PLoS ONE: negatieve regulatie van RPL6 door siRNA Remt proliferatie en voortgang van de celcyclus van Human Gastric Cancer Cell Lines

Abstract

Onze eerdere studie bleek dat de menselijke ribosomale eiwit L6 (RPL6) werd up-gereguleerd in multiresistente maagkanker cellen en overexpressie van RPL6 kan maagkanker tegen drugs geïnduceerde apoptose. Verder werd aangetoond dat up-regulatie van RPL6 versnelde groei en verbeterde in vitro kolonievormende vermogen van GES cellen, terwijl down-regulatie van RPL6 tentoongesteld het tegenovergestelde resultaat. Deze studie werd ontworpen om de potentiële rol van RPL6 bij therapie van maagkanker kliniek voor onderzoeken. De expressie van RPL6 en cycline E bij maagkanker weefsels en normale maagslijmvlies werd beoordeeld door immunohistochemisty. Het bleek dat RPL6 en cycline E werden uitgedrukt op een hoger niveau maagkanker weefsels dan in normale maagslijmvlies en beide waren correlatieve bij maagkanker. Overlevingstijd van postoperatieve patiënten werd geanalyseerd door Kaplan-Meier-analyse en het werd gevonden dat patiënten met RPL6 positieve uitdrukking toonde een kortere overlevingstijd dan patiënten die met RPL6 negatieve expressie. RPL6 was toen genetisch down-gereguleerd bij maagkanker SGC7901 en AGS cellijnen door siRNA. Het is aangetoond dat neerwaartse regulatie van RPL6 verminderde kolonievormende vermogen van maagkanker cellen in vitro en verminderde celgroei in vivo. Bovendien kan neerwaartse regulatie van RPL6 G1 S faseovergang in deze cellen te onderdrukken. Verder hebben we aangetoond dat RPL6 siRNA down-gereguleerd cycline E expressie in SGC7901 en AGS-cellen. Tezamen suggereren deze gegevens dat RPL6 werd tot overexpressie gebracht in humane gastrische weefsels en veroorzaakt een slechte prognose. Neerwaartse regulatie van RPL6 kunnen celgroei en voortgang van de celcyclus in elk geval beneden reguleren van cycline E en die kunnen worden gebruikt als een nieuwe benadering voor de behandeling onderdrukken maagkanker

Citation:. Wu Q, Y Gou, Wang Q, Jin H, Cui L, Zhang Y, et al. (2011) negatieve regulatie van RPL6 door siRNA Remt proliferatie en voortgang van de celcyclus van menselijke maagkanker cellijnen. PLoS ONE 6 (10): e26401. doi: 10.1371 /journal.pone.0026401

Editor: Xin-yuan Guan, de Universiteit van Hong Kong, China

Ontvangen: 7 augustus 2011; Aanvaard: 26 september 2011; Gepubliceerd: 17 oktober 2011

Copyright: © 2011 Wu et al. Dit is een open-access artikel gedistribueerd onder de voorwaarden van de Creative Commons Attribution License, die onbeperkt gebruik, distributie en reproductie maakt in elk medium, op voorwaarde dat de oorspronkelijke auteur en de bron worden gecrediteerd

Financiering:. Deze studie werd mede ondersteund door subsidies van de Nationale Basic Research Program van China (nr 2010CB732400, No. 2010CB529300) en de National Natural Science Foundation of China (nr 30801349). De financiers hadden geen rol in de studie design, het verzamelen van gegevens en analyse, besluit te publiceren, of de voorbereiding van het manuscript

Competing belangen:.. De auteurs hebben verklaard dat er geen tegenstrijdige belangen bestaan ​​

Introductie

Maagkanker, met een hoge moraal, was een van de meest kwaadaardige vormen van kanker in de Aziatische landen. Het geval zich een proces met meerdere factoren en meerdere stappen, die deze veranderingen in vele moleculen, waaronder activering van proto-oncogenen, inactivatie van tumor-suppressor genen, wijzigingen in de celcyclus verwante proteïnen enzovoort. In de afgelopen tien jaar, hebben een groot aantal van de proto-oncogenen en tumor-suppressor genen gevonden. Ondanks het aanzienlijke aantal reeds beschreven genen worden nieuwe genen met oncogene potentiaal of tumor-onderdrukkende activiteiten nog worden geïdentificeerd. De moleculaire mechanisme van maagkanker blijft onduidelijk.

Ribosoom essentieel voor de eiwitsynthese in alle cellen, die is samengesteld uit ribosomaal RNA (rRNA) en ribosomale eiwitten (RPS). Veel RPs spelen ook verschillende rollen die onafhankelijk van eiwit biosynthese, die extra-ribosoom-functie [1] wordt genoemd zijn. Toenemende meer onderzoek aangetoond dat afwijking van de eiwittranslatie deel aan tumorvorming en vele ribosomale eiwitten waren disfunctioneel in tumoren, maar de mechanismen zijn nog onbekend [2]. Voorgesteld is dat veel RP fungeren als haploinsufficient tumor suppressors in vis en vele RPS genen zou ook oncogenen in mensheid [3]. De vroegste verslag over de relatie tussen RP en tumoren werd gepubliceerd in 90 s van de 20 ^{e eeuw, die de associatie van RPS19 met coloncarcinoom progressie en differentiatie aangetoond [4] .Thereafter, meer en meer RPS werden gevonden disfunctioneel in tumoren zoals hoge expressie van RPL19 in borsttumoren [5], overexpressie van RPL7a en RPL37 in monsters prostaatkanker weefsel [6], hogere expressie van RPL15 bij slokdarmkanker [7], RP reeds detectiemarker van humaan squameus carcinoom van de baarmoederhals [8], en overexpressie van RPL36a geassocieerd met celproliferatie in hepatocellulair carcinoom [9], enzovoort. Rapporten met betrekking tot de associatie van RP met carcinogenese waren nog steeds toe [2], [10]. Echter, de exacte rol van de RP in de ontwikkeling van tumoren zijn divers en moeten nog nadere toelichting.}

Eerder hebben we een analyse van de mRNA-profielen van een mens maagkanker cellijn SGC7901 en de multiresistente variant SGC7901 /VCR door differentiële weergegeven PCR en onderdrukking subtractieve hybridisatie [11], [12]. RPL6 werd geïdentificeerd als een van de tot overexpressie gebrachte genen in SGC7901 /ADR opzichte SGC7901, dat verder werd bevestigd door RT-PCR en Northern blot analyse [13]. Latere studies toonden aan dat opwaartse regulatie van RPL6 beschermde maagkanker cellen uit adriamycine geïnduceerde apoptose en verhoogde de weerstand van maagkanker cellen meerdere chemotherapeutische geneesmiddelen, zoals vincristine, adriamycine, etopside, cisplatine en 5-fludrouracil [13]. Deze gegevens gaven aan dat RPL6 de kwaadaardige fenotypes van maagkanker cellen, die leidde ons naar de volgende studie uit te voeren naar de precieze rol van RPL6 verder te verkennen in carcinogenese en de ontwikkeling van maagkanker kunnen bevorderen. Toen ontdekten we dat genetisch up-regulatie van RPL6 in GES cellen van de groei kunnen versnellen en verbeteren van in vitro kolonievormende vermogen van GES cellen, terwijl down-regulatie van RPL6 tegengestelde resultaten kunnen vertonen. Bovendien, up-regulatie van RPL6 kunnen G1 S faseovergang GES cellen te bevorderen. Verder onderzoek toonde aan dat RPL6 opgereguleerd cycline E-expressie in GES-cellen [14]. Tezamen suggereren deze gegevens dat RPL6 de kwaadaardige fenotypen van maagkanker cellen en RPL6 kunnen bevorderen kan een oncogene rol bij het ontstaan ​​van tumoren en de ontwikkeling van maagkanker, waardoor we tot de onderhavige studie uit te voeren om de mogelijke rol van RPL6 in gen staand spelen behandeling van maagkanker en kan worden gebruikt als een nieuwe benadering voor maagkanker therapie.

Resultaten

RPL6 en cycline E-expressie in menselijke maagkanker monsters en afgestemd naburige niet-neoplastische weefsels

