PLOS ONE: La régulation négative de RPL6 par siRNA inhibe la prolifération et la progression du cycle cellulaire de la cellule cancer gastrique humain Lines

Résumé

Notre précédente étude a révélé que la protéine ribosomique humaine L6 (RPL6) était régulée à la hausse dans multirésistante les cellules de cancer gastrique et surexpression de RPL6 pourraient protéger le cancer gastrique de l'apoptose induite par le médicament. Il a également été démontré que la régulation des RPL6 croissance accélérée et améliorée en formant des colonies vitro capacité des cellules GES tout en bas-régulation de RPL6 présentait les résultats opposés. La présente étude a été conçue pour étudier le rôle potentiel de RPL6 dans le traitement du cancer gastrique pour la clinique. L'expression de la cycline E RPL6 et dans les tissus de cancer gastrique et de la muqueuse gastrique normale a été évaluée par immunohistochimie. On a constaté que RPL6 et la cycline E ont été exprimés à un niveau plus élevé dans les tissus du cancer de l'estomac que celle de la muqueuse gastrique normale et les deux étaient corrélative dans le cancer gastrique. Le temps de survie des patients post-opératoires a été analysé par une analyse de Kaplan-Meier et il a été constaté que les patients atteints de RPL6 expression positive ont montré plus court temps de survie que les patients qu'avec RPL6 expression négative. RPL6 a ensuite été génétiquement régulée à la baisse dans SGC7901 de cancer gastrique et AGS lignées cellulaires par siRNA. Il a été démontré que la régulation négative de RPL6 réduit la capacité de formation de colonies de cellules de cancer gastrique in vitro et réduit la croissance des cellules in vivo. En outre, la régulation des RPL6 pourrait supprimer G1 à S transition de phase dans ces cellules. En outre, nous avons mis en évidence que RPL6 siRNA régulée à la baisse de la cycline E expression dans les cellules SGC7901 et AGS. Pris ensemble, ces données suggèrent que RPL6 était surexprimé dans les tissus gastriques humains et causé un mauvais pronostic. La régulation des RPL6 pourrait supprimer la croissance cellulaire et la progression du cycle cellulaire au moins à travers la régulation négative de la cycline E et qui pourrait être utilisé comme une nouvelle approche pour le traitement du cancer gastrique

Citation:. Wu Q, Gou Y, Wang Q, Jin H, Cui L, Zhang Y, et al. (2011) La régulation négative de RPL6 par siRNA inhibe la prolifération et la progression du cycle cellulaire des lignées cellulaires de cancer gastrique humain. PLoS ONE 6 (10): e26401. doi: 10.1371 /journal.pone.0026401

Editeur: Xin-yuan Guan, l'Université de Hong Kong, la Chine

Reçu: 7 Août 2011; Accepté le 26 Septembre 2011; Publié le 17 Octobre, 2011

Droit d'auteur: © 2011 Wu et al. Ceci est un article en accès libre distribué sous les termes de la licence Creative Commons Attribution, qui permet une utilisation sans restriction, la distribution et la reproduction sur tout support, à condition que l'auteur et la source originelle sont crédités

Financement:. Cette étude a été soutenu en partie par des subventions du Programme national de recherche de base de la Chine (n ° 2010CB732400, n ° 2010CB529300), et la national Natural science Foundation de Chine (n ° 30801349). Les bailleurs de fonds ont joué aucun rôle dans la conception de l'étude, la collecte et l'analyse des données, la décision de publier, ou de la préparation du manuscrit

Intérêts concurrents:.. Les auteurs ont déclaré aucun conflit d'intérêts existent

Introduction

le cancer gastrique, avec une haute moralité, était l'un des cancers les plus malignes dans les pays asiatiques. Sa présence a été un processus avec de multiples facteurs et en plusieurs étapes, impliqués dans les altérations de nombreuses molécules, y compris l'activation de proto-oncogènes, l'inactivation des gènes suppresseurs de tumeur, des altérations dans les protéines associées au cycle cellulaire et ainsi de suite. Dans la dernière décennie, un grand nombre de proto-oncogènes et gènes suppresseurs de tumeur ont été trouvés. Malgré le nombre important de gènes déjà décrits, de nouveaux gènes ayant des activités potentielles ou tumorales supprimant oncogènes sont encore en cours d'identification. Cependant, le mécanisme moléculaire de la carcinogenèse gastrique reste incertaine.

