PLoS ONE: opregulatie van autofagie-gerelateerde gen-5 (ATG-5) is geassocieerd met chemoresistance in Human MaagKanker

Abstract

-Autofagie gerelateerde gen-5 (ATG-5) is een van de belangrijkste regulatoren van autofagocytische celdood. Het is algemeen als een beschermende moleculaire mechanisme voor tumorcellen tijdens chemotherapie. In het onderhavige onderzoek onderzochten we het expressiepatroon van ATG-5 en multidrug resistentie-geassocieerde eiwit-1 (MRP-1) in 135 maagkanker (GC) van de patiënten die werden behandeld met epirubicine, cisplatine en 5-FU adjuvante chemotherapie (ECF ) na chirurgische resectie en onderzochten hun mogelijke klinische betekenis. Wij vonden dat zowel ATG-5 (77,78%) en MRP-1 (79,26%) licht werden uitgedrukt in GC patiënten. ATG-5 expressie was significant geassocieerd met de diepte van de muur invasie, TNM stadia en verre metastase van GC (P < 0,05), terwijl MRP-1 expressie was significant verband met de tumorgrootte, de diepte van de muur invasie, lymfeklieren metastase, TNM stadia en differentiatie status (P < 0,05). ATG-5 expressie werd positief gecorreleerd met MRP-1 (rp = 0,616, P < 0,01). Verhoogde expressie van ATG-5 en MPR-1 was significant gecorreleerd met een slechte algehele overleving (OS; P < 0,01) en ziektevrije overleving (DFS; P < 0,01) van onze GC cohort. Verder hebben we aangetoond dat de ATG-5 was betrokken bij resistente van GC cellen, die vooral was door middel van het reguleren van autofagie. Onze gegevens suggereren dat opgereguleerd expressie van ATG-5, een belangrijk moleculair kenmerk van beschermende autofagie, wordt gebruikt chemoresistance in GC. Expressie van ATG-5 en MRP-1 kan prognostische merkers voor GC behandeling

Citation:. J Ge, Chen Z, Huang J, Chen J, Yuan W, Z Deng, et al. (2014) opregulatie van autofagie-gerelateerde gen-5 (ATG-5) is geassocieerd met chemoresistance in Human maagkanker. PLoS ONE 9 (10): e110293. doi: 10.1371 /journal.pone.0110293

Editor: Pankaj K. Singh, Universiteit van Nebraska Medical Center, de Verenigde Staten van Amerika

Ontvangen: 5 augustus 2014; Aanvaard: 18 september 2014; Gepubliceerd: 17 oktober 2014

Copyright: © 2014 Ge et al. Dit is een open-access artikel gedistribueerd onder de voorwaarden van de Creative Commons Attribution License, die onbeperkt gebruik, distributie en reproductie maakt in elk medium, op voorwaarde dat de oorspronkelijke auteur en de bron worden gecrediteerd

Data Availability:. De auteurs bevestigen dat alle gegevens waarop de bevindingen zijn volledig beschikbaar zonder beperking. Alle relevante gegevens zijn binnen het papier

Financiering:. Dit werk werd ondersteund door de National Natural Science Foundation van de provincie Hunan, China (No. 2012FJ6088). De financiers hadden geen rol in de studie design, het verzamelen van gegevens en analyse, besluit te publiceren, of de voorbereiding van het manuscript

Competing belangen:.. De auteurs hebben verklaard dat er geen tegenstrijdige belangen bestaan ​​

Introductie

Ondanks een forse daling van de incidentie in veel ontwikkelde landen, maagkanker (GC) blijft de vierde meest gediagnosticeerde maligniteit, en de tweede belangrijke oorzaak van kanker-gerelateerde sterfgevallen wereldwijd [1]. In de afgelopen decennia, standaard multimodale behandelingsstrategieën samen met andere aanbevolen opties (bv D2 dissectie en adjuvante chemotherapie) er niet in geslaagd om een ​​groot deel van de patiënten besmet zijn met GC te genezen, vooral voor degenen met gevorderde en metastatische ziekten, met slechtere overlevingskansen gezien waarschijnlijk als gevolg van de aanwezigheid van chemoresistance tijdens behandeling [2]. Vandaar dat identificatie van nieuwe moleculaire gebeurtenissen die ten grondslag liggen aan de ontwikkeling van deze maligniteit en de slechte prognose evenals inzicht in de mechanismen van GC chemoresistance zijn dringend nodig voor een effectievere klinische interventie en een beter beheer van de patiënten.