de relaties tussen RPL6 en cycline E expressie met de ontwikkeling van maagkanker onderzoeken, ontdekt we RPL6 en cycline E-expressie in menselijke weefsels en maagkanker afgestemd naburige niet-neoplastische weefsels door immunohistochemische kleuring. Uit de resultaten bleek dat RPL6 en cycline gelokaliseerd bijna cytoplasma en slechts sporadisch in kernen in maagkanker cellen (Fig. 1A). Nadere analyse gevonden dat de positieve verhouding (zoals specimens die gekleurd) van RPL6 was 84% ​​(46 van de 55 patiënten) terwijl de positieve verhouding van cycline E was 75% (41 van de 55 patiënten) in menselijke maagkanker monsters. De positieve verhouding zowel RPL6 en cycline E was 70% (38 van de 55 patiënten), terwijl de negatieve verhouding (zoals specimens die kleurden) zowel RPL6 en cycline E was 11% (6 van de 55 patiënten) in menselijke maagkanker specimens . De positieve verhouding zowel RPL6 en cycline E was 18% (8 van de 55 patiënten) in gelijke naburige niet-neoplastische weefsels (gegevens niet getoond). Wat het verschil tussen RPL6 expressie en cycline expressie in menselijke maagkanker monsters, was er geen verschil. Deze studie toonde aan dat RPL6 en cycline E uitdrukkingen in menselijke maagkanker monsters waren relatief (figuur 1B, p lt;. 0,05), die een con-royale rol spelen bij de ontwikkeling van maagkanker en RPL6 en cycline E kan een dienst biomarker voor maagkanker diagnose en gendoelwit maagkanker therapie. Aan het eind van follow-up, overlevingstijd van patiënten werden geanalyseerd door Kaplan-Meier-methode en de resultaten bleek dat bij patiënten die werden gevolgd, patiënten met zowel positieve als RPL6 cycline E positief vertoonde een kortere overlevingstijd en slechtere prognose dan zowel RPL6 negatieve als cycline E negatieve expressie, of met RPL6 positieve en cycline E negatief of RPL6 negatieve en cycline positieve expressie (Fig 2 A, p lt;. 0,01), die kunnen worden onthuld dat patiënten met zowel RPL6 positieve en cycline E positief toonde slechte prognose. Het is ook aangetoond dat patiënten met RPL6 negatieve expressie toonde langere overlevingstijd dan RPL6 positieve (Fig 2B, p. ≪ 0,01), en patiënten met cycline E positieve uitdrukking toonde slechte prognose (figuur 2C, p. ≪ 0,01). Daarom kan een conclusie worden getrokken dat RPL6 kan diende als een biomarker voor het evalueren van de prognose van maagkanker patiënten.

Expressie van RPL6 bij maagkanker cellijnen en zijn derivaten

Om verder te verkennen de mogelijke rol van RPL6 bij gentherapie maagkanker, werden SGC7901 en AGS cellen die met RPL6-specifieke siRNA en de gemengde pool van G418-resistente cellen varianten geproduceerd. De G418-resistente varianten herbergen RPL6-specifieke siRNA dienovereenkomstig genoemd als SGC7901-siRPL6-1, AGS-siRPL6-1 en SGC7901-siRPL6-2, AGS-siRPL6-2. De G418-resistente cellen herbergen scramble siRNA plasmiden werden ontworpen als respectievelijk SGC7901-siControl en AGS-siControl. Zoals getoond in figuur 3A, RPL6 expressie significant neerwaarts gereguleerd SGC7901-siRPL6-1, AGS-siRPL6-1 en SGC7901-siRPL6-2, AGS-siRPL6-2 cellen vergeleken met ouderlijke cellen en controlecellen. In deze studie SGC7901-siRPL6-2 en AGS-siRPL6-2 bleek effectiever remmend resultaten, waaruit bleek dat de SGC7901-siRPL6-2 en AGS-siRPL6-2 cellen kunnen worden gebruikt als een goede celmodel de potentiële verduidelijken rol van RPL6 in gentherapie van maagkanker voor de kliniek.

negatieve regulatie van RPL6 onderdrukken maag de groei van kankercellen in vitro

Om te onderzoeken of down-regulatie van RPL6 expressie de groei van SGC7901 zou kunnen remmen en AGS cellen, ouderlijke cellen, controle cellen en hun varianten werden gezaaid in de cultuur platen en hun groei werd gecontroleerd elke dag met MTT assay. Zoals aangegeven door de groeicurven in Figuur 3B, de controle (SGC7901-siControl en AGS-siControl) cellen vertoonden een vergelijkbare groei van de ouders (SGC7901 en AGS) cellen, respectievelijk, terwijl SGC7901-siRPL6-1, AGS-siRPL6-1 en SGC7901 -siRPL6-2, AGS-siRPL6-2 cellen vertoonden lagere groei dan controle cellen, en SGC7901-siRPL6-2, AGS-siRPL6-2 cellen toonde de laagste groei (Fig 3B, p. < 0,05). De verankering-onafhankelijke groei van deze cellen werd verder geanalyseerd met zachte agar kolonievorming assay. Bleek dat SGC7901-siRPL6-1, AGS-siRPL6-1 en SGC7901-siRPL6-2, AGS-siRPL6-2 cellen die minder cel kolonies in zachte agar dan de ouderlijke cellen en controlecellen (figuur 3C, p lt.; 0,05), cellen genoemd met SGC7901-siRPL6-2 en AGS-siRPL6-2 produceerde de minste koloniën. Deze gegevens suggereerden dat down-regulatie van RPL6 maag de groei van kankercellen kan onderdrukken en remmen de kolonie vorming vermogen van SGC7901 en AGS-cellen.