ribosome est essentiel pour la synthèse des protéines dans toutes les cellules, qui est constitué d'ARN ribosomique (ARNr) et les protéines ribosomiques (RPS). De nombreux RPs jouent également des rôles différents qui sont indépendants de la biosynthèse des protéines, qui est appelée fonction extra-ribosomique [1]. L'augmentation de plus de recherche a démontré que les troubles de la traduction des protéines a participé à la tumorigenèse et de nombreuses protéines ribosomiques étaient dysfonctionnels dans les tumeurs, mais les mécanismes sont encore inconnus [2]. Il a été proposé que plusieurs RPs agissent comme suppresseurs de tumeurs haploinsuffisant dans les gènes de poissons et de nombreux RPS pourrait aussi être oncogènes en nature humaine [3]. Le premier rapport sur les relations entre les PR et les tumeurs a été publiée dans 90 s de la 20 ^{e siècle, qui a démontré l'association de RPS19 avec la progression du carcinome du côlon et la différenciation [4] .Thereafter, de plus en plus RPs ont été trouvés dysfonctionnel dans les tumeurs comme une expression élevée de RPL19 dans les tumeurs du sein [5], [7], PR marqueur de détection précoce surexpression de RPL7A et RPL37 dans des échantillons de tissus de la prostate, du cancer [6], une expression plus élevée de RPL15 dans le cancer de l'oesophage de épidermoïde humain le carcinome du col de l'utérus [8], et la surexpression de RPL36a associée à une prolifération cellulaire dans le cancer hépatocellulaire [9], et ainsi de suite. Rapports sur l'association de RPs avec cancérogenèse étaient encore en augmentation [2], [10]. Cependant, le rôle exact de RPs dans le développement de la tumeur sont diverses et doivent encore plus de précisions.}

Auparavant, nous avons analysé les profils d'ARNm d'une gastrique lignée cellulaire de cancer humain SGC7901 et son multirésistante variante SGC7901 /VCR par différentiel affichés PCR et hybridation soustractive suppressive [11], [12]. RPL6 a été identifiée comme l'un des gènes surexprimés dans SGC7901 /ADR par rapport à SGC7901, qui a été confirmé par RT-PCR et analyse par transfert de Northern [13]. Des études ultérieures ont montré que la régulation de RPL6 protégé les cellules cancéreuses gastriques de l'apoptose induite par l'adriamycine et amélioré la résistance des cellules de cancer gastrique à plusieurs médicaments chimiothérapeutiques, y compris la vincristine, l'adriamycine, etopside, le cisplatine et le 5-fludrouracil [13]. Ces données indiquent que RPL6 pourrait promouvoir les phénotypes malignes de cellules de cancer gastrique, ce qui nous a conduit à mener l'étude ultérieure d'explorer davantage le rôle exact de RPL6 dans la carcinogenèse et le développement du cancer gastrique. Ensuite, nous avons découvert que génétiquement la régulation des RPL6 dans les cellules GES pourrait accélérer la croissance et d'améliorer la capacité in vitro colonie formant des cellules GES tout en bas-régulation des RPL6 pourrait présenter des résultats opposés. En outre, la régulation positive de RPL6 pourrait favoriser la transition G1 à S en phase de cellules Ges. Une étude plus approfondie a démontré que RPL6 up-régulé cycline E expression dans les cellules GES [14]. Pris ensemble, ces données suggèrent que RPL6 pourrait promouvoir les phénotypes malignes de cellules de cancer gastrique et RPL6 pourrait jouer un rôle oncogène dans la tumorigenèse et le développement du cancer de l'estomac, ce qui nous a conduit à mener la présente étude pour explorer le rôle potentiel de RPL6 dans le gène le traitement du cancer gastrique et peut être utilisé comme une nouvelle approche pour le traitement du cancer gastrique.

RPL6 et cycline E expression de

Résultats des spécimens de cancer gastrique et tissus humains et non-néoplasiques adjacents appariés

