PLOS ONE: La régulation positive de autophagie liés Gene-5 (ATG-5) est associée à une chimiorésistance dans Human gastrique Cancer

Résumé

autophagie liées au gène 5 (ATG-5) est l'un des principaux régulateurs de la mort cellulaire autophagique. Il a été généralement considérée comme un mécanisme moléculaire de protection pour les cellules tumorales au cours de la chimiothérapie. Dans la présente étude, nous avons étudié le profil d'expression de l'ATG-5 et multirésistance-associated protein-1 (MRP-1) dans 135 cancers gastriques (GC) patients qui ont été traités par l'épirubicine, cisplatine et chimiothérapie adjuvante 5-FU (ECF ) après résection chirurgicale et exploré leur signification clinique potentielle. Nous avons trouvé que les deux ATG-5 (77.78%) et MRP-1 (79,26%) ont été fortement exprimés chez les patients du GC. ATG-5 expression était significativement associée à la profondeur de l'invasion de la paroi, les stades TNM et métastases à distance du GC (P < 0,05), alors que MRP-1 expression était significativement liée à la taille de la tumeur, la profondeur de l'invasion de la paroi, métastases ganglionnaires, stade TNM et état de différenciation (P < 0,05). ATG-5 expression est positivement corrélé avec MRP-1 (rp = 0,616, P < 0,01). L'expression accrue de l'ATG-5 et MPR-1 était significativement corrélée avec la survie globale médiocre (OS; P < 0,01) et la survie sans maladie (DFS; P < 0,01) de notre cohorte de GC. De plus, nous avons démontré que l'ATG-5 a été impliqué dans des cellules résistantes du GC, ce qui était principalement par régulation autophagie drogue. Nos données suggèrent que l'expression régulée positivement d'ATG-5, une caractéristique moléculaire importante de l'autophagie de protection, est associée à la chimiorésistance en GC. Expression de l'ATG-5 et MRP-1 peut être des marqueurs pronostiques indépendants pour le traitement de GC

Citation:. Ge J, Chen Z, Huang J, Chen J, Yuan W, Deng Z, et al. (2014) de régulation positive autophagie liés Gene-5 (ATG-5) est associée à une chimiorésistance dans le cancer gastrique humain. PLoS ONE 9 (10): e110293. doi: 10.1371 /journal.pone.0110293

Editeur: Pankaj K. Singh, University of Nebraska Medical Center, Etats-Unis d'Amérique

Reçu: 5 Août 2014; Accepté le 18 Septembre 2014; Publié le 17 Octobre, 2014

Droit d'auteur: © 2014 Ge et al. Ceci est un article en accès libre distribué sous les termes de la licence Creative Commons Attribution, qui permet une utilisation sans restriction, la distribution et la reproduction sur tout support, à condition que l'auteur et la source originelle sont crédités

Disponibilité des données:. La auteurs confirment que toutes les données sous-jacentes les résultats sont entièrement disponibles sans restriction. Toutes les données pertinentes sont dans le papier

Financement:. Ce travail a été soutenu par le National Natural Science Foundation de la province du Hunan, en Chine (n ° 2012FJ6088). Les bailleurs de fonds ont joué aucun rôle dans la conception de l'étude, la collecte et l'analyse des données, la décision de publier, ou de la préparation du manuscrit

Intérêts concurrents:.. Les auteurs ont déclaré aucun conflit d'intérêts existent

Introduction

Malgré une baisse considérable de son taux d'incidence dans de nombreux pays développés, le cancer gastrique (GC) reste le quatrième cancer le plus souvent diagnostiqué et la deuxième cause de décès liés au cancer dans le monde [1]. Au cours des dernières décennies, les stratégies de traitement multimodaux standards ainsi que d'autres options recommandées (par exemple D2 dissection et la chimiothérapie adjuvante) ont échoué à guérir une grande proportion de patients atteints de GC, en particulier pour les personnes souffrant de maladies avancées et métastatiques, avec le pire taux de survie étant vu probablement à cause de la présence d'une chimiorésistance au cours du traitement [2]. Par conséquent, l'identification des événements moléculaires qui sous-tendent le développement de cette tumeur maligne et son mauvais pronostic, ainsi que la compréhension des mécanismes de GC chimiorésistance sont nécessaires de toute urgence pour une intervention clinique plus efficace et une meilleure gestion des patients.

Dans les conditions physiologiques, autophagie est un système d'auto-digestion lysosome dépendant principalement responsable de l'enlèvement et le recyclage des protéines à long terme et endommagé /intracellularorganelles obsolètes afin de maintenir l'homéostasie cellulaire [3]. Les protéines et organelles destinés à la destruction sont séquestrés dans les vacuoles "double membrane" (autophagosomes), suivie par la fusion avec les lysosomes pour construire des complexes connus sous le nom autophagosomes, où les contenus sont dégradés par hydrolases lysosomales [4]. Il a été démontré que l'autophagie pouvait être induite en réponse à de nombreuses conditions défavorables, y compris une carence en nutriments, le stress oxydatif ou dommages de l'ADN et sert de mécanisme cellulaire adaptative, permettant finalement aux cellules de survivre et de proliférer, alors que les résultats étendus ou persistants autophagie dans la mort cellulaire [ ,,,0],5]. Déficiences dans l'activation physiologique, l'assemblage et la fonction de la voie autophagique ont été de plus en plus observée dans une grande variété de cancers humains, bien que le rôle exact joué par autophagie dans la genèse du cancer et de la progression est encore sous la controverse. Certaines données favorisent l'idée que l'autophagie supprime la tumorigenèse, alors que d'autres preuves suggèrent que l'autophagie est capable de déclencher l'initiation de la tumeur et protège les cellules tumorales de subir l'apoptose [6]. Chose intéressante, l'inhibition de autophagy a récemment été trouvée pour améliorer l'activité anti-tumorale de plusieurs agents cytotoxiques. Li et ses collègues ont rapporté que autophagy a été activé comme un mécanisme de protection contre les effets cellulaires du 5-FU le traitement et l'inhibition de autophagy par le 3-méthyladénine augmenté l'apoptose 5-FU induit dans les cellules cancéreuses du colon [7], [8]. D'autre part, certains médicaments anticancéreux (par exemple, cétuximab et le dasatinib) a été démontrée à induire la mort cellulaire par différents mécanismes autophagic dans certaines cellules cancéreuses [9] - [13]. Le mécanisme moléculaire par lequel autophagie régule la survie ou la mort des cellules néoplasiques reste largement obscure jusqu'ici. La voie de l'autophagie est un processus très modulé dynamique principalement exécuté par le lié autophagie (ATG) famille de gènes, qui est régie par plusieurs kinases clés, y compris mTOR, PI3K /Akt, AMPK et MAPK [14], [15]. ATG-5 est un régulateur central nécessaire à l'autophagie en termes de son implication dans l'allongement autophagosome [16]. expression forcée de ATG-5 cellules tumorales sensibilisées aux anticancéreuses traitement de la toxicomanie à la fois in vitro
et in vivo
; en revanche l'inhibition de l'ATG-5 siRNA médiation a conduit à une résistance partielle à la chimiothérapie [17]

chimiothérapie adjuvante post-opératoire est actuellement un traitement majeur pour GC. Cependant, l'efficacité globale de la chimiothérapie reste faible possible en raison de la présence de la multirésistance aux médicaments (MDR) phénotype. Contrairement à d'autres entités tumorales, l'expression des molécules de MDR-médiatrices classiques tels que la glutathion-S-transférase et polychimiothérapie gène de résistance à 1 ne sont pas très répandus dans les tissus du GC, ce qui indique qu'il pourrait exister un mécanisme compliqué pour le développement de la tuberculose dans cette pathologie maligne [ ,,,0],18]. Comme l'un des mécanismes résistant aux médicaments classiques, multirésistance-associated protein 1 (MRP1 /ABCC1) a été trouvé pour être fortement exprimée en GC et peut donc exercer un rôle essentiel dans la médiation de MDR dans GC [19], [20]. Cependant, on ne sait pas si MRP-1 expression est associée à ATG-5 expression. Et aussi si l'autophagie est impliqué dans chemoresistence chez les patients du GC est pas claire.

Dans la présente étude, nous avons d'abord employé immunohistochimie pour étudier le profil d'expression de l'ATG-5 et MRP1 dans une somme de 135 patients du GC qui ont reçu ECF (épirubicine, cisplatine et le 5-FU) chimiothérapie adjuvante après résection chirurgicale. Les corrélations entre ATG-5 et MRP-1 expression ainsi que leur expression avec différentes caractéristiques clinico des résultats du GC et cliniques ont également été évalués.

Matériel et méthodes

Patients et échantillons de tissus

Un total de 135 patients du GC comprenant 91 hommes et 44 femmes ayant subi une chirurgie au Département de chirurgie gastro-intestinale, Hôpital Xiangya, Central South University (CSU), la Chine, entre le 1er Janvier 2007 et le 31 Décembre 2008 ont été inscrits dans cette étude. L'âge moyen de la cohorte était 53,62 ± 9,73 ans, avec une gamme de 26 à 72. Theprimary GC tumeur tissuesand appariés (NC) tissus non cancéreux situés au moins 5 cm de la base de la tumeur ont été obtenus après résection chirurgicale et immédiatement traitées et conservé jusqu'à utilisation ultérieure. Aucun des patients recrutés était chimiothérapie ou une radiothérapie avant l'intervention chirurgicale. Le diagnostic histopathologique a été réalisée en préopératoire et confirmé par la chirurgie. Tous les participants de stade IB à IV tumeurs ont reçu une chimiothérapie ECF après la chirurgie (Dose: épirubicine 50 mg /m ^{2 le jour 1, le cisplatine 60 mg /m 2 le jour 1 et une perfusion intraveineuse continue de 5-FU 500 mg /m 2 /j pendant 4 jours, répété toutes les 3 semaines jusqu'à 24 semaines). Les caractéristiques cliniques de ces patients ont été répertoriés dans le tableau 1.}

Tous les cas dans cette étude ont été examinés et tous les échantillons ont été histopathologique réexaminés en Octobre 2012. La profondeur de l'invasion de la paroi, métastase ganglionnaire régionale, et grade histologique ont été confirmés par le même groupe de deux pathologistes supérieurs expérimentés. Les patients ont été classés en fonction de l'état de différenciation des cellules cancéreuses en trois grades histologiques: ainsi, modérée et pauvres. Sur la base d'une combinaison de la participation de la tumeur loco-régionale et la présence de métastases, tous les cas ont été organisées selon la classification TNM des tumeurs malignes (TNM) groupement de scène [21]. Pour l'analyse de la survie, la date de l'opération a été utilisée pour représenter le point de la visite de suivi début. Les patients qui sont morts d'autres maladies plutôt que GC ou d'autres événements imprévus ont été exclus de la collecte de cas. La cause du décès recrutés dans cette étude était l'aggravation de GC. La survie globale (OS) a été calculé comme une période à partir de la date de la chirurgie initiale à la date du décès, ou la date du dernier suivi comme point final. La survie sans maladie (DFS) a été définie comme étant l'intervalle de la chirurgie du temps jusqu'à ce que la date de rechute locale ou de la première métastase d'organes éloignés. le consentement écrit a été obtenu à partir de chaque patient avant une intervention chirurgicale et cette étude a été approuvée par le Comité d'éthique de la recherche de l'Université centrale du Sud, la Chine. Tous les échantillons ont été traités et rendus anonymes selon les lignes directrices éthiques et juridiques.

