PLoS One: felülszabályozása autofágia-Kapcsolódó Gene-5 (ATG-5) társul kemorezisztenciájának Humán gyomorkarcinóma

absztrakt

autofágia összefüggő gén-5 (ATG-5) az egyik kulcsfontosságú szabályozói autofág sejthalál. Azt már széles körben tekinteni, mint egy védő molekuláris mechanizmust tumorsejtek során a kemoterápia. A jelen vizsgálatban, vizsgáltuk az expressziós mintázata ATG-5 és multidrog rezisztencia-asszociált protein-1 (MRP-1) 135 gyomor rák (GC) kezelt betegek epirubicin, ciszplatin és az 5-FU adjuváns kemoterápiát (ECF ) követően sebészi eltávolítását, és feltárni a potenciális klinikai jelentősége. Azt találtuk, hogy mindkét ATG-5 (77,78%) és az MRP-1 (79,26%) pedig nagymértékben expresszálódik GC betegeknél. ATG-5 expresszióját szignifikánsan összefüggött a mélysége fal invázió, TNM szakaszait és távoli metasztázis GC (P < 0,05), míg az MRP-1 expresszió szignifikánsan kapcsolódik a daganat mérete, mélysége fal invázió, nyirokcsomó-metasztázis, TNM szakaszában, és differenciálódás állapot (P < 0,05). ATG-5 expresszió pozitív korrelációt mutatott a MRP-1 (rp = 0,616, P < 0,01). Fokozott expressziója ATG-5 és MPR-1 szignifikáns korrelációt mutatott gyenge teljes túlélés (OS; P < 0,01) és betegségmentes túlélés (DFS; P < 0,01) a mi GC korosztály. Továbbá kimutattuk, hogy ATG-5 részt vett hatóanyag-rezisztens GC sejtek, amelyek főleg keresztül szabályozó autofágiát. Adataink arra utalnak, hogy serkentett expresszióját ATG-5, fontos molekuláris jellemzője védő autofágia, társul kemorezisztenciájának GC. Expression ATG-5 és az MRP-1 lehet független prognosztikai markerek GC kezelés. Katalógusa

Citation: Ge J, Chen Z, Huang J, Chen J, Yuan W, Deng Z, et al. (2014) felülszabályozása autofágia-Kapcsolódó Gene-5 (ATG-5) társul kemorezisztenciájának Humán gyomorrákban. PLoS ONE 9 (10): e110293. doi: 10,1371 /journal.pone.0110293 katalógusa

Szerkesztő: Pankaj K. Singh, University of Nebraska Medical Center, Amerikai Egyesült Államok katalógusa

Beérkezett: augusztus 5, 2014; Elfogadva: szeptember 18, 2014; Megjelent: október 17, 2014 katalógusa

Copyright: © 2014 Ge és mtsai. Ez egy nyílt hozzáférésű cikk feltételei szerint terjeszthető a Creative Commons Nevezd meg! Licenc, amely engedélyezi a korlátlan használatát, a forgalmazás és a reprodukció bármilyen adathordozón, feltéve, hogy az eredeti szerző és a forrás jóváírásra. Katalógusa

Az adatok elérhetősége: A szerzők megerősítik, hogy az összes adatot a megállapításokat alátámasztó teljes mértékben hozzáférhető, korlátozás nélkül. Minden lényeges adat a papírra. Katalógusa

Forrás: Ezt a munkát támogatott Nemzeti Természettudományi Alapítvány Hunan tartomány, Kína (No. 2012FJ6088). A finanszírozók nem volt szerepe a tanulmány tervezés, adatgyűjtés és elemzés, döntés, hogy közzéteszi, vagy a készítmény a kézirat. Katalógusa

Érdekütközés: A szerzők kijelentették, hogy nem ellentétes érdekek léteznek. Katalógusa

Bevezető

annak ellenére, hogy jelentősen visszaesett a saját előfordulási aránya a fejlett országokban, a gyomorrák (GC) továbbra is a negyedik leggyakrabban diagnosztizált rosszindulatú daganat, és a második vezető oka a rák összefüggő halálesetek világszerte [1]. Az elmúlt évtizedekben a hagyományos kombinált kezelési stratégiák együtt javasolt egyéb lehetőségek (pl D2 boncolás és adjuváns kemoterápia) nem sikerült gyógyítani a betegek jelentős hányada érintett GC, különösen azok számára, előrehaladott és áttétes betegség, rosszabb túlélési arány látszani valószínűleg a jelenléte kemorezisztencia a kezelés során [2]. Ezért, azonosítása új molekuláris események mögöttes fejlődésének ez a rosszindulatúság és rossz prognózissal valamint a megértés mechanizmusai GC kemorezisztencia sürgősen szükség van hatékonyabb klinikai beavatkozás és a jobb betegek kezelésében.

Fiziológiás körülmények között autofágia egy lizoszóma-függő önemésztő rendszer elsősorban felelős eltávolítására és újrahasznosítására a hosszú élettartamú proteinek és sérült /elavult intracellularorganelles fenntartása érdekében a sejt homeosztázisban [3]. A fehérjék és organellumok szánt pusztítás szekvesztrálódik belül "kettős-membrán" vacuolumok (autophagosomes), majd fúzió lizoszómákba építeni komplexek ismert autophagosomes, ahol a tartalom lebomlik lizoszómális hidrolázok [4]. Ezt igazolja, hogy a autofágiát lehetne indukált válaszként számos kedvezőtlen körülmények, beleértve a tápanyag-megvonást, oxidatív stressz vagy DNS károkat, és arra szolgál, mint egy adaptív sejt mechanizmus, végül lehetővé teszi a sejtek túlélését és szaporodik, míg kiterjedt vagy tartós autofágiát eredményeket sejthalál [ ,,,0],5]. Károsodások fiziológiai aktiválás, összeszerelés és funkciója a autofág útvonal már egyre inkább megfigyelhető sokféle humán rákok, bár a pontos szerepét a autofágia rák Genesis és progressziójában még mindig folyik a vita. Egyes adatok kedveznek az elképzelést, hogy autofágia elnyomja tumorigenezis, míg más bizonyítékok arra utalnak, hogy az autofágia képes kiváltani tumor iniciációs és védi a tumorsejtek apoptózisos [6]. Érdekes, gátlását autofágia nemrégiben találták, hogy fokozza a daganatellenes aktivitását több citotoxikus szerek. Li és munkatársai számoltak be, hogy autofágiát aktiválódott, mint egy védekező mechanizmus ellen celluláris hatások az 5-FU-kezelés és a gátlása autofágia 3-metiladenin fokozta az 5-FU által kiváltott apoptózist vastagbél rákos sejtekben [7], [8]. Másrészt, néhány rákellenes gyógyszerek (például cetuximab és dasatinib) mutattuk indukálni autofág sejthalál különböző mechanizmusok révén bizonyos rákos sejtekben [9] - [13]. A molekuláris gépezet, amely az autofágia szabályozza a túlélés vagy halál a daganatos sejtek nagyrészt ismeretlen eddig. Az autofágia útvonal egy igen-modulált dinamikus folyamat túlnyomórészt által végrehajtott autofágia kapcsolatos (ATG) gének családját, amely szabályozza számos kulcsfontosságú kinázok mTOR, PI3K /Akt, AMPK és MAPK [14], [15]. ATG-5 egy központi szabályozó szükséges autofágia szempontjából való részvételét autofagoszóma nyúlás [16]. Erőltetett expressziója ATG-5 érzékennyé tumorsejtek rákellenes gyógyszeres kezelés mind in vitro katalógusa és in vivo katalógusa; Ezzel szemben a siRNS-közvetített gátlását ATG-5 vezetett részleges rezisztenciát a kemoterápia [17].