Pour explorer les relations entre RPL6 et cycline E expression avec le développement du cancer de l'estomac, nous avons détecté RPL6 et cycline E expression dans les tissus de cancer gastrique et de tissus humains non néoplasiques adjacents appariés par coloration immunohistochimique. Les résultats ont montré que la cycline RPL6 et localisées près dans le cytoplasme et seulement occasionnellement dans les noyaux dans des cellules de cancer de l'estomac (Fig. 1A). Une analyse plus poussée a découvert que le rapport positif (y compris les spécimens qui maculait) de RPL6 était de 84% (46 sur 55 patients), tandis que le rapport positif de la cycline E était de 75% (41 sur 55 patients) dans des échantillons de cancer de l'estomac humain. Le rapport positif des deux RPL6 et la cycline E était de 70% (38 sur 55 patients) alors que le rapport négatif (y compris les spécimens qui ne tache) des deux RPL6 et la cycline E était de 11% (6 de 55 patients) dans des échantillons de cancer gastrique humains . Le rapport positif des deux RPL6 et la cycline E était de 18% (8 sur 55 patients) dans les tissus non-néoplasiques adjacentes appariées (données non présentées). En ce qui concerne les différences entre l'expression de RPL6 et d'expression cycline dans les échantillons de cancer de l'estomac de l'homme, il n'y avait pas de différence. La présente étude a démontré que RPL6 et cycline E expressions dans des échantillons de cancer gastrique humains étaient relative (figure 1B, p. ≪ 0,05), ce qui peut jouer un rôle de con-généreux dans le développement du cancer gastrique et RPL6 et la cycline E peut servir biomarqueur pour le diagnostic du cancer gastrique et un gène cible pour la thérapie du cancer gastrique. À la fin du suivi, le temps de survie des patients ont été analysés par la méthode de Kaplan-Meier et les résultats ont révélé que durant les patients qui ont été suivis, les patients atteints à la fois RPL6 positif et cycline E positifs ont montré une durée de survie plus courte et moins bon pronostic que ceux à la fois avec RPL6 négatif et cycline E expression négative, ou ceux avec expression positive cycline RPL6 positive et cycline E ou négative avec RPL6 négative et respectivement (figure 2 A, p. < 0,01), ce qui peut être révélé que les patients atteints à la fois RPL6 positive et cycline E positif a montré un mauvais pronostic. Il est également démontré que les patients atteints de RPL6 expression négative ont montré plus de temps de survie que RPL6 positives (figure 2B, p. ≪ 0,01), et les patients avec la cycline E expression positive a montré un mauvais pronostic (figure 2C, p <. 0,01). Par conséquent, une conclusion peut être tirée que RPL6 peut servir en tant que biomarqueur pour évaluer le pronostic des patients atteints de cancer gastrique.

Expression de RPL6 dans des lignées cellulaires de cancer gastrique et de ses dérivés

Pour explorer davantage la RPL6 rôle potentiel de la thérapie génique du cancer de l'estomac, des cellules AGS et SGC7901 ont été transfectées avec l'ARNsi spécifique à RPL6 et le pool mixte de variants de cellules résistantes à G418 a été produite. Les variantes résistantes au G418 hébergeant siRNA spécifiques RPL6 ont donc été nommés comme SGC7901-siRPL6-1, AGS-siRPL6-1 et SGC7901-siRPL6-2, AGS-siRPL6-2. Les cellules résistantes à G418 hébergeant des plasmides d'embrouillage ARNsi ont été conçues comme SGC7901-siControl et AGS siControl respectivement. Comme le montre la figure 3A, l'expression de RPL6 était significativement régulée à la baisse dans SGC7901-siRPL6-1, AGS-siRPL6-1 et SGC7901-siRPL6-2, les cellules AGS-siRPL6-2 par rapport aux cellules parentales et les cellules témoins. Dans la présente étude, SGC7901-siRPL6-2 et AGS-siRPL6-2 ont montré des résultats inhibiteurs plus efficaces, ce qui indique que les cellules SGC7901-siRPL6-2 et AGS-siRPL6-2 pourrait être utilisé comme un modèle cellulaire bon pour clarifier le potentiel rôle de RPL6 en thérapie génique du cancer gastrique pour la clinique.

la régulation négative de RPL6 supprimer la croissance des cellules du cancer gastrique in vitro

pour étudier si la régulation de l'expression des RPL6 pourrait inhiber la croissance des SGC7901 et les cellules AGS, les cellules parentales, les cellules de contrôle et leurs variantes ont été ensemencées dans des plaques de culture et leur croissance a été surveillée tous les jours avec un test MTT. Comme indiqué par les courbes de croissance de la figure 3B, le contrôle (SGC7901-siControl et AGS-siControl) cellules ont montré respectivement un taux de croissance similaire à parentale (SGC7901 et AGS) des cellules, tandis que SGC7901-siRPL6-1, AGS-siRPL6-1 et SGC7901 cellules -siRPL6-2, AGS-siRPL6-2 présentaient le taux de croissance plus faible que les cellules de contrôle, et SGC7901-siRPL6-2, les cellules AGS-siRPL6-2 ont montré le plus faible taux de croissance (Fig 3B, p. < 0,05). La croissance indépendante de l'ancrage de ces cellules a également été analysée par dosage de formation de colonies sur gélose molle. Il a été révélé que SGC7901-siRPL6-1, AGS et siRPL6-1 SGC7901-siRPL6-2, les cellules AGS siRPL6-2 produisent des colonies de cellules beaucoup moins dans la gélose molle que leurs cellules parentales et des cellules témoins (figure 3C, p <. 0,05), des cellules nommées avec SGC7901-siRPL6-2 et AGS-siRPL6-2 produit le moins de colonies. Ces données suggèrent que la régulation négative de RPL6 pourrait supprimer la croissance des cellules du cancer gastrique et inhibent la capacité de formation de colonies de cellules SGC7901 et AGS.