immunohistochimie

Les échantillons frais ont été fixés dans 10% du formol tamponné neutre et ensuite intégrés avec de la paraffine. Les tissus inclus dans la paraffine ont été coupées à 4 um, puis déparaffinées avec du xylene et réhydratées pour de plus amples H & E ou la peroxydase de coloration immunohistochimique à l'aide du système DAKO EnVision. En bref, après digestion protéolytique et blocage avec la peroxydase endogène, les lames de tissus ont été incubés avec les anticorps primaires (ATG5: ab54033; MRP1: ab32574; Abcam Inc., Cambridge, Royaume-Uni) contre les protéines cibles respectives à une dilution de 1:500 nuit à 4 ° C. Après un lavage avec du PBS, la peroxydase de polymère marqué et le substrat chromogène ont ensuite été utilisés pour visualiser la coloration immnohistochemical. Enfin, les sections ont été colorées avec de l'hématoxyline, couverture-glissé avec un milieu de montage, et examiné par microscopie optique. Toutes les procédures ont été effectuées au Département de pathologie, Hôpital Xiangya, C.S.U. Les lames ont été interprétées de façon indépendante par deux pathologistes expérimentés, qui étaient aveugles à l'information des patients. Nous avons quantifié intensité de la coloration et le pourcentage de cellules colorées en utilisant une approche décrite précédemment [22], [23]: le pourcentage de cellules colorées positivement (0% -100%) a été multiplié par le motif d'intensité dominante de coloration, considérant 1 comme négatif ou tracer, 2 comme faible, 3 modérée et 4 aussi forte. Par conséquent, le score global varie de 0 à 400. Les patients ont ensuite été classés en quatre sous-groupes différents: Score 0-99, score 100-199, score 200-299 et le score de 300-400

Western blot <. br>

extraits cellulaires entiers ont été préparés en utilisant 0,14 M de NaCl, 0,2 M de triethanolamine, le désoxycholate de sodium à 0,2%, 0,5% de Nonidet P-40 et additionné d'un inhibiteur de protéase (tous les produits proviennent de chez Sigma, St. Louis, Missouri , ETATS-UNIS). Ensuite, l'échantillon de protéine a été effectuée à travers un gel de dodécylsulfate de sodium à 12% électrophorèse sur gel de polyacrylamide (SDS-PAGE) et transféré sur une membrane. Les membranes ont ensuite été transférées incubées pendant une nuit à 4 ° C avec un anticorps primaire. Après lavage, la membrane a été incubée avec une peroxydase de raifort (HRP) liés en anticorps secondaire pendant 1 h à température ambiante. Les anticorps primaires étaient anti-ATG-5 (Santa Cruz, CA, USA), anti-LC3A /B (Abcam, Cambridge, Royaume-Uni) et anti-β-actine (Santa Cruz, CA, USA). Tous les résultats rapportés sont les ratios moyens de trois expériences indépendantes différentes.

La prolifération cellulaire test

Les cellules ont été ensemencées sur des plaques à 96 puits (10000 cellules /puits) pendant 24 h avant le traitement. dosages MTT ont été utilisés pour évaluer la prolifération cellulaire à différents points de temps après le traitement. L'essai MTT a été effectué comme suit: on a ajouté du MTT à chaque puits et les plaques ont été incubées à 37 ° C pendant 4 h. Le mélange milieu MTT a été ensuite éliminé et 150 ul de diméthylsulfoxyde (DMSO) ont été ajoutés à chaque puits. L'absorbance a été mesurée à 570 nm en utilisant un spectrophotomètre multiplis

ARN interférence

duplexes siARN ciblant ATG-5 ont été synthétisés comme suit: siRNA-ATG5-486:. GACGUUG GUAACUGACAAATT; ARNsi-ATG5-695: GUCCAUCUAAGGAUGCAAUTT et l'ARNsi-ATG5-938: GACCUUUCAUUCAGAAGCUTT. duplex siARN contenant des séquences non spécifiques ont été utilisées comme contrôle négatif (NC): UUCUCCGAACGUGUCACGUTT. Différents ARNsi ont été transfectés séparément dans des cellules en utilisant le réactif Lipofectamine 2000 et le milieu a été remplacé 6 h après la transfection.

en temps réel RT-PCR

ARN total à partir de la cellule des lignes et des tissus étaient extrait en utilisant le réactif Trizol (Invitrogen, Carlsbad, Etats-Unis), conformément aux instructions du fabricant. La concentration d'ARN a été mesurée à l'aide d'un spectrophotomètre. Un pool d'ADNc a été synthétisé en utilisant 1 ug d'ARN total et TaqMan inversée Réactifs Transcription (Applied Biosystems, Foster City, USA) comme décrit par le fabricant. L'expression du gène cible a été évaluée en utilisant une approche de quantification relative (2 ^{-ΔΔCt méthode) avec β-actine comme référence interne.}

immunofluorescence

Les cellules ont été perméabilisées avec 0,3 % de Triton X-100 pendant 10 min suivie d'une fixation avec 2-4% méthanal pendant 15 min, et bloquées avec du sérum de mouton 3% à la température ambiante pendant 60 min. Puis, sondé avec des anticorps primaires anti-LC3B (Santa Cruz, CA, USA) pendant une nuit à température ambiante, et les cellules ont été lavées trois fois avec du PBS. Stained avec Alexa Fluor 488 488 conjugué de lapin anti-IgG de chèvre pendant 1 h à température ambiante, puis les cellules ont été lavées trois fois avec PBS. Les noyaux ont été visualisés par coloration avec du DAPI (Sigma, USA) pendant 2 min. Les cellules colorées ont été observées avec un microscope à fluorescence inversée.

L'analyse statistique

Toutes les analyses statistiques ont été réalisées avec le logiciel SPSS 15.0 pour Windows (SPSS Inc., Chicago, IL, USA). Les données quantitatives ont été présentées comme moyenne ± SD. Le χ de Pearson ^{2 test a été utilisé pour comparer la différence entre les données classées, tandis que l'un essai-Way-ANOVA a été réalisée pour comparer la différence entre les données quantitatives. Les analyses de survie ont été effectuées en utilisant la méthode de Kaplan-Meier et comparées par le test du log-rank. Le modèle de Cox-régression a été réalisée afin d'évaluer le rapport de risque indépendant de chaque variable dans l'analyse multivariée. La corrélation entre ATG5 et MRP1 expression a été examinée à l'aide de corrélation bivariées (Pearson) test. Les différences ont été considérées comme statistiquement significatives lorsque P
valeurs étaient inférieures à 0,05.}

Résultats

Expression d'ATG-5 et MRP-1 en GC

Le profil d'expression et la localisation des ATG-5 et MRP-1 chez nos patients du GC, qui ont été traités par l'épirubicine, cisplatine et chimiothérapie adjuvante 5-FU (ECF) après résection chirurgicale, ont été examinés en utilisant une analyse immunohistochimique. Parmi les 135 échantillons de GC, 105 (77,78%) étaient positifs pour ATG-5 immunoréactivité, et 107 (79,26%) étaient MRP-1 positive. Comme cela est représenté sur la figure 1, nous avons constaté que ATG5 a été exprimé de manière prédominante dans le cytoplasme. De plus, la surexpression d'ATG-5 était positivement corrélée à celle du MRP-1 en GC. (R = 0,616, P
< 0,001), tel que révélé par le test de corrélation bivariées. L'expression positive dans les tissus non cancéreux étaient adjacents 113 (83,70%) pour l'ATG 5 et 89 (65,93%) pour MRP-1. Les données ont montré que les deux ATG-5 et MRP-1 ont été exprimés de façon positive dans le cancer et les non-cancéreuses tissus, qui suggèrent que ATG-5 et MRP-1 peuvent être induits par la chimiothérapie dans les deux tissus tumoraux et non tumoraux. Comme tous nos échantillons de patients ont été traités avec une chimiothérapie ECF, et nous avons trouvé que les deux ATG-5 et MRP-1 ont été fortement exprimé et une corrélation positive dans ces échantillons. Pendant ce temps, l'étude précédente indique que MRP-1 peut-être associée à une résistance multi-drogue en GC. Ensemble avec la conclusion précédente, nos résultats suggèrent que l'ATG-5 et MRP-1 peuvent être impliqués dans la chimiorésistance chez les patients du GC.

Les associations entre l'expression d'ATG-5 ou MRP-1 et les caractéristiques clinico de GC