A posztoperatív adjuváns kemoterápia jelenleg egy nagyobb kezelési GC; Mindazonáltal, az általános kemoterápia hatékonyságát továbbra is alacsony esetleg következtében jelenlétében többszörös gyógyszer-rezisztencia (MDR) fenotípussal. Eltérően más tumor entitások, kifejezése a klasszikus MDR-közvetítő molekulák, például glutation-S-transzferáz és multidrog rezisztencia gén 1 nem nagyon elterjedt a GC szövetekben, azt jelzi, hogy létezhet egy bonyolult mechanizmus a fejlesztési MDR ebben rosszindulatú betegség [ ,,,0],18]. Mint az egyik klasszikus gyógyszer-rezisztens mechanizmusok, multidrug resistance-associated protein 1 (MRP1 /ABCC1) már kiderült, hogy erősen expresszálódik a GC és így fejthet sarkalatos szerepet közvetítésében MDR GC [19], [20]. Ennek ellenére továbbra is ismert, hogy az MRP-1 expresszió társul ATG-5 expresszióját. És azt is, hogy az autofágia részt vesz chemoresistence GC betegeknél nem tisztázott. Katalógusa

A jelen tanulmányban először alkalmazott immunhisztokémiai, hogy vizsgálja meg expressziós profilját ATG-5 és MRP1 egy összegben 135 GC kapó betegek ECF (epirubicin, cisplatin és 5-FU) adjuváns kemoterápiát követően sebészi eltávolítását. A közötti korrelációk ATG-5 és az MRP-1 expresszióját, valamint ezek expressziója különböző klinikopatológiai jellemzői a GC és a klinikai eredmények is vizsgálták.

Anyagok és módszerek

Betegek és szövetminták

az összesen 135 GC betegek álló 91 hím és 44 nőstény műtéten átesett Tanszékén gasztrointesztinális sebészet, Xiangya Kórház, Közép-Dél Egyetem (CSU), Kína között január 1, 2007 és 31 december 2008 beteget vontak be ez a tanulmány. Az átlagéletkor a korosztály volt 53,62 ± 9,73 év, és egy sor, 26 és 72 Theprimary GC tumor tissuesand párosított nem rákos (NC) szövetek található legalább 5 cm-re a tumor magjában kaptuk műtéti eltávolítása után azonnal feldolgozott és tárolni a további felhasználásig. Egyik felvett betegnél a kemoterápia vagy sugárkezelés előtt műtét. A kórszövettani diagnózis végeztük a műtét előtt és a műtét megerősítette. Minden résztvevő stádiumú IB IV daganatok kapott ECF kemoterápia a műtét után (dózis: epirubicin 50 mg /m ^{2 az 1. napon, a ciszplatin 60 mg /m 2 az 1. napon, és folyamatos intravénás infúzió az 5-FU 500 mg /m 2 /d 4 napig, amit 3 hetenként megismételtek legfeljebb 24 hétig). A klinikai jellemzőit ezeket a betegeket az 1. táblázatban felsorolt ​​katalógusa}

Minden esetben a tanulmányban vizsgálták át és minden mintákat szövettanilag vizsgáljuk, a 2012. október mélysége fal invázió, a regionális nyirokcsomó áttét, és szövettani grade megerősítette az azonos csoportba a két tapasztalt vezető patológusok. A betegek kategorizált alapuló differenciálás állapotát a daganatsejtek három szövettani fokozat:, a mérsékelt és a rossz. Kombinációján alapul a helyi-regionális tumor bevonása és a jelenléte áttét, minden esetben került színre szerint TNM osztályozása rosszindulatú daganatai (TNM) szakaszban csoportosulás [21]. Az elemzéshez a túlélés, a működtetés dátumát használták, hogy képviselje a kiindulási pont a nyomon követési látogatást. Elhunyt betegeket más betegségek helyett GC vagy egyéb váratlan események kizárták az ügy gyűjtemény. A halál oka toborzott ebben a vizsgálatban súlyosbodását GC. A teljes túlélés (OS) kiszámítása a határidő attól a naptól az első műtét, hogy a halál időpontját, illetve a dátumot az utolsó nyomon követés a végpont. A betegségmentes túlélés (DFS) volt az az idő intervallum a műtét időpontjáig helyi kiújulás, illetve az első távoli szervi áttétek. Tájékozott írásos beleegyezésüket adták Minden beteg a műtét előtt, és ez a tanulmány által jóváhagyott Kutatásetikai Bizottsága Közép-Dél Egyetem, Kína. Minden mintát kezelték és névtelenek szerint az etikai és jogi iránymutatások. Katalógusa