Onder fysiologische omstandigheden, autofagie is een lysosoom-afhankelijke self-verteren systeem primair verantwoordelijk voor het verwijderen en recycling van langlevende eiwitten en beschadigde /verouderde intracellularorganelles om cel homeostase [3] te handhaven. De eiwitten en organellen die bestemd zijn voor vernietiging worden afgezonderd binnen "double-membraan" vacuolen (autofagosomen), gevolgd door een fusie met lysosomen om complexen bekend als autofagosomen, waar de inhoud wordt afgebroken door lysosomale hydrolasen bouwen [4]. Er is gedocumenteerd dat autophagy kan worden geïnduceerd in respons op vele ongunstige omstandigheden waaronder voedingsstoffen deprivatie, oxidatieve stress en DNA-schade en dient als een adaptief celmechanisme uiteindelijk waardoor cellen overleven en prolifereren, terwijl uitgebreide of aanhoudende autofagie leidt tot celdood [ ,,,0],5]. Stoornissen in fysiologische activatie aanmaak en functie van de autofagocytische pathway in toenemende mate waargenomen in diverse menselijke kankers, hoewel de exacte rol van autofagie in kanker ontstaan ​​en de progressie wordt nog controverse. Bepaalde gegevens voorstander van het idee dat autofagie onderdrukt het ontstaan ​​van tumoren, terwijl andere bewijzen suggereren dat autofagie in staat is om de tumor initiatie triggeren en beschermt de tumorcellen uit apoptosis ondergaan [6]. Interessant inhibitie van autofagie is onlangs gevonden dat de antitumoractiviteit van verschillende cytotoxische middelen te verbeteren. Li en collega's rapporteerden dat autofagie werd geactiveerd als een beschermingsmechanisme tegen de cellulaire effecten van 5-FU-behandeling en remming van autofagie door 3-methyladenine aangevulde 5-FU-geïnduceerde apoptose in darmkankercellen [7], [8]. Anderzijds, sommige geneesmiddelen tegen kanker (bijvoorbeeld cetuximab en dasatinib) werden aangetoond autofagocytische celdood via verschillende mechanismen induceren in sommige kankercellen [9] - [13]. De moleculaire machines waarmee autofagie reguleert voortbestaan ​​of de dood van neoplastische cellen blijft grotendeels onduidelijk tot nu toe. De autofagie route is een zeer dynamisch proces gemoduleerd voornamelijk uitgevoerd door de-autofagie gerelateerde (ATG) familie van genen, die wordt beheerst door een aantal belangrijke kinases waaronder mTOR, PI3K /Akt, AMPK en MAPK [14], [15]. ATG-5 is een centrale regulator noodzakelijk autofagie qua betrokkenheid bij autophagosome rek [16]. Gedwongen expressie van ATG-5 gevoelig tumorcellen behandeling met geneesmiddelen tegen kanker beide In vitro Kopen en In vivo
; in tegenstelling siRNA-gemedieerde remming van ATG-5 heeft geleid tot een gedeeltelijke resistentie tegen chemotherapie [17]

De postoperatieve adjuvante chemotherapie is op dit moment een belangrijke behandeling voor GC.; echter, de totale effectiviteit van chemotherapie nog steeds slecht mogelijk als gevolg van de aanwezigheid van meervoudige geneesmiddelresistentie (MDR) fenotype. In tegenstelling tot andere tumor entiteiten expressie van de klassieke MDR-bemiddelende moleculen zoals glutathion S-transferase en multidrug resistance gen 1 lage prevalentie in GC weefsels, wat aangeeft dat er een gecompliceerd mechanisme kunnen zijn om de ontwikkeling van MDR in deze maligne aandoening [ ,,,0],18]. Als een van de klassieke resistente mechanismen heeft multidrug resistentie-geassocieerd eiwit 1 (MRP1 /ABCC1) bleken sterk uitgedrukt in GC en dus kunnen uitoefenen centrale rol bij het veroorzaken MDR in GC [19], [20]. Het blijft echter onbekend of MRP-1 expressie is geassocieerd met ATG-5 expressie. En of autofagie betrokken is bij chemoresistence GC patiënten is niet duidelijk.