Les associations de l'ATG-5 et MRP1 expression avec différents paramètres clinico de GC sont présentés dans le tableau 1 et le tableau 2, respectivement. Expression de l'ATG-5 a été associée de manière significative avec la profondeur de l'invasion de la paroi, des métastases à distance et les stades TNM de GC ( P
< 0,001, P
= 0,018, P
< 0,001 respectivement). MRP-1 expression était significativement associée à une taille accrue de la tumeur, la profondeur de l'invasion de la paroi, ganglions lymphatiques régionaux métastases, stades TNM ( P
= 0,032, P
< 0,001, P = 0,016, P < 0,001, respectivement) et de l'état de différenciation ( P
= 0,005). Pour déterminer davantage la participation o f ATG-5 et MRP-1 dans le développement de GC, nous avons effectué une analyse de survie au sein de nos échantillons de patients. Notre survie analyses ont démontré que le taux global de survie globale (OS) de notre cohorte de GC était de 43.70% avec une survie moyenne de 39.849 mois (IC à 95%, 35.636-44.061 mois); tandis que la survie sans maladie (DFS) taux était de 34,07% avec une survie moyenne de 35.802 mois (IC à 95%, 31.618-39.986 mois). Nous avons ensuite classé les patients en quatre sous-groupes différents selon les scores de coloration immunohistochimique. L'analyse de survie de Kaplan-Meier a révélé une ATG-5 expression plus élevée était significativement associée à OS les plus pauvres ( P
< 0,001) et DFS ( P
= 0,003). Des comparaisons par paires ont indiqué que les patients portant le ATG-5 expression la plus élevée (scores 300-400) ont eu les taux de survie les plus pauvres par rapport à celle des autres sous-groupes (figure 2A et 2B). Systématiquement, upregulated MRP-1 expression a été trouvée significativement associée à un mauvais système d'exploitation ( P
= 0,001) et DFS ( P
= 0,018) de nos patients du GC. Le sous-groupe avec les scores les plus élevés d'expression de MRP1 (0-99) semblait avoir le plus mauvais pronostic (figure 2C et 2D) en comparaison avec d'autres sous-groupes. Nos données montrent également qu'il y avait une corrélation significative entre les stades TNM et la survie des patients atteints de GC. Les patients de stade III et IV tumeurs apparaissent moins bon pronostic par rapport à ceux hébergeant stade IB et II tumeurs ( P < 0,01
) (Figure 2E et 2F). Plus intéressant, le modèle risque de régression multivariée de Cox a démontré que ATG-5 et MRP-1 niveaux d'expression et stades TNM étaient tous les indicateurs pronostiques indépendants et significatifs pour prédire l'OS ( P
= 0,037, P
= 0,005, P
< 0,001 respectivement) et DFS ( P
= 0,004, P
= 0,008, P
< 0,001 respectivement) GC (voir le tableau 3). Nos données indiquent l'ATG-5 et MRP-1 ont été étroitement liés au développement de GC et peuvent servir de marqueurs de pronostic comme pauvres dans le traitement du GC.

ATG-5 a été significativement régulée positivement dans les cellules chimiorésistantes

Pour explorer davantage le rôle de l'ATG-5 dans la tumorigenèse et résistant aux médicaments. Nous avons détecté l'expression de la protéine dans plusieurs lignées cellulaires de cancer gastrique (AGS, BGC-832, SGC7901, SGC7901 /DPP et MKN45) et dans une lignée immortalisée gastrique humaine des cellules épithéliales de la muqueuse (GES). Chose intéressante, nous avons constaté que l'ATG-5 a été considérablement surexprimé dans une lignée cellulaire résistante à la DPP, les cellules SGC7901 /DPP, par rapport à toutes les autres lignées cellulaires qui comprennent des cellules DPP SGC7901 sensibles (figure 3A). Nous avons en outre confirmé que les cellules SGC7901 /DPP sont résistantes au traitement DPP. L'IC 25, IC50 et IC75 étaient 15,4 uM, 38,7 uM et 93.53 uM dans SGC7901 cellules. En revanche, le circuit intégré 25, IC50 et IC75 sont 120,03 uM, 271,9 et 423,7 pM pM dans SGC7901 /DPP (figure 3B). Il est d'environ 5 à 9 fois plus élevée que dans les cellules non résistantes aux médicaments. Notre recherche suggère fortement que ATG-5 contribue à résistant à des cellules du GC médicament.