RPL6 siRNA remde het ontstaan ​​van tumoren van maagkanker cellen in vivo

Om de effecten van RPL6 verder te bevestigen op tumorigenese van maagkanker, werd tumorvorming assay uitgevoerd in naakt muizen. SGC7901, AGS en SGC7901-siRPL-2, werden AGS-siRPL6-2 cellen subcutaan geënt in de rechter of linker bovenrug van athymische naakt muizen op een enkele plaats. (Fig. 4A en C) Vier weken later werden de muizen gedood en de getransplanteerde tumoren werden uitgesneden en tumorgroottes werden geëvalueerd (figuur 4B en D, p <. 0,05). Er was een significante vermindering van grootte van xenotransplantaten in RPL6 neergereguleerd cellen. Deze gegevens gaven aan dat knock-down van RPL6 konden maagkanker cel ontstaan ​​van tumoren te onderdrukken in vivo en RPL6 kan een belangrijke rol spelen bij het bevorderen van de kwaadaardige groei van maagkanker cellen in vivo.

RPL6 afgeremd G1-S-fase-overgang van SGC7901 cellen

de onderliggende mechanismen van het onderdrukkende rol van RPL6 in maag groei van kankercellen te ontdekken, de effecten van RPL6 op celcyclusverdeling van SGC7901 cellen werden geanalyseerd (Fig. 5A). Zoals getoond in figuur 5B, SGC7901 siRPL6-1-cellen vertoonden licht verhoogd percentage G1 fase en verminderde percentage S-fase, terwijl SGC7901 siRPL6-2-cellen weergegeven aanzienlijk verhoogd percentage G1 fase en verminderde percentage S-fase (P < 0,05 ) in vergelijking met ouderlijke cellen en controlecellen. Daaruit bleek dat RPL6-specifieke siRNA de G1-S overgang SGC7901 cellen kunnen vertragen.

RPL6 neerwaarts gereguleerde expressie van cycline E bij maagkanker cellen op eiwitniveau

Het is bekend dat G1-S progressie wordt door cycline D /CDK4 als cycline E /CDK2-complexen, welke door INK4 familie, p21 en p27, respectievelijk. De expressie van deze regulatoren in SGC7901 en AGS cellen en zijn varianten werden bepaald door Western Blot-analyse. Zoals aangegeven in figuur 6, expressie van cycline E significant neerwaarts gereguleerd SGC7901-siRPL6-2 en AGS-siRPL6-2 cellen. Uitingen van CDK2, p16, p21 en p27 waren onveranderd in SGC7901 en AGS cel varianten. Deze gegevens suggereren dat neerwaartse regulatie van RPL6 verminderde de expressie van cycline E in SGC7901 en AGS cellen, die de mogelijke rol van RPL6 en cycline E bij de ontwikkeling van maagkanker en RPL6 kunnen afbakenen kan gebruikt als gendoelwit maagkanker in de kliniek.

Discussie

de huidige studie toonde aan dat RPL6 en cycline E waren over-uitgedrukt in maagkanker weefsels en er is een positieve correlatie tussen hen bij maagkanker weefsels. Follow-up resultaten bleek dat patiënten met RPL6 negatieve expressie toonde langere overlevingstijd dan die met RPL6 positieve uitdrukking, die suggereerde dat RPL6 positieve patiënten vertoonden een slechte prognose. Verder onderzoek toonde aan dat down-regulatie van RPL6 door RPL6-specifieke siRNA remde de proliferatie en verankering-onafhankelijke groei van maagkanker cellijnen in vitro, onderdrukte voortgang van de celcyclus en onderdrukt cycline E expressie, Bovendien zijn de knock-down van RPL6 door RPL6-specifieke siRNA onderdrukte tumorvorming vermogen van maagkanker cellen in vivo.