In de onderhavige studie hebben we eerst gebruikt immunohistochemie om het expressieprofiel van ATG-5 en MRP1 onderzocht worden in een som van 135 GC patiënten kregen ECF (epirubicine, cisplatine en 5-FU) adjuvante chemotherapie na chirurgische resectie. De correlaties tussen ATG-5 en MRP-1-expressie en de expressie van diverse klinische en pathologische kenmerken van GC en klinische resultaten werden beoordeeld.

Materialen en Werkwijzen

Patiënten en weefselmonsters

Een totaal van 135 GC patiënten die bestaat uit 91 mannen en 44 vrouwen die een operatie ondergaan op de afdeling Gastro-intestinale chirurgie, Xiangya Ziekenhuis, Centraal Zuid-University (CSU), China, tussen 1 januari 2007 en 31 december 2008 werden geïncludeerd in deze studie. De gemiddelde leeftijd van de cohort was 53,62 ± 9,73 jaar, met een bereik van 26 tot 72 Theprimary GC tumor tissuesand voldoen niet-kanker (NC) weefsels die tenminste 5 cm van de tumor kern werden verkregen na chirurgische resectie en onmiddellijk verwerkt en opgeslagen tot verder gebruik. Geen van de patiënten geworven chemotherapie of radiotherapie voor de chirurgische operatie. De histopathologische diagnose werd preoperatief uitgevoerd en bevestigd door een operatie. Alle deelnemers met stadium IB bij IV tumoren ontvangen ECF chemotherapie na operatie (Dose: epirubicine 50 mg /m ^{2 op dag 1, cisplatine 60 mg /m 2 op dag 1 en continue intraveneuze infusie van 5-FU 500 mg /m 2 /d gedurende 4 dagen, herhaald elke 3 weken tot 24 weken). De klinische kenmerken van deze patiënten werden vermeld in tabel 1.}

In alle gevallen in deze studie werden beoordeeld en alle monsters werden histopathologisch opnieuw onderzocht in oktober 2012. De diepte van de muur invasie, regionale lymfeklieren metastase, en histologische graad werden bevestigd door dezelfde groep van twee ervaren senior pathologen. De patiënten werden ingedeeld op basis van de differentiatie status van kankercellen in drie histologische kwaliteiten: goed, matig en slecht. Gebaseerd op een combinatie van locoregionale tumor betrokkenheid en de aanwezigheid van metastase werden alle gevallen opgevoerd volgens de TNM classificatie Kwaadaardige tumoren (TNM) fase groep [21]. Voor de analyse van de overleving, de dag van operatie werd gebruikt om het startpunt van de follow-up bezoek vertegenwoordigen. Patiënten die stierven aan andere ziekten in plaats van GC of andere onverwachte gebeurtenissen werden uitgesloten van de zaak collectie. De oorzaak van de dood aangeworven in deze studie was verergering van GC. De totale overleving (OS) werd berekend als een periode vanaf de datum van de eerste operatie aan de datum van overlijden, of de datum van de laatste follow-up als eindpunt. De ziektevrije overleving (DFS) werd gedefinieerd als het tijdsinterval van een operatie tot de datum van lokale terugval of eerste afstand orgaan metastase. Informed schriftelijke toestemming is verkregen van elke patiënt voor de operatie en deze studie werd goedgekeurd door de Research Ethics Committee van Centraal Zuid-University, China. Alle monsters werden behandeld en anoniem gemaakt volgens de ethische en wettelijke richtlijnen.

Immunohistochemie

De verse monsters werden gefixeerd in 10% neutraal gebufferde formaline en vervolgens ingebed met paraffine. De in paraffine ingebedde weefsels werden gesneden in 4 urn en vervolgens met xyleen van paraffine ontdaan en gerehydrateerd verder H &E of peroxidase immunohistochemische kleuring met de DAKO EnVision System. Kortom, na proteolytische digestie belemmert met endogene peroxidase, weefselobjectglaasjes geïncubeerd met de primaire antilichamen (ATG5: ab54033; MRP1: ab32574, Inc. Abcam, Cambridge, UK) tegen respectievelijke doeleiwitten bij een verdunning van 1:500 overnacht bij 4 ° C. Na wassen met PBS, werden peroxidase gelabeld polymeer en substraat-chromogeen vervolgens toegepast om de immnohistochemical kleuring zichtbaar. Tenslotte werden secties tegengekleurd met hematoxyline, cover-gleed met montage medium, en onderzocht door lichtmicroscopie. Alle procedures werden uitgevoerd bij de afdeling Pathologie, Xiangya Hospital, C.S.U. Dia's werden onafhankelijk geïnterpreteerd door twee ervaren pathologen, die blind om informatie van patiënten waren. Wij gekwantificeerd kleurintensiteit en het percentage gekleurde cellen onder toepassing van een eerder beschreven aanpak [22], [23]: het percentage van positief gekleurde cellen (0% -100%) werd vermenigvuldigd met de dominante intensiteit kleuringspatroon, gezien als negatief of 1 sporen, 2 zwak, 3 en 4 als matig zo sterk. Daarom is de totale score varieert van 0 tot 400. De patiënten werden vervolgens ingedeeld in vier verschillende subgroepen: 0-99 te scoren, scoren 100-199, 200-299 te scoren en de score 300-400

Western blotanalyse <. br>

Gehele celextracten werden bereid met 0,14 M NaCl, 0,2 M triethanolamine, 0,2% natriumdeoxycholaat, 0,5% Nonidet P-40 en aangevuld met een proteaseremmer (alle producten waren van Sigma, St. Louis, Missouri , VERENIGDE STATEN VAN AMERIKA). Vervolgens werd eiwitmonster geleid door een 12% natriumdodecylsulfaat-polyacrylamide gelelektroforese (SDS-PAGE) gel en overgebracht naar een membraan. De overgebrachte membranen werden vervolgens overnacht geïncubeerd bij 4 ° C met een primair antilichaam. Na wassen werd het membraan geïncubeerd met een mierikswortelperoxidase (HRP) -gebonden secundair antilichaam gedurende 1 uur bij kamertemperatuur geroerd. De primaire antilichamen waren anti-ATG-5 (Santa Cruz, CA, USA), anti-LC3A /B (Abcam, Cambridge, UK) en anti-β-actine (Santa Cruz, CA, USA). Alle gerapporteerde resultaten zijn de gemiddelde verhoudingen van drie onafhankelijke experimenten.

celproliferatie assay

De cellen werden gezaaid op platen met 96 putjes (10.000 cellen /putje) gedurende 24 uur vóór de behandeling. MTT-assays werden gebruikt om celproliferatie beoordeeld op verschillende tijdstip na behandeling. De MTT-test werd als volgt uitgevoerd: MTT aan elk putje toegevoegd en de platen werden gedurende 4 uur geïncubeerd bij 37 ° C. Het MTT medium werd vervolgens verwijderd en 150 gl dimethylsulfoxide (DMSO) werd toegevoegd aan elk putje. De absorptie werd gemeten bij 570 nm met behulp van een meerwandige spectrofotometer

RNA interferentie

siRNA duplexen targeting ATG-5 werden als volgt gesynthetiseerd: siRNA-ATG5-486:. GACGUUG GUAACUGACAAATT; siRNA-ATG5-695: GUCCAUCUAAGGAUGCAAUTT en siRNA-ATG5-938: GACCUUUCAUUCAGAAGCUTT. siRNA duplexen met niet-specifieke sequenties werden gebruikt als een negatieve controle (NC): UUCUCCGAACGUGUCACGUTT. Verschillende siRNA's werden afzonderlijk getransfecteerd in cellen met de Lipofectamine 2000 reagens, en het medium werd vervangen 6 uur na transfectie.