Az immunhisztokémiai katalógusa

A friss mintákat 10% -os, neutrális formalinban később beágyazott paraffin. A paraffinba ágyazott szövetek vágtunk 4 um, majd paraffint xilollal eltávolítjuk és rehidratált további H &E vagy peroxidáz immunhisztokémiai festéssel segítségével a DAKO EnVision rendszer. Röviden, a következő proteolitikus emésztéssel, és blokkolja az endogén peroxidáz, szöveti metszeteket a primer antitestekkel (ATG5: ab54033; MRP1: ab32574; ABCAM Inc., Cambridge, Egyesült Királyság) ellen illető célfehérjék hígításban 1:500 éjszakán át 4 ° C-on. Mosás után PBS-sel, peroxidázzal jelölt polimer és a szubsztrát-kromogén ezután érdekében alkalmazott, hogy szemléltesse a immnohistochemical festéssel. Végül metszeteket hematoxilinnel ellenfestettük, fedél csúszott szerelési közepes és fénymikroszkóppal vizsgáltuk. Összes eljárást végeztük a Department of Pathology, Xiangya Hospital, C.S.U. A metszeteket értelmezni függetlenül két gyakorlott patológusok, akik vakok a betegek adatait. Meghatároztuk festődés intenzitása és festődött sejtek százalékos arányát egy korábban leírt megközelítés [22], [23]: a százalékos pozitívan festődő sejtek (0% -100%) megszoroztuk a domináns intenzitás mintázatának festődés, figyelembe véve az 1. negatív vagy nyomon követni, 2 gyenge, 3-as és 4-mérsékelt, mint erős. Ezért a teljes pontszám paraméter 0 és 400 között betegeket ezután sorolható négy különböző alcsoportokban: pontszám 0-99, pontszám 100-199, 200-299 pontszám és a pontszám 300-400. Katalógusa

Western blot analízis

Teljes sejtextraktumokat készítettünk 0,14 M NaCl, 0,2 M trietanol-amin, 0,2% nátrium-dezoxikolát, 0,5% Nonidet P-40 és kiegészített egy proteáz inhibitor (az összes termék a Sigma, St. Louis, Missouri , USA). Ezután fehérje mintát végigmenni egy 12% -os nátrium-dodecil-szulfát-poliakrilamid gél elektroforézissel (SDS-PAGE) gélen és átvisszük egy membrán. Az átvitt membránokat ezt követően egy éjszakán át inkubáljuk 4 ° C-on egy primer antitesttel. Mosás után a membránt egy torma-peroxidáz (HRP) -kötésű másodlagos ellenanyaggal 1 órán át szobahőmérsékleten keverjük. Az elsődleges ellenanyagként anti-ATG-5 (Santa Cruz, CA, USA), anti-LC3A /B (ABCAM, Cambridge, Egyesült Királyság) és anti-β-aktin (Santa Cruz, CA, USA). Minden közölt eredmények az átlagos aránya a három különböző független kísérlet során.

Cell proliferációs vizsgálati

sejtet oltunk 96 mérőhelyes lemezekre (10000 sejt /üreg) 24 órán kezelés előtt. MTT assay-ket értékeléséhez használt sejtproliferáció különböző időpontokban a kezelés után. Az MTT assay-t a következők szerint: MTT-t adtunk minden egyes üreghez, és a lemezeket inkubáljuk 37 ° C hőmérsékleten 4 órán át. Az MTT közegben elegyet ezután eltávolítjuk, és 150

• PLoS One: Összehasonlítás az Operatív eredmények és a tanulási görbék között laparoszkópos és Robot gastrectomián gyomor Cancer
• PLoS One: Jóslás a gyomorrák Development által szérum Pepszinogén Test és Helicobacter pylori Szeropozitivitás kelet-ázsiaiak: rendszeres felülvizsgálatát és meta-Analysis