in onze eerdere studie, differentieel tot expressie gebrachte genen geassocieerd met resistentie tegen meerdere maagkanker cellen werden geïsoleerd met gebruikmaking van differentiële weergave RT-PCR en subtractieve hybridisatie [11], [ ,,,0],12]. RPL6, een onderdeel van de grote subeenheid van ribosoom, werd op deze wijze geïsoleerd als een kloon overexpressie van multidrug-resistente maagkanker cellen [11]. Aangetoond werd dat RPL6 maagkanker cellen kunnen beschermen tegen chemotherapeutische drugs geïnduceerde apoptose [13]. Deze gegevens suggereerden dat RPL6 zou kunnen inhouden bij de regulering van het kwaadaardige fenotype van maagkanker. Verder onderzoek werd ontworpen om de rol van RPL6 in de tumorigenese en ontwikkeling van maagkanker onderzoeken en resultaten suggereerden dat opwaartse regulatie van RPL6 versnelde groei en in vitro kolonievormende vermogen van GES cellen dat neerwaartse regulatie van RPL6 vertoonden tegengestelde resultaten. Ook up-regulatie van RPL6 versnelde G1 S fase-overgang van GES cellen ten minste door middel van up-regulatie van cycline E expressie terwijl down-regulatie van RPL6 toonde tegenover resultaten [14]. Tezamen suggereren deze gegevens dat RPL6 een oncogene rol zou kunnen spelen bij tumorigenese en ontwikkeling van maagkanker en kan dienen als een nieuwe benadering voor gentherapie van maagkanker.

Tegenwoordig neemt sterker patiënten overleden aan kanker door de kwaadaardige fenotypen ervan. behandeling kanker verontrust over de hele wereld mensen. Naast chemotherapie en chirurgische behandeling, gentherapie is een nieuwe en veelbelovende kankerbehandeling. Een van de meest gebruikte methoden voor gentherapie is RNA interferentie (RNAi). RNAi, een sterk geconserveerd genuitschakeling mechanisme speelt een belangrijke rol in de regulatie van genexpressie. Gene silencing door een post-transcriptioneel mechanisme met homologe dubbelstrengs RNA werd eerst ontdekt in kunstmatige systemen waarbij dubbelstrengs RNA (dsRNA) door middel van injectie of door expressie van transgene constructen geïntroduceerd. Dit verschijnsel doet zich door kleine interfererende RNA (siRNA) in het cytoplasma van zoogdiercellen. In siRNA techniek werden twee afgiftemechanismen beschouwd, directe aflevering van synthetische siRNA nucleotide- en introductie van een plasmide DNA (pDNA) coderend voor een korte haarspeld construct (shRNA) die enzymatisch afgebroken zou in siRNA [15]. SiRNA speelde zijn remmende rollen door het afstemmen met de sequenties van mRNA en remde de daaruit voortvloeiende mRNA expressie en vertaling, en werkte als negatieve regulatie. Tegenwoordig hebben steeds meer wetenschappers ontdekten dat neergehaald gen-expressie door siRNA aanzienlijk kunnen onderdrukken tumorgroei en metastase. X-gebonden remmer van apoptose-eiwit (XIAP), een belangrijk lid van de remmers van apoptose-eiwit (IAP) familie, is betrokken bij de controle van celdeling, celproliferatie en remming van apoptose [16], [17]. Neerwaartse regulatie van XIAP door siRNA aanzienlijk kan onderdrukken proliferatie van tumorcellen en sensibiliseren van tumorcellen voor chemotherapeutica [18], [19]. Osteopontine (OPN) eiwit, dat tot overexpressie gebracht in de meerderheid van patiënten met maagkanker en geassocieerd met de pathogenese, speelt een belangrijke rol bij de proliferatie, invasie, metastase en overleving van maagkanker [20]. Vervolgens neerwaartse regulatie van OPN door OPN-specifieke siRNA remde de groei, migratie en invasie van maagkanker cellen [21]. CML66 een nieuwe tumor antigeen dat een oncogeen rol werd tot overexpressie gebracht in de meeste kankercellijnen en kanker [22], neerhalen de expressie door CMl66-specifieke siRNA aanzienlijk remde proliferatie, invasie en metastase van HeLa-cellen zowel in vivo en in vitro experimenten [23]. FABP5, die cutane vetzuur bindend eiwit (C-FABP) codeert, wordt opwaarts gereguleerd bij prostaatkanker en fungeert als een vermoedelijk oncogeen. Neerwaartse regulatie van FABP5 door FABP5-specifieke siRNA remt effectief prostate kanker celgroei in naakt muizen [24]. Wanneer bovendien ribosomaal eiwit RPS13 die maagkanker cellijn SGC7901 groei versterkt door RPS13-specifieke siRNA, het aanzienlijk remde SGC7901 celgroei en kolonievormende vermogen is uitgeschakeld in vitro en onderdrukte tumorvorming vermogen in naakt muizen [25]. Vroeger onderzoek toonde ook aan dat systemische toediening van siRNA via atelocollageen, dat specifiek gericht tumoren, veilig en haalbaar is voor kankertherapie prostaatkanker [26]. Daarom bewijs hierboven aangegeven siRNA dat door het remmen van genexpressie kan een nieuwe benadering voor kankertherapie en maak gentherapie van kanker mogelijk voor klinische behandeling.

In deze studie blijken van RPL6 en cycline E in de maag kankerweefsel en de bijbehorende naburige niet-neoplastische weefsels gedetecteerd en de resultaten bleek dat RPL6 en cycline E werden hogere expressie in maagkanker weefsels dan in overeenkomstige naburige niet-neoplastische weefsels. Bovendien is er een correlatie tussen RPL6 en cycline E-expressie in weefsels maagkanker, waaruit bleek dat een con-royale rol spelen bij de ontwikkeling van maagkanker en RPL6 kan dienen als biomarker voor maagkanker diagnose. Follow-up resultaten toonden aan dat patiënten met zowel RPL6 positieve en cycline E positieve uitdrukkingen toonde een kortere overlevingsduur en slechtere prognose dan de overeenkomstige controle en ook aangegeven dat patiënten met RPL6 negatieve expressie toonde langere overlevingstijd en betere prognose dan patiënten met RPL6 positieve uitdrukking, die suggereerde dat RPL6 kan diende als een biomarker voor maagkanker prognose en een gen doelwit voor maagkanker therapie in de kliniek.

Om verder de mogelijke haalbaarheid van RPL6 gentherapie doelwit van maagkanker in de kliniek te verkennen, we klopten neer RPL6 expressie in SGC7901 en AGS cellen door RPL6-specifieke siRNA, resultaten toonden aan dat down-regulatie van RPL6 bij maagkanker ouderlijke cellijnen (SGC7901 en AGS) effectief geremd celgroei en in vitro kolonievormende vermogen. Verder celcyclus analyse dat neerwaartse regulatie van RPL6 vertraagd G1 S fase van maagkanker cellen. Western blot analyse toonde aan dat RPL6 geremd voortgang van de celcyclus door middel van down-regulatie van cycline E. Tumor vorming experimenten in naakt muizen gesuggereerd dat down-regulatie van RPL6 tumorvorming kon onderdrukken in vivo.

Cycline E, een belangrijke cel cyclus eiwit dat een belangrijke rol gespeeld in de G1-S overgang was in wanorde in veel verschillende tumoren [27], [28], [29], [30], [31]. Eerder onderzoek toonde aan dat cycline E was een belangrijke molecule in het ontstaan ​​van tumoren. In deze studie hebben we ontdekt dat cycline E-expressie, samen met RPL6 hoger in menselijke maagkanker weefsels dan in overeenkomstige naburige niet-neoplastische weefsels, die de rol van cycline E gespeeld bij de ontwikkeling van maagkanker voorgesteld. Verder onderzoek toonde aan dat RPL6 beïnvloed celgroei door het reguleren van cycline E, waaruit bleek dat een hoge expressie van cycline E versnelde celgroei terwijl lage expressie van cycline E vertraagd celproliferatie. Cycline E en RPL6 kan con-royale rol spelen bij de ontwikkeling van maagkanker.

Kortom, deze studie aangetoond dat RPL6 en cycline expressie geassocieerd met elkaar maagkanker weefsels en zij kunnen spelen con- royale rol in de ontwikkeling van maagkanker, waaruit bleek dat RPL6 kan gebruikt als diagnostisch hulpmiddel bij maagkanker. Follow-up data-analyse toonde aan dat patiënten met RPL6 negatieve expressie toonde langere overlevingstijd en betere prognose dan patiënten met RPL6 positieve uitdrukking postoperatief, die suggereerde dat RPL6 diende als een biomarker voor maagkanker prognose en een nieuw gen doelwit voor maagkanker therapie. Nader onderzoek gaf aan dat down-regulatie van RPL6 expressie door RPL6-specifieke siRNA remde SGC7901 celgroei en in vitro kolonievorming vermogen, vertraagde SGC7901 cel G1 S fase-overgang, en onderdrukt de vorming van tumoren in vivo. Tot slot, onze huidige studie bevestigde dat RPL6 siRNA's kunnen worden gebruikt als een nieuwe benadering voor maagkanker therapie voor de kliniek.

Materialen en methoden

Ethics Verklaring

Voor weefselmonsters alle patiënten werden geïnformeerd toestemming om overtollig pathologische monsters te gebruiken voor onderzoeksdoeleinden. De protocollen die in deze studie werden goedgekeurd door het ziekenhuis Protection of Human Subjects Committee. Het gebruik van menselijke weefsels werd goedgekeurd door de institutionele review board van de Vierde Militaire Medische Universiteit en is in overeenstemming met de Verklaring van Helsinki, en aan de lokale wetgeving. Patiënten met monsters voor de studie ondertekend informed consent formulieren. Voor dierproeven werden alle procedures voor dierproeven uitgevoerd in overeenstemming met de Institutional Animal Care en gebruik Comite richtlijnen van het Experiment Animal centrum van de Vierde Militaire Medische Universiteit. De goedkeuring ID voor het gebruik van de dieren was No. 10218 door Experiment Animal Center van de Vierde Militaire Medische Universiteit.

weefselmonsters en cellijnen

weefselmonsters ingebed met paraffine werden verzameld van 55 patiënten met maagkanker die gastrectomy in ons ziekenhuis tussen 2004 en 2009. Alle gevallen van maagkanker en naburige niet-tumorweefsels ondergingen werden klinisch en pathologisch gediagnosticeerd. Gegevens over clinicopathologische functies en prognoses van de patiënten werden verzameld en retrospectief geanalyseerd. Een totaal van 55 patiënten werden gevolgd tot aan het einde van het jaar 2009 en twee van hen werden verloren tijdens de follow-up periode. Human adenocarcinoom cellijn SGC7901 werd verkregen uit de Academie van Militaire Medische Wetenschappen, werd AGS verkregen uit de Shanghai Cell Bank (Shanghai, China). De twee cellijnen werden bewaard in ons instituut. Alle cellijnen werden gehandhaafd in RPMI1640 (Invitrogen, Carlsbad, CA) aangevuld met 10% door warmte geïnactiveerd foetaal kalfsserum (FCS) bij 37 ° C met 5% CO _{2 in een bevochtigde incubator (Forma Scientific, Marietta, OH).}

Immunohistochemie Immunohistochemische en scoring

paraffine ontdaan en gerehydrateerd secties werden in zoet water gewassen gedurende 10 minuten. Warmte geïnduceerde antigen retrieval werd gedurende 20 minuten bij 95 ° C met 10 mM citraat natrium buffer (pH 6,0). Nadat de objectglaasjes werden bij kamertemperatuur afgekoeld gedurende 40 minuten, werden zij geblokkeerd in 3% waterstofperoxide gedurende 20 minuten en vervolgens bij normaal geit serum beperken vloeistof voor 40 minuten. Hierna werden ze liet reageren gedurende een nacht bij 4 ° C met primaire antilichamen IgG, RPL6 en cycline (Santa Cruz). Na opwarmen gedurende 40 minuten, waren ze vervolgens omgezet met tweede antilichamen (Zhongshan Goldenbridge Biotechnology CO.LTD) nog eens 40 minuten bij kamertemperatuur. Daarna werden de producten ontwikkeld met 3,3'-diaminobenzidine en tegengekleurd met hematoxyline. Scoren werd voltooid door een specialist patholoog en een wetenschapper die werden blind voor de klinische en pathologische informatie. In geval van tegenstrijdigheid, werd een consensus bereikt met conferencing. De verhoudingen van positieve cellen (0-3) en de kleuring intensiteit (0-3) werden afzonderlijk onderzocht bij een vergroting van 200 x. De eerste werd berekend door het tellen van het aantal bevlekt tumorcellen in het totale aantal tumorcellen, bijvoorbeeld wanneer 25% van de totale cellen werden gekleurd, het aandeel score was 1 en 50% gelijk aan 2, 75% gelijken tot 3, 0% gelijk aan 0. de intensiteit scoring werd beoordeeld door de kleur van gekleurd tumor celkern specifiek score 0 betekent achromatische, 1 betekent amber, 2 betekent geel en bruin 3 betekent. Gecombineerd scoren + 1~ + 2 werden gedefinieerd "negatief", en + 3~ + 6 werden beschouwd als "positief".

Plasmid bouw en transfectie

Twee paar haarspeldbochten kleine interfererende RNA (siRNA ) voor oligo RPL6 werden ontworpen volgens de richtlijnen van TaKaRa Biotechnologie Co siRNA ontwerp, Ltd. Vergelijk doelsequenties om de menselijke genoom database een BLAST zoekopdracht elimineren beschouwing elke doelsequentie met 21 basenparen van homologie aangrenzend aan andere coderende sequenties . Voor oligo-1, sense: 5'- GATCCGGAGAAGGTTCTCGCAACTTTCAAGAGAAGTTGCGAGAACCTTCTCCTTTTTTGGAAA-3 ', antisens: 5'AGCTTTTCCAAAAAAGGAGAAGGTTCTCGCAACTTCTCTTGAAAGTTGCGAGAACCTTCTCCG-3'; voor oligo-2, sense: 5'- GATCCGTCGAGTTCCTCTACGAAGATTCAAGAGATCTTCGTAGAGGAACTCGATTTTTTGGAAA-3 ', antisens: 5'-AGCTTTTCCAAAAAATCGAGTTCCTCTACGAAGATCTCTTGAATCTTCGTAGAGGAACTCGACG-3'; Een scramble DNA-duplex was ook bedoeld als controle, voor oligo-1, sense: 5'-GATCCGGTGAGATCTTCGACACAGTTCAAGAGACTGTGTCGAAGATCTCACCTTTTTTGGAAA-3 ', antisense: 5'-AGCTTTTCCAAAAAAGGTGAGATCTTCGACACAGTCTCTTGAACTG TGTCGAAGATCTCACCG-3'. Voor hybridisatie aan DNA duplexen vormen, 0,01 M elk van sense en antisense oligo's werden gebruikt. De duplexen werden verdund en vervolgens geligeerd met pSilencer3.1-H1 neo vector (TaKaRa Biotechnology (Dalian) Co., Ltd). De producten werden getransformeerd in DH5a-competente cellen. Ampicilline-resistente kolonies werden gekozen, die door restrictiedigestie en bevestigd door DNA sequentiebepaling. Volgens de instructies van de fabrikant werden siRNA plasmiden van RPL6 SGC7901 getransfecteerd in cellen met behulp van Lipofectamine 2000 reagens (Invitrogen, Carlsbad, CA), respectievelijk. Vierentwintig uur na transfectie G418 (400 ug /ml) werd toegevoegd aan het kweekmedium voor de vestiging van stabiele klonen. De gemengde klonen werden geëxpandeerd gedurende nog 2 maanden. De SGC7901 en AGS-cellen (ook wel ouderlijke cellen) stabiel tot expressie exogene RPL6 werden genoemd als SGC7901-siRPL6-1, AGS-siRPL6-1 en SGC7901-siRPL6-2, AGS-siRPL6-2. En cellen die met siControl werden genoemd als SGC7901-siRPL6 Controle en AGS-siRPL6 Control (ook wel controle cellen).

Cell proliferatie assay

3- (4,5-dimethylthiazool-2- yl) -2,5-difenyl-tetrazoliumbromide (MTT) bepaling werd uitgevoerd om het effect van RPL6 op celproliferatie geëvalueerd zoals eerder beschreven [32]. De absorptie bij 490 nm (A490) van elk putje werd gelezen op een microplaat reader BP800 (Biohit, Helsinki, Finland). Elk experiment werd uitgevoerd in viervoud en werd 3 maal herhaald.

Soft agar kolonievorming assays

Soft agar kolonievorming assay werd gebruikt om verankering-onafhankelijke groei celpotentiaal bepalen. Twaalf putjes werden gevuld met 0,5 ml 0,5% noble agar (Invitrogen) in RPMI1640 gesupplementeerd met 10% kalfserum als onderlaag en men liet stollen bij 4 ° C overnacht. Een totaal van 200 cellen werden gesuspendeerd in 0,25 ml van 0,3% agarose en gezaaid op de bodem agar. Celcultuur platen werden in een CO _{2 incubator gedurende 2 weken. Het aantal kolonies werd geteld onder een microscoop.}

tumorvorming in naakt muizen

Tumor vorming werd uitgevoerd om de effecten van RPL6 op tumorigeniciteit in vivo te evalueren. BALB /c muizen naakt van 4-6 weken werden door Shanghai Cancer Institute en gehuisvest in micro-isolator kooien onder positieve luchtdruk, en op een constante temperatuur (22 ° C) en vochtigheid gedurende de tumorigeniciteitsonderzoek. Ongeveer 3 x 10 ^{6 cellen in log-fase werden verzameld en subcutaan geïnjecteerd in de bovenrug van BALB /c naakt muizen. Ten minste drie naakt muizen werden voor elke groep. De muizen werden 4 weken later gedood en tumorgewicht van elke muis werd geëvalueerd. Alle procedures voor dierproeven werden uitgevoerd in overeenstemming met de Institutional Animal Care en gebruik Comite richtlijnen van het Experiment Animal centrum van de Vierde Militaire Medische Universiteit.}

Cell cycle analysis

Voor de analyse van celcyclus distributiefase, SGC7901 en zijn varianten op log-fase werden geoogst en tweemaal met ijskoude PBS gewassen. Celpellets werden gefixeerd in 70% ethanol, behandeld met RNase A (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN) en gekleurd met propidiumjodide (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO).

• PLoS ONE: Het DNA Repair Gene APE1 T1349G polymorfisme en risico van maagkanker in een Chinese bevolking
• PLoS ONE: Verlies van de Promyelocytic Leukemie Protein bij maagkanker: Gevolgen voor de IP-10 Expressie en Tumor-Infiltrating Lymfocytes