RPL6 ARNsi tumorigenèse inhibée de cellules de cancer gastrique in vivo

Pour confirment encore les effets de RPL6 sur la tumorigenèse du cancer gastrique, le dosage de la formation des tumeurs a été réalisée chez des souris nues. SGC7901, AGS et SGC7901-siRPL-2, les cellules AGS-siRPL6-2 sous-cutanée inoculés dans le droite ou à gauche du haut du dos de souris nude athymiques sur un seul site. (Fig. 4A et C) Quatre semaines plus tard, les souris ont été tuées et les tumeurs transplantées ont été excisées et les tailles des tumeurs ont été évaluées (figure 4B et D, p. ≪ 0,05). Il y avait une diminution significative de la taille des xénogreffes dans RPL6 cellules régulé à la baisse. Ces données indiquent que le knock-down de RPL6 pourrait supprimer gastrique tumorigenèse des cellules cancéreuses in vivo et RPL6 peut jouer un rôle clé dans la promotion de la croissance maligne des cellules de cancer gastrique in vivo.

RPL6 décéléré G1-S phase de transition SGC7901 cellules

Pour découvrir les mécanismes qui sous-tendent le rôle de suppresseur RPL6 dans la croissance des cellules du cancer gastrique, les effets de RPL6 sur la distribution du cycle cellulaire des cellules ont été analysées SGC7901 (Fig. 5A). Comme cela est représenté sur la figure 5B, les cellules SGC7901-siRPL6-1 ont montré légèrement augmenté le pourcentage de la phase G1 et une diminution du pourcentage de la phase S, tandis que les cellules SGC7901-siRPL6-2 affichées ont augmenté de manière significative le pourcentage de la phase G1 et une diminution du pourcentage de la phase S (P < 0,05 ) par rapport aux cellules parentales et des cellules de contrôle. Ceux-ci ont indiqué que siRNA RPL6 spécifique pourrait ralentir la transition G1-S de SGC7901 cellules.

RPL6 régulée à la baisse l'expression de la cycline E dans des cellules de cancer gastrique au niveau de la protéine

Il est bien connu que la progression G1-S est contrôlée par des complexes E /CDK2 cycline D /CDK4 et cycline, qui sont régis par les membres de la famille INK4, p21 et p27, respectivement. L'expression de ces régulateurs dans les cellules AGS et SGC7901 et ses variantes ont été déterminées par analyse par Western Blot. Comme cela est indiqué sur la figure 6, l'expression de la cycline E est significativement régulée à la baisse dans SGC7901-siRPL6-2 et les cellules AGS siRPL6-2. Expressions de CDK2, p16, p21 et p27 sont restés inchangés dans les variantes de cellules SGC7901 et AGS. Ces données suggèrent que la régulation négative de RPL6 a diminué l'expression de la cycline E dans des cellules SGC7901 et AGS, ce qui pourrait définir le rôle potentiel de RPL6 et de la cycline E dans le développement du cancer gastrique et RPL6 peut servir de cible génique pour le cancer gastrique la clinique.

Discussion

la présente étude a démontré que RPL6 et la cycline E ont été surexprimé dans les tissus de cancer gastrique et il existe une corrélation positive entre eux dans les tissus de cancer gastrique. Le suivi des résultats ont révélé que les patients atteints de RPL6 expression négative ont montré plus de temps de survie que ceux avec expression positive RPL6, ce qui suggère que les patients positifs RPL6 ont montré un mauvais pronostic. Des recherches plus poussées ont démontré que la régulation négative de RPL6 par RPL6 spécifique siARN inhibe la croissance de la prolifération et indépendante de l'ancrage des lignées cellulaires de cancer gastrique in vitro, réprime la progression du cycle cellulaire et supprime la cycline E expression, en outre, knockdown de RPL6 par l'ARNsi spécifique à RPL6 suppression tumorale capacité de formation de cellules de cancer gastrique in vivo.

dans notre précédente étude, les gènes différentiellement exprimés associés à la multirésistance aux médicaments des cellules cancéreuses gastriques ont été isolés en utilisant la présentation différentielle par RT-PCR et l'hybridation soustractive [11], [ ,,,0],12]. RPL6, un composant de la grande sous-unité de ribosome, a ainsi été isolé comme un clone surexprimés dans les cellules cancéreuses gastriques multirésistantes [11]. Il a été démontré que RPL6 pouvait protéger les cellules de cancer gastrique à partir chimiothérapeutique l'apoptose induite par des médicaments [13]. Ces données suggèrent que RPL6 pourrait impliquer dans la régulation du phénotype malin du cancer gastrique. Une étude plus poussée a été conçu pour explorer le rôle de RPL6 dans la tumorigenèse et le développement du cancer de l'estomac, et les résultats suggère que la régulation de la croissance accélérée RPL6 et colonie vitro aptitude à la formation de cellules GES alors que la régulation des RPL6 présentait des résultats opposés. En outre, la régulation de RPL6 accélérée G1 à S transition de phase de cellules GES au moins à travers la régulation de la cycline E expression tout régulation négative de RPL6 a montré des résultats opposés [14]. Pris ensemble, ces données suggèrent que RPL6 pourrait jouer un rôle oncogène dans la tumorigenèse et le développement du cancer de l'estomac et pourrait servir comme une nouvelle approche pour la thérapie génique du cancer gastrique.

De nos jours, de plus en plus plus de patients sont morts du cancer en raison de les phénotypes malins d'entre eux. Le traitement du cancer perturbé personnes dans le monde. En plus de la chimiothérapie et la chirurgie, la thérapie génique est un nouveau traitement du cancer et prometteur. L'une des méthodes les plus couramment utilisées pour la thérapie génique est l'interférence ARN (ARNi). L'ARNi, un mécanisme de silençage génique hautement conservée joue un rôle important dans la régulation de l'expression génique. Gene silencing par un mécanisme post-transcriptionnel impliquant l'ARN double brin homologue a été découvert dans des systèmes artificiels où l'ARN double brin (ARNdb) a été introduit par injection ou par l'expression de constructions transgéniques. Ce phénomène se produit par petits ARN interférents (ARNsi) dans le cytoplasme des cellules de mammifères. Dans la technologie siRNA, deux mécanismes de prestation ont été considérés, la livraison directe de synthèse nucléotidique de siRNA et l'introduction d'un ADN plasmidique (ADNp) codant pour une construction en épingle à cheveux (shRNA) qui serait dégradé par voie enzymatique en siRNA [15]. ARNi a joué ses rôles inhibitrices en faisant correspondre avec les séquences d'ARNm et inhibe l'expression de l'ARNm en conséquence et de la traduction, et a travaillé comme régulation négative. De nos jours, de plus en plus de scientifiques ont découvert que renversé l'expression des gènes par siRNA pourrait supprimer de manière significative la croissance tumorale et les métastases. inhibiteur de X-linked de protéines de l'apoptose (XIAP), un membre important des inhibiteurs de la protéine de l'apoptose (IAP) famille, est impliqué dans le contrôle de la division cellulaire, la prolifération cellulaire et l'inhibition de l'apoptose [16], [17]. La régulation négative de la protéine XIAP par l'ARNsi peut supprimer de manière significative la prolifération des cellules tumorales et de sensibiliser des cellules tumorales aux agents chimiothérapeutiques [18], [19]. L'ostéopontine (OPN) protéine qui a été surexprimée dans la majorité des patients atteints d'un cancer gastrique et associé à sa pathogénie, a joué un rôle important dans la prolifération, l'invasion, la métastase et la survie du cancer gastrique [20]. Ensuite, la régulation négative de l'OPN par l'ARNsi spécifique à l'OPN a inhibé significativement la croissance, la migration et l'invasion des cellules cancéreuses gastriques [21]. CML66, un antigène tumoral roman qui a joué un rôle oncogénique, était surexprimé dans la majorité des lignées cellulaires du cancer et des cancers [22], abattre son expression par CMl66 spécifique siRNA prolifération inhibé de manière significative, l'invasion et la métastase des cellules HeLa à la fois dans vivo et in vitro [23]. FABP5, qui code pour un acide gras cutané de la protéine de liaison (C-FABP), est régulée à la hausse dans le cancer de la prostate et agit comme un oncogene putatif. La régulation négative de FABP5 par l'ARNsi inhibe efficacement la croissance des cellules du cancer de la prostate-spécifique FABP5 chez la souris nude [24]. En outre, lorsque ribosomique RPS13 protéine qui a amélioré la lignée cellulaire de cancer gastrique croissance SGC7901 a été renversé par l'ARNsi, il croissance cellulaire SGC7901 a inhibé significativement spécifique à RPS13 et une colonie formabilité in vitro et supprimé la capacité de formation de tumeurs chez la souris nude [25]. Une recherche antérieure a également constaté que l'administration systémique de siRNA via atélocollagène, qui cible spécifiquement les tumeurs, est sûr et faisable pour le traitement du cancer dans le cancer de la prostate [26]. Par conséquent, les données ci-dessus suggère que siRNA, en inhibant l'expression du gène pourrait être une nouvelle approche pour le traitement du cancer et de faire de la thérapie génique du cancer possible pour le traitement clinique.

Dans la présente étude, les expressions de RPL6 et cycline E dans l'estomac les tissus cancéreux et les tissus non néoplasiques adjacentes appariées ont été détectés et les résultats indiquent que RPL6 et la cycline E ont présenté une expression élevée dans les tissus du cancer de l'estomac que dans les tissus non néoplasiques adjacents appariés. En outre, il existe une corrélation entre les RPL6 et la cycline E expression dans les tissus de cancer gastrique, ce qui suggère qu'ils peuvent jouer un rôle de con-généreux dans le développement du cancer gastrique et RPL6 pourraient servir de biomarqueur pour le diagnostic du cancer de l'estomac. Le suivi des résultats ont démontré que les patients avec les deux expressions positives positives et cycline E RPL6 ont montré un temps de survie plus courte et moins bon pronostic que le contrôle correspondant et ont également indiqué que les patients atteints de RPL6 expression négative ont montré plus de temps de survie et de meilleur pronostic que les patients atteints de RPL6 expression positive, qui a suggéré que RPL6 peut servir en tant que biomarqueur pour le pronostic de cancer de l'estomac et une cible génique pour le traitement du cancer gastrique dans la clinique.

pour explorer davantage la faisabilité potentielle de RPL6 comme cible de thérapie génique du cancer gastrique dans la clinique, nous avons frappé vers le bas l'expression de RPL6 dans les cellules AGS et SGC7901 par RPL6 spécifiques à l'ARNsi, les résultats ont montré que la régulation négative de RPL6 dans des lignées cellulaires parentales de cancer gastrique (SGC7901 et AGS) la croissance des cellules et inhibe efficacement dans des colonies in vitro formabilité. En outre, l'analyse du cycle cellulaire a indiqué que la régulation négative de RPL6 décéléré G1 à la phase S des cellules cancéreuses gastriques. L'analyse Western blot a montré que RPL6 inhibe la progression du cycle cellulaire par régulation vers le bas de la cycline E. tumorales expériences de formation dans des souris nues a suggéré que la régulation négative de RPL6 pourrait supprimer la formation de tumeurs in vivo.

cycline E, une cellule clé protéine de cycle qui a joué un rôle clé dans la transition G1-S était en désordre dans de nombreuses tumeurs différentes [27], [28], [29], [30], [31]. Des recherches antérieures ont démontré que la cycline E est une molécule importante dans la tumorigenèse. Dans la présente étude, nous avons découvert que la cycline E expression, ainsi que RPL6 était plus élevé dans les tissus cancéreux gastriques humaines que celle dans les tissus non néoplasiques adjacents appariés, ce qui suggère le rôle de la cycline E joué dans le développement du cancer gastrique. Des recherches plus poussées ont démontré que RPL6 affecté la croissance des cellules par régulation de la cycline E, ce qui montre que la forte expression de la cycline E est accéléré la croissance des cellules tandis qu'une faible expression de la cycline E décéléré la prolifération cellulaire. Cycline E et RPL6 peuvent jouer un rôle de con-généreux dans le développement du cancer gastrique

En conclusion., La présente étude a démontré que RPL6 et cycline expression étaient associés les uns aux autres dans les tissus de cancer gastrique et ils pourraient jouer con- généreux des rôles dans le développement du cancer gastrique, ce qui suggère que RPL6 peut utiliser comme outil de diagnostic dans le cancer gastrique. Suivi analyse des données a montré que les patients atteints de RPL6 expression négative ont montré plus de temps de survie et de meilleur pronostic que les patients atteints de RPL6 expression positive postopératoires, qui a suggéré que RPL6 servi en tant que biomarqueur pour le pronostic de cancer gastrique et un gène cible nouvelle pour le traitement du cancer gastrique. Une étude plus poussée a indiqué que la régulation négative de l'expression de RPL6 par RPL6 spécifique siARN inhibe SGC7901 la croissance cellulaire in vitro et la capacité de formation de colonies, décéléré SGC7901 cellule transition G1 à S de phase, et supprime la formation de tumeurs in vivo. En conclusion, notre étude a confirmé que RPL6 siRNA pourrait être utilisé comme une nouvelle approche pour le traitement du cancer gastrique clinique.

Ethique Déclaration
Matériels et méthodes

Pour les échantillons de tissus , tous les patients ont été informés consentement à l'utilisation en excès spécimens pathologiques à des fins de recherche. Les protocoles utilisés dans cette étude ont été approuvés par la protection des sujets humains Comité de l'hôpital. L'utilisation de tissus humains a été approuvé par le comité d'examen institutionnel de la quatrième université médicale militaire et a été conforme à la Déclaration d'Helsinki et à la législation locale. Les patients qui offrent des échantillons pour l'étude ont signé des formulaires de consentement éclairé. Pour la recherche animale, toutes les procédures d'expérimentation animale ont été réalisées conformément aux lignes directrices Institutional Animal Care et l'utilisation du Comité du centre expérimentation animale de la quatrième université médicale militaire. L'ID d'approbation pour l'utilisation des animaux a été n ° 10218 par Experiment Animal Center de la quatrième université médicale militaire.

Les échantillons de tissus et de lignées cellulaires

Les spécimens de tissus intégrés avec de la paraffine ont été recueillies à partir de 55 patients atteints de cancer de l'estomac qui a subi une gastrectomie dans notre hôpital entre 2004 et 2009. Tous les cas de cancer de l'estomac et des tissus non tumoraux adjacents ont été diagnostiqués cliniquement et pathologiquement. Les données sur les caractéristiques clinicopathologiques et les pronostics des patients ont été recueillies et analysées rétrospectivement. Un total de 55 patients ont été suivis jusqu'à la fin de l'année 2009 et deux d'entre eux ont été perdus au cours de la période de suivi. lignée cellulaire d'adénocarcinome gastrique humain SGC7901 a été obtenu à partir de l'Académie des sciences militaires médicale, AGS a été obtenu à partir de la banque de cellules de Shanghai (Shanghai, Chine). Les deux lignées cellulaires ont été conservées dans notre institut. Toutes les lignées cellulaires ont été maintenues dans du RPMI 1640 (Invitrogen, Carlsbad, CA) complété avec 10% de sérum de veau foetal inactivé par la chaleur (FCS) à 37 ° C avec 5% de CO _{2 dans un incubateur humidifié (Forma Scientific, Marietta, OH).}

immunohistochimie et immunohistochimique notation

déparaffinées et réhydratées sections ont été lavées à l'eau douce pendant 10 minutes. démasquage des antigènes induite par la chaleur a été réalisée pendant 20 minutes à 95 ° C avec du tampon de citrate de sodium 10 mM (pH 6,0). Une fois que les lames ont été refroidies à la température ambiante pendant 40 minutes, ils ont été bloqués à 3% de peroxyde d'hydrogène pendant 20 minutes, puis dans un liquide de confinement de sérum de chèvre normal pendant 40 minutes. Après cela, ils ont été autorisés à réagir pendant la nuit à 4 ° C avec des anticorps primaires pour IgG, RPL6 et cycline (Santa Cruz). Après le réchauffement pendant 40 minutes, ils sont ensuite amenés à réagir avec des seconds anticorps (Zhongshan Goldenbridge Biotechnology CO.LTD) pendant 40 minutes à la température ambiante. Ensuite, les produits ont été développés avec 3,3'-diaminobenzidine et de contraste avec l'hématoxyline. La cotation a été complétée par un pathologiste spécialisé et un scientifique qui ont été aveuglés à l'information clinique et pathologique. En cas de divergence, un consensus a été atteint par la conférence. Les proportions de cellules positives (0 à 3) et les intensités de coloration (0 à 3) ont été évalués séparément, à un grossissement de 200 x. L'ancien a été calculé en comptant le nombre de cellules tumorales colorées parmi le nombre total de cellules tumorales, par exemple, lorsque 25% des cellules totales ont été colorées, le score de proportion était +1, et 50% est égale à +2, 75% égaux à +3, 0% est égal à 0. le score d'intensité a été évaluée par la couleur du vitrail noyau de la cellule tumorale, en particulier, le score 0 signifie achromatique, +1 signifie ambre, +2 signifie jaune, et +3 signifie brun. score combiné + 1~ + 2 ont été définis "négative", et + 3~ + 6 ont été considérés comme «positif».

