PLOS ONE: uppreglering av Autophagy-relaterad gen-5 (ATG-5) är förknippad med Chemoresistance i Human Gastric Cancer

Abstrakt

Autophagy-relaterad gen-5 (ATG-5) är ett av de viktigaste regulatorer av autophagic celldöd. Det har allmänt betraktas som en skyddande molekylär mekanism för tumörceller under kemoterapi. I föreliggande studie undersökte vi expressionsmönstret av ATG-5 och multidrogresistens-associerat protein-1 (MRP-1) i 135 gastric cancer (GC) patienter som behandlades med epirubicin, cisplatin och 5-FU adjuvant kemoterapi (ECF ) efter kirurgisk resektion och utforskade deras potentiella kliniska betydelsen. Vi fann att både ATG-5 (77,78%) och MRP-1 (79,26%) mycket uttrycktes i GC patienter. ATG-5-uttryck signifikant associerade med djup av vägg invasion, TNM stadier och avlägsna metastaser av GC (P < 0,05), medan MRP-1-uttryck signifikant kopplat med tumörstorlek, djup av vägg invasion, lymfkörtel metastas, TNM stadier och differentieringsstatus (P < 0,05). ATG-5 uttryck var positivt korrelerad med MRP-1 (rp = 0,616, P < 0,01). Ökat uttryck av ATG-5 och MPR-1 var signifikant korrelerad med dålig överlevnad (OS, P < 0,01) och sjukdomsfri överlevnad (DFS, P < 0,01) av vår GC kohort. Dessutom visade vi att ATG-5 var inblandad i läkemedelsresistent av GC-celler, som var huvudsakligen genom reglering av autophagy. Våra data antyder att uppregleras expressionen av ATG-5, en viktig molekylär egenskap hos skyddande autophagy, är associerad med chemoresistance i GC. Expression av ATG-5 och MRP-1 kan vara oberoende prognostiska markörer för GC behandling

Citation. Ge J, Chen Z, Huang J, Chen J, Yuan W, Deng Z, et al. (2014) uppreglering av Autophagy-relaterad gen-5 (ATG-5) är förknippad med Chemoresistance i Human magcancer. PLoS ONE 9 (10): e110293. doi: 10.1371 /journal.pone.0110293

Redaktör: Pankaj K. Singh, University of Nebraska Medical Center, USA

emottagen: 5 augusti 2014; Accepteras: 18 september 2014. Publicerad: 17 oktober 2014

Copyright: © 2014 Ge et al. Detta är en öppen tillgång artikel distribueras enligt villkoren i Creative Commons Attribution License, som tillåter obegränsad användning, distribution och reproduktion i alla medier, förutsatt den ursprungliga författaren och källan kredit

datatillgänglighet. Det författarna bekräftar att all data som ligger till grund resultaten är helt utan begränsning. Alