktioner, blev siRNA plasmider af RPL6 transficeret ind SGC7901 celler under anvendelse af Lipofectamine 2000 reagens (Invitrogen, Carlsbad, CA), hhv. Fireogtyve timer efter transfektion blev G418 (400 ug /ml) tilsat til dyrkningsmediet til etablering af stabile kloner. De blandede kloner blev ekspanderet i yderligere 2 måneder. De SGC7901 og AGS celler (også kaldet forældrenes celler) stabilt udtrykker eksogene RPL6 blev navngivet som SGC7901-siRPL6-1, AGS-siRPL6-1, og SGC7901-siRPL6-2, AGS-siRPL6-2. Og celler transficeret med siControl blev navngivet som SGC7901-siRPL6 Styring og AGS-siRPL6 kontrol (også kaldet kontrol celler).

Cell proliferation assay

3- (4,5-dimethylthiazol-2- yl) -2,5-diphenyl-tetrazoliumbromid (MTT) assay blev udført for at vurdere virkningen af ​​RPL6 på celleproliferation som beskrevet tidligere [32]. Absorbansen ved 490 nm (A490) i hver brønd blev læst på en mikropladelæser BP800 (Biohit, Helsinki, Finland). Hvert forsøg blev udført i firdobbelte og blev gentaget 3 gange.

blød agar-kolonidannelse assays

blød agar-kolonidannelse assay blev anvendt til at bestemme forankringsuafhængig potentiale cellevækst. Tolv brønde blev fyldt med 0,5 ml 0,5% ædelt agar (Invitrogen) i RPMI1640 tilsat 10% kalveserum som et bundlag og fik lov at størkne ved 4 ° C natten over. I alt 200 celler blev suspenderet i 0,25 ml 0,3% agarose og podet på bunden agar. Celledyrkningspladerne blev opretholdt i 2 uger i en CO _{2 incubator. Antallet af kolonier blev talt under et mikroskop.}

tumorgenicitet for nøgne mus

Tumor dannelse blev udført for at vurdere virkningerne af RPL6 på tumorigenicitet in vivo. BALB /c nøgne mus af 4 til 6 uger blev leveret af Shanghai Cancer Institute og huset i mikro-isolator bure under positivt lufttryk, og holdt ved en konstant temperatur (22 ° C) og fugtighed for tumorigenicitet undersøgelse. Ca. 3 x 10 ^{6 celler ved logaritmisk fase blev opsamlet og injiceret subkutant i den øvre ryg af BALB /c nøgne mus. Mindst tre nøgne mus blev anvendt til hver gruppe. Musene blev aflivet 4 uger senere og tumorvægt af hver mus blev evalueret. Alle procedurer for dyreforsøg blev udført i overensstemmelse med de institutionelle Animal Care og brug Udvalg retningslinjer for Experiment Animal centrum af den fjerde Military Medical University.}

Cell cyklus analyse

Til analyse af cellecyklus fasefordeling, SGC7901 og dens varianter i log-fase blev høstet og vasket to gange med iskold PBS. Cellepellets blev fikseret i 70% ethanol, behandlet med RNase A (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN) og farvet med propidiumiodid (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO).

• PLoS ONE: DNA Repair Gene APE1 T1349G Polymorfi og Risiko for Gastric Cancer i en kinesisk Befolkning
• PLoS ONE: Tab af promyelocytleukæmi Protein i Gastric Cancer: Konsekvenser for IP-10 Expression og tumorinfiltrerende Lymphocytes