L'inhibition de cellules chimiorésistantes ATG-5 sensibilisées à un traitement médicamenteux

Pour prouver en outre que l'ATG-5 contribue à la résistant à des cellules GC médicament, on utilise de petits ARN interférents (ARNsi) pour knockdown l'expression de l'ATG-5. Trois siRNA ont été conçus. Notre PCR en temps réel et les résultats du Western blot a montré que les trois ARNsi inhibe l'expression de l'ATG-5 à la fois de l'ARNm et des protéines (Figure 4A et 4B). Nous avons choisi un, siRNA-ATG5-695, avec la plus grande efficacité de knockdown pour effectuer l'expérience suivante. Nous knockdown ATG-5 expression et ensuite traité les cellules avec DPP. la capacité de prolifération cellulaire a été examiné à 0, 48 et 72 heures après le traitement. Nos résultats ont montré que knockdowning ATG-5 n'a pas affecté la prolifération cellulaire dans des cellules SGC7901 /DPP par rapport au siRNA contrôle (siARN NC). le traitement de la DPP seul légèrement inhibé la prolifération des cellules. Fait intéressant, quand on knockdown l'expression de l'ATG-5 et traité les cellules avec de la DPP en même temps, la capacité de prolifération des cellules a en outre été supprimées par rapport aux cellules traitées avec la DPP seul 48 et 72 heures après le traitement (figure 4 C). Nos données confirment en outre que ATG-5 contribue à résistant à des cellules GC du médicament.

autophagie a été impliqué dans des résistants DC cellules
le médicament

ATG-5 est un régulateur central de l'autophagie, nous avons spéculé que autophagy peut être impliquée dans des cellules résistantes GC du médicament. Nous avons donc utilisé 3MA, qui est un inhibiteur de l'autophagie, pour traiter les cellules résistantes aux médicaments. Comme on s'y attendait, nous avons constaté que le traitement avec 3MA DPP a eu un effet similaire avec l'ATG-5 kncokdown conjointement avec le traitement de la DPP (figure 4C et 4D). Les données démontrent que autophagy contribue résistant au médicament. Ensuite, nous avons examiné si autophagy a été changé au cours du traitement. Nous avons utilisé dosage immunofluorescence pour détecter le niveau d'expression de LC3B, qui est un marqueur de l'autophagie dans les cellules. Nos données montrent que autophagy a été supprimé après silençage ATG-5 ou le traitement des cellules avec 3MA (figure 5A). Et résultat western blot a également confirmé que l'expression des protéines LC3A /B n'a été affectée dans les cellules traitées avec le siRNA-ATG5 ou 3MA. Par conséquent, la prolifération cellulaire a été inhibée en outre que lorsque autophagy a été inhibée (figure 4 et figure 5). Par conséquent, nos données ont révélé que ATG-5 a été impliqué dans le médicament résistant à des cellules DC, qui a été principalement par le biais affecte l'autophagie des cellules cancéreuses.

Discussion

GC reste l'un des plus tumeurs malignes fréquentes sur une base mondiale, en dépit de sa baisse de l'incidence et le nombre total est prédit à monter en continu en raison de la croissance démographique. Chez les hommes, GC se classe au deuxième taux de mortalité; chez les femmes, il est le quatrième de la mortalité [24], [25]. Le taux brut de mortalité de GC en Chine était de 25,2 pour 100 000 [26]. Dans notre étude, nous avons examiné l'expression d'ATG-5 et MRP-1 dans une cohorte de GC patient après la chimiothérapie. Ensuite, nous avons démontré que ATG-5 a été régulée à la hausse dans le cisplatine (DDP) lignée cellulaire résistante. En outre, après ATG 5 l'expression ou aotophogy est inhibée, les cellules cancéreuses ont été sensibilisés au traitement de la DPP. Nos résultats fournissent un nouvel éclairage sur le mécanisme de chimiorésistance dans la progression du GC.

Nous avons évalué le profil de exression d'ATG-5 et MRP-1 dans 135 patients du GC chinois. Dans un accord avec le rapport précédent [22], nos résultats ont montré qu'un pourcentage élevé de tissus GC exprimé ATG-5, et ATG-5 expression est statistiquement associée à la profondeur de l'invasion de la paroi, des métastases à distance et les stades TNM de GC. Ces résultats soutiennent la notion que le niveau de ATG5 élevé d'expression peut contribuer à une certaine mesure, un phénotype plus agressif et maligne dans GC. Ce point de vue est appuyé par notre constatation de l'association entre supérieur expression ATG5 en GC et les plus pauvres pronostic des patients (voir plus loin). Plus important encore, nous avons identifié une corrélation positive entre ATG-5 et MRP1 expression dans notre cohorte de GC. Considérant le fait que MRP1 est une protéine de transport transmembranaire ABC bien connu pour promouvoir le phénotype MDR en GC, il est raisonnable de proposer que ATG-5 peut être également impliqué dans conférant GC chimiorésistance à travers certains mécanismes moléculaires inconnus.