Real-time RT-PCR

Totaal RNA uit de cellijnen en weefsels geëxtraheerd met de Trizol reagens (Invitrogen, Carlsbad, USA) volgens de instructies van de fabrikant. De RNA-concentratie werd gemeten met een spectrofotometer. Een cDNA verzameling werd gesynthetiseerd middels 1 pg totaal RNA en TaqMan reverse transcriptie Reagentia (Applied Biosystems, Foster City, USA) zoals beschreven door de fabrikant. De expressie van het doelwitgen werd geëvalueerd met behulp van een relatieve kwantificatie benadering (2 ^{-ΔΔCt methode) met β-actine als interne referentie.}

immunofluorescentietest

De cellen werden gepermeabiliseerd met 0,3 % Triton X-100 gedurende 10 min gevolgd door fixatie met 2-4% methanal gedurende 15 min, en geblokkeerd met 3% schapen serum bij kamertemperatuur gedurende 60 min. Vervolgens onderzocht met primaire antilichamen tegen LC3B (Santa Cruz, CA, USA) gedurende de nacht bij kamertemperatuur en de cellen werden driemaal gewassen met PBS. Gekleurd met Alexa Fluor 488 488 geconjugeerd konijn anti-geit IgG gedurende 1 uur bij kamertemperatuur en vervolgens werden de cellen driemaal gewassen met PBS. Kernen werden gevisualiseerd door kleuring met DAPI (Sigma, USA) gedurende 2 min. De gekleurde cellen werden waargenomen met omgekeerde fluorescentiemicroscoop.

Statistische analyse

Alle statistische analyses werden uitgevoerd met het SPSS softwarepakket 15.0 voor Windows (SPSS Inc., Chicago, IL, USA). Kwantitatieve gegevens werden gepresenteerd als gemiddelde ± SD. Pearson χ ^{2 test werd gebruikt om het verschil tussen de volgorde gegevens te vergelijken, terwijl één-weg ANOVA-test werd uitgevoerd om het verschil tussen de kwantitatieve gegevens te vergelijken. Survival analyses werden uitgevoerd met behulp van de Kaplan-Meier-methode uitgevoerd en vergeleken met de log-rank test. De Cox-regressiemodel werd uitgevoerd om de onafhankelijke hazard ratio's van elk variabel in de multivariate analyse geëvalueerd. De correlatie tussen ATG5 en MRP1 expressie werd onderzocht met behulp van Bivariate correlatie (Pearson) te testen. Verschillen werden beschouwd als statistisch significant wanneer P
waarden van minder dan 0,05 waren.}

Resultaten

Expressie van ATG-5 en MRP-1 in GC

het expressiepatroon en de plaats van ATG-5 en MRP-1 in onze GC patiënten, die werden behandeld met epirubicine, cisplatine en 5-FU adjuvante chemotherapie (ECF) na chirurgische resectie werden onderzocht met behulp van immunohistochemische analyse. Van de 135 monsters GC, 105 (77,78%) waren positief voor 5 ATG-immunoreactiviteit en 107 (79,26%) waren MRP-1 positief. Zoals weergegeven in figuur 1, vonden we dat ATG5 voornamelijk tot expressie werd gebracht in het cytoplasma. Bovendien overexpressie van ATG-5 positief gecorreleerd aan die van de MRP-1 in GC. (R = 0,616, P Restaurant < 0,001), zoals blijkt uit de Bivariate testen Correlatie. De positieve expressie in naburige niet-kankerachtige weefsels waren 113 (83,70%) ATG-5 en 89 (65,93%) van MRP-1. De gegevens toonden aan dat zowel ATG-5 en MRP-1 werden positief uitgedrukt in kanker en niet-kankerachtige weefsels die suggereren dat ATG-5 en MRP-1 kan worden veroorzaakt door chemotherapie in zowel tumor en niet-tumorweefsels. Aangezien alle monsters van patiënten werden behandeld met ECF chemotherapie, en wij vonden dat zowel ATG-5 en MRP-1 werden sterk tot expressie gebracht en correleerde positief in die monsters. Ondertussen eerdere studie aan dat MRP-1 zou geassocieerd met multi-drug resistentie in GC. Overzicht van eerdere bevindingen suggereren onze resultaten dat ATG-5 en MRP-1 betrokken kan zijn bij chemoresistance GC patiënten.