Construction de plasmide et transfection

Deux paires de épingle à cheveux petits ARN interférents (siRNA ) oligos pour RPL6 ont été conçus selon les directives de conception de siRNA de TaKaRa Biotechnology Co., Ltd. Comparer séquences cibles à la base de données du génome humain dans une recherche BLAST à éliminer de considération toute séquence cible avec 21 paires de bases d'homologie contiguë à d'autres séquences codantes . Pour les oligo-1, sens 5'-GATCCGGAGAAGGTTCTCGCAACTTTCAAGAGAAGTTGCGAGAACCTTCTCCTTTTTTGGAAA-3 ', antisens: 5'AGCTTTTCCAAAAAAGGAGAAGGTTCTCGCAACTTCTCTTGAAAGTTGCGAGAACCTTCTCCG-3'; pour les oligo-2, sens: 5'-GATCCGTCGAGTTCCTCTACGAAGATTCAAGAGATCTTCGTAGAGGAACTCGATTTTTTGGAAA-3 ', antisens: 5'-AGCTTTTCCAAAAAATCGAGTTCCTCTACGAAGATCTCTTGAATCTTCGTAGAGGAACTCGACG-3'; Un duplex d'ADN d'embrouillage a également été conçu en tant que témoin pour l'oligo-1, sens 5'-GATCCGGTGAGATCTTCGACACAGTTCAAGAGACTGTGTCGAAGATCTCACCTTTTTTGGAAA-3 ', antisens: 5'-AGCTTTTCCAAAAAAGGTGAGATCTTCGACACAGTCTCTTGAACTG TGTCGAAGATCTCACCG-3'. Pour recuit pour former des duplex d'ADN, 0,01 M chacun des sens et antisens oligos ont été utilisés. Les duplex ont été dilués et ensuite ligués avec pSilencer3.1-H1 vecteur néo (Takara Biotechnology (Dalian) Co., Ltd). Les produits ont été transformés dans des cellules DH5a-compétentes. les colonies résistantes à l'ampicilline ont été sélectionnés, identifiés par digestion de restriction et confirmé par séquençage d'ADN. Selon les instructions du fabricant, des plasmides siARN de RPL6 ont été transfectées dans SGC7901 cellules en utilisant Lipofectamine 2000 réactif (Invitrogen, Carlsbad, CA), respectivement. Vingt-quatre heures après la transfection, G418 (400 pg /ml) ont été ajoutés dans le milieu de culture pour établir des clones stables. Les clones mixtes ont été élargis pendant 2 mois. Les cellules SGC7901 et AGS (également appelées cellules parentales) exprimant de manière stable RPL6 exogène ont été désignés comme SGC7901-siRPL6-1, AGS-siRPL6-1 et SGC7901-siRPL6-2, AGS-siRPL6-2. Et les cellules transfectées avec siControl ont été désignés comme SGC7901-siRPL6 Control et AGS-siRPL6 (également appelées cellules de contrôle)

La prolifération cellulaire test

3- (4,5-diméthylthiazol-2-. yl) -2,5-diphényl-tétrazolium, le bromure de (MTT) a été réalisée pour évaluer l'effet de RPL6 sur la prolifération cellulaire comme décrit précédemment [32]. L'absorbance à 490 nm (A490) de chaque puits a été lue sur un BP800 de lecteur de microplaques (Biohit, Helsinki, Finlande). Chaque expérience a été réalisée en quatre exemplaires et a été répété 3 fois.

gélose molle dosages de formation de colonies

test de formation de colonies sur gélose molle a été utilisé pour déterminer le potentiel de croissance cellulaire indépendante de l'ancrage. Douze plaques à puits ont été remplis avec 0,5 ml de 0,5% d'agar noble (Invitrogen) dans du RPMI 1640 supplémenté avec du sérum de veau 10% sous forme d'une couche de fond et on laisse se solidifier à 4 ° C pendant une nuit. Un total de 200 cellules en suspension dans 0,25 ml de 0,3% d'agarose et ensemencée sur la gélose au fond. plaques de culture cellulaire ont été maintenues pendant 2 semaines dans un CO _{2 incubateur. Le nombre de colonies a été compté sous un microscope.}

tumorigène chez la souris nude

formation tumorale a été réalisée afin d'évaluer les effets de RPL6 sur tumorigénicité in vivo. BALB /c souris nude de 4 à 6 semaines ont été fournies par l'Institut du cancer de Shanghai et logés dans des cages micro-isolateurs sous pression d'air positive, et maintenue à une température constante (22 ° C) et l'humidité pour l'étude de la tumorigénicité. Environ 3 x 10 ^{6 cellules à la phase log ont été recueillies et injection sous-cutanée dans la partie supérieure du dos /c souris nues BALB. Au moins trois souris nues ont été utilisées pour chaque groupe. Les souris ont été sacrifiées 4 semaines plus tard et le poids de la tumeur de chaque souris a été évaluée. Toutes les procédures d'expérimentation animale ont été réalisées conformément aux lignes directrices Institutional Animal Care et l'utilisation du Comité du centre expérimentation animale de la quatrième université médicale militaire.}

Cycle cellulaire analyse

Pour l'analyse du cycle cellulaire la distribution de phase, et ses variantes SGC7901 à la phase log ont été récoltées et lavées deux fois avec du PBS glacé. Les culots cellulaires ont été fixés dans 70% d'éthanol, traité avec de la RNase A (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN) et colorées avec de l'iodure de propidium (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO).

• PLOS ONE: La réparation de l'ADN Gene APE1 T1349G Polymorphisme et risque de cancer gastrique dans une population chinoise
• PLOS ONE: Perte de la protéine leucémie promyélocytaire dans le cancer gastrique: Implications pour IP-10 Expression et infiltrant les tumeurs Lymphocytes