Il est largement admis que la récurrence et les métastases sont deux obstacles majeurs dans nos efforts pour améliorer bas OS et DFS taux de GC de survie. Chimiorésistance reste l'une des raisons les plus importantes menant à la repopulation tumorale /récidive après le traitement. option appropriée du traitement individuel sera sans aucun doute bénéfique pour améliorer les résultats cliniques; néanmoins, la décision de traitement actuel est surtout tributaire des stades TNM [27], [28]. Nos analyses de survie chez les 135 patients atteints de GC avec stade IB à IV, les tumeurs ont révélé que les deux ATG-5 et MRP-1 expression ont été en mesure de prédire indépendamment du système d'exploitation et DFS après le traitement avec une chimiothérapie adjuvante ECF, ce qui suggère que le contrôle de leurs niveaux d'expression en combinaison de marqueurs pronostiques classiques peuvent nous fournir des informations supplémentaires utiles pour une meilleure évaluation de l'effet de la chimiothérapie chez les patients du GC. Chose intéressante, on a trouvé l'ATG-5 a été surexprimé dans des lignées de cellules résistantes aux médicaments GC. Et faire taire ATG-5 peut sensibiliser les cellules résistantes aux médicaments à la chimiothérapie à nouveau. Nos données suggèrent que ATG-5 peut être une cible pour paitents chimiorésistantes.

Accumuler des preuves a suggéré que l'autophagie est capable de déclencher à la fois la survie cellulaire et la mort cellulaire dans des contextes différents. Liu et al ont rapporté que, grâce à l'inhibition de la voie PI3K /Akt /mTOR, β-élémène pourrait induire l'autophagie de protection pour aider les cellules du GC mieux adapter aux conditions stressantes et les protéger de subir l'apoptose mort [29]. En outre, des études récentes ont montré que la voie PI3K /Akt /mTOR voie de signalisation est souvent activée dans les tumeurs malignes gastro-intestinales humaines [30]. La signalisation PI3K /Akt modulant également MDR dans la cellule de GC grâce à la régulation de la p-glycoprotéine, Bcl2 et Bax [31]. De même, certains agents anti-cancéreux ont été rapportés inhiber la signalisation de mTOR et d'induire autophagie dans les cellules cancéreuses par la dégradation de nombreux composants majeurs dans l'axe de la mTOR [14], [32]. Dans l'ensemble, ces données suggèrent que l'autophagie pourrait être induite lors de la chimiothérapie, et la suppression des voies de autophagiques utilisant un inhibiteur de l'autophagie ont un potentiel pour améliorer l'efficacité chimiothérapeutique chez les patients du GC avec ATG-5 haute expression. À l'appui, nous avons constaté que lorsque autophagy est inhibée, les cellules résistantes au médicament ont été sensibilisés à un traitement médicamenteux à nouveau comme silencing ATG 5 'expression. Donc, notre soutien de sorte que l'autophagie contribue à chimiorésistance au patient.

En résumé, sur-expression de ATG-5, un joueur moléculaire clé de la voie autophagique, est associée à la chimiorésistance en GC. L'expression de l'ATG-5 et MRP-1 peut être considéré comme marqueurs pronostiques indépendants pour prédire OS et DSF des patients atteints de GC sur la base des données actuellement obtenus. Sur la base des stades TNM, la détection de leurs niveaux d'expression peut être cliniquement significative pour une meilleure prédiction des résultats du traitement de chimiothérapie chez les patients souffrant de cette maladie maligne. Les futures études portant sur l'évaluation d'un plus grand nombre de cas, idéalement à partir d'une origine ethnique différente, sont certainement nécessaires pour confirmer nos conclusions dans cette étude.

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