Associaties tussen expressie van ATG-5 of MRP-1 en klinisch-pathologische kenmerken van GC

De associaties van ATG-5 en MRP1 expressie met verschillende klinikopathologische parameters van GC worden getoond in Tabel 1 en Tabel 2, respectievelijk. Expressie van ATG-5 was significant geassocieerd met de diepte van de muur invasie, metastasen op afstand en TNM stadia van GC ( P Restaurant < 0,001, P
= 0,018, P
< 0,001 respectievelijk). MRP-1 expressie was significant geassocieerd met een verhoogde grootte van de tumor, de diepte van de muur invasie, regionale lymfeklieren metastase, TNM stadia ( P
= 0.032, P Restaurant < 0,001, P = 0,016, P < 0,001 respectievelijk) en differentiatie status ( P
= 0.005). De betrokkenheid d e ATG-5 en MRP-1 in de ontwikkeling GC vervolgens bepalen, voerden we overlevingsanalyse in ons patiëntenmonsters. Onze survival analyses toonden aan dat de totale totale overleving (OS) tarief van onze GC cohort was 43,70% met een gemiddelde overleving van 39,849 maanden (95% CI, 35,636-44,061 maanden); terwijl de ziektevrije overleving (DFS) bedroeg 34,07% met een gemiddelde overleving van 35,802 maanden (95% CI, 31,618-39,986 maanden). We vervolgens ingedeeld patiënten in vier verschillende subgroepen aan de scores van immunohistochemische kleuring. De Kaplan-Meier analyse toonde een hogere ATG-5 expressie was significant geassocieerd met een slechtere OS ( P Restaurant < 0,001) en DFS ( P
= 0,003). Paarsgewijze vergelijkingen gaven aan dat patiënten die de hoogste ATG-5 expressie (scores 300-400) had de slechtste overleving in vergelijking met die van andere subgroepen (Figuur 2A en 2B). Consequent werd opgereguleerd MRP-1 expressie significant geassocieerd met een slechte OS ( P
= 0,001) en DFS ( P
= 0,018) van onze GC patiënten. De subgroep met de hoogste scores MRP1 expressie (0-99) bleek de slechtste prognose (figuur 2C en 2D) hebben ten opzichte van andere subgroepen. Onze gegevens bleek ook dat er een significante correlatie tussen TNM stadia en overleving van patiënten GC. Patiënten met stadium III en IV tumors weergegeven slechtere prognose in vergelijking met die herbergen stadium IB en II tumoren ( P < 0,01
) (Figuur 2E en 2F). Interessanter is de Cox's multivariate hazard regressiemodel aangetoond dat ATG-5 en MRP-1 expressie niveaus en TNM stadia waren alle onafhankelijke en belangrijke voorspellende indicatoren voor het voorspellen van de OS ( P
= 0,037, P
= 0,005, P Restaurant < 0,001 respectievelijk) en DFS ( P
= 0,004, P
= 0.008, P Restaurant < 0,001 respectievelijk) GC (tabel 3). Onze gegevens geven aan het ATG-5 en MRP-1 zijn nauw verbonden met de ontwikkeling GC en kunnen een slechte prognose merkers dienen GC behandeling.

ATG-5 significant opgereguleerd in chemoresistent cellen

om verder te verkennen de rol van ATG-5 in de tumorvorming en resistente. We merken op dat de proteïne expressie in verscheidene maagkanker cellijnen (AGS, BGC-832, SGC7901, SGC7901 /DPP en MKN45) en in een geïmmortaliseerde menselijke maag-epitheliale slijmvlies cellijn (GES). Interessant, vonden we dat ATG-5 werd dramatisch overexpressie in DPP resistente cellijn, SGC7901 /DPP-cellen, vergeleken met alle andere cellijnen die gevoelig DPP SGC7901 cellen (Figuur 3A) omvatten. We verder bevestigd dat SGC7901 /DPP cellen resistent tegen DPP behandeling. De IC 25, IC50 en IC75 15,4 uM, 38,7 uM en 93,53 urn SGC7901 cellen. In contrast, het IC 25, IC50 en IC75 werden uM 120,03, 271,9 en 423,7 pM uM in SGC7901 /DPP (Figuur 3B). Het is ongeveer 5-9 keer hoger dan die in niet-resistente cellen. Onze vinden suggereert sterk dat de ATG-5 draagt ​​bij aan resistente van de GC-cellen.

Remming van ATG-5 gevoelig chemoresistent cellen om behandeling met geneesmiddelen

Om verder te bewijzen dat ATG-5 draagt ​​bij aan de geneesmiddelresistente van de GC cellen, gebruikten we kleine interfererende RNA's (siRNA's) om de expressie van ATG-5 knockdown. Drie siRNA's werden ontworpen. De real time PCR en Western blot resultaten toonden aan dat alle drie siRNA's remde de expressie van ATG-5 zowel mRNA en eiwitniveau (Figuur 4A en 4B). We kozen voor een, siRNA-ATG5-695, met hoog rendement knockdown het volgende experiment uitgevoerd. We knockdown ATG-5 expressie en vervolgens behandeld de cellen met DPP. Celproliferatie mogelijkheid werd onderzocht bij 0, 48 en 72 uur na behandeling. Onze resultaten toonden dat knockdowning ATG-5 had geen invloed celproliferatie in SGC7901 /DPP-cellen vergeleken met controle-siRNA (siRNA NC). DPP behandeling alleen iets remde de celproliferatie. Interessant, wanneer we knockdown de expressie van ATG-5 en de behandelde cellen met DPP tegelijkertijd het vermogen celproliferatie werd verder onderdrukt vergeleken met cellen behandeld met alleen DPP 48 en 72 uur na behandeling (figuur 4 C). Onze gegevens verdere ondersteuning dat ATG-5 draagt ​​de geneesmiddelresistente cellen van GC.

Autofagie was betrokken bij de geneesmiddelresistente cellen van DC

Al ATG-5 is een centrale regulator van autofagie, we gespeculeerd dat autofagie betrokken kan zijn bij de resistente van GC cellen. Daarom gebruikten we 3MA, die een Autofagie remmer, de geneesmiddelresistente cellen te behandelen. Zoals verwacht, vonden we dat 3MA met DPP behandeling met een soortgelijk effect ATG-5 kncokdown met DPP behandeling (figuur 4C en 4D) had. De gegevens tonen aan dat autofagie bijdraagt ​​aan de resistente. Vervolgens hebben we onderzocht of autofagieprocessen werd gewijzigd tijdens de behandeling. We gebruikten Immunofluorescentie assay LC3B expressieniveau, wat een Autofagie marker in de cellen te detecteren. Onze gegevens toonden aan dat autofagie werd onderdrukt na zwijgen ATG-5 of behandelen van de cellen met 3MA (figuur 5A). En western blot resultaat verder bevestigd dat LC3A /B eiwit expressie werd alleen beïnvloed in cellen behandeld met siRNA-ATG5 of 3MA. Dienovereenkomstig celproliferatie werd verder geremd wanneer autofagie werd geremd (figuur 4 en figuur 5). Daarom onze gegevens bleek dat ATG-5 was betrokken bij de drug resistente DC cellen, die voornamelijk door de was beïnvloeden autophagy van de kankercellen.

Discussie

GC blijft een van de meest voorkomende kwaadaardige tumoren op een wereldwijde basis, ondanks de afnemende incidentie en het totale aantal wordt voorspeld dat continu klimmen als gevolg van de groei van de bevolking. Bij mannen, GC rangschikt de tweede in sterftecijfer; bij vrouwen, is het vierde sterfte [24], [25]. De ruwe sterftecijfer van GC in China was 25,2 per 100 000 [26]. In onze studie onderzochten we de expressie van ATG-5 en MRP-1 in een cohort van GC patiënt na chemotherapie. Dan hebben we aangetoond dat de ATG-5 werd opgereguleerd in cisplatine (DDP) resistente cellijn. Verder na ATG-5 expressie of aotophogy werd geremd, de kankercellen werden gesensibiliseerd voor DPP behandeling. Onze resultaten nieuw inzicht in het mechanisme van chemoresistent GC progressie.

We evalueerden de exression profiel van ATG-5 en MRP-1 in 135 Chinese GC patiënten. In overeenstemming met eerdere rapport [22] Onze resultaten toonden dat een hoog percentage GC weefsels tot expressie ATG-5, en ATG-5 expressie werd statistisch geassocieerd met diepte van wand invasie en metastasen TNM stadia van GC. Deze bevindingen ondersteunen een begrip dat hoge expressie van ATG5 kan bijdragen tot op zekere hoogte een agressievere en kwaadaardige fenotype in GC. Dit standpunt wordt verder ondersteund door onze bevinding van de associatie tussen hoger ATG5 expressie in GC en slechtere prognose van patiënten (zie meer uitleg hieronder). Belangrijker identificeerden we een positieve correlatie tussen ATG-5 en MRP1 expressie in ons cohort GC. Gezien het feit dat MRP1 een transmembraan ABC transporteiwit algemeen bekend aan MDR fenotype in GC bevorderen, is het redelijk te stellen dat ATG-5 ook betrokken kan zijn bij het verlenen GC chemoresistance via bepaalde onbekende moleculaire mechanismen.

Het is algemeen aanvaard dat herhaling en metastase zijn twee belangrijke hindernissen in onze inspanningen om lage OS en DFS overlevingskans van GC te verbeteren. Chemoresistance blijft een van de belangrijkste redenen die leiden tot tumor herbevolking /recidief na de behandeling. Juiste keuze van de individuele behandeling zal wellicht wenselijk zijn om de klinische uitkomst te verbeteren; niettemin huidige behandelbeslissing is meestal afhankelijk van de TNM stadia [27], [28]. Overleven analysemethoden in 135 GC patiënten met stadium IB bij IV tumoren bleek dat zowel ATG-5 en MRP-1 expressie konden OS en DFS onafhankelijk voorspellen na behandeling met adjuvante ECF chemotherapie, suggereert dat de controle op de expressieniveaus in combinaties conventionele prognostische merkers kunnen ons aanvullende waardevolle informatie voor een betere evaluatie van chemotherapie effect bij patiënten GC. Interessant, vonden we de ATG-5 werd overexpressie in resistente GC cellijnen. En de mute-ATG-5 kan de drug resistente cellen tegen chemotherapie weer gesensibiliseerd. Onze gegevens suggereren dat ATG-5 doelwit voor chemoresistent paitents zijn.

Accumulerende studies tonen aan dat autofagie is geschikt om zowel celoverleving en celdood in verschillende contexten geactiveerd. Liu et al gemeld dat door remming van de PI3K /Akt /mTOR route zou β-elemeen beschermende autofagie GC cellen helpen beter aanpassen aan stressvolle omstandigheden en hen te beschermen tegen apoptotische dood [29] induceren. Daarnaast hebben recente studies aangetoond dat de PI3K /Akt /mTOR signaleringsroute continu geactiveerd menselijke maag tumoren [30]. De PI3K /Akt signalering moduleert ook MDR in GC cel door middel van de regulering van de p-glycoproteïne, Bcl2 en Bax [31]. Ook hebben sommige antikankermiddelen gerapporteerd dat mTOR signalering remmen en induceren autofagie in kankercellen door afbrekende vele belangrijke componenten in de mTOR-as [14], [32]. Samengevat suggereren deze gegevens dat autophagy kan worden geïnduceerd tijdens chemotherapie en onderdrukking van autofagocytische trajecten gebruik autofagieprocessen remmer potentieel om de chemotherapeutische effectiviteit bij patiënten met GC ATG-5 hoge expressie verbeteren. Ter ondersteuning vonden we dat wanneer autofagie werd geremd, de drug resistente cellen werden opnieuw gesensibiliseerd voor medicamenteuze behandeling als silencing ATG-5 expressie. Dus, ons resultaat ondersteuning autofagie bijdraagt ​​aan chemoresistente patiënt.

Samengevat overexpressie van ATG-5, een belangrijke moleculaire speler van Autofagie pathway, wordt gebruikt chemoresistance in GC. Expressie van ATG-5 en MRP-1 kan worden beschouwd als onafhankelijke prognostische merkers voor het voorspellen OS en DFS GC patiënten op basis van de huidige gegevens verkregen. Op basis van TNM stadia, kan de detectie van hun expressieniveaus klinisch significant betere voorspelling van chemotherapeutische behandelingsresultaten bij patiënten die lijden aan deze kwaadaardige ziekte. Toekomstige studies met betrekking tot de beoordeling van een groter aantal gevallen, bij voorkeur van een andere etnische achtergrond, zijn zeker gerechtvaardigd om onze bevindingen te bevestigen in deze studie.

• PLoS ONE: Vergelijking van de Operative Uitkomsten en Leren Curves tussen laparoscopische en Robotic Gastrectomie voor Gastric Cancer
• PLoS ONE: Voorspelling van maagkanker Development door Serum Pepsinogen Test en Helicobacter pylori Seropositiviteit in Oost-Aziaten: een systematische review en meta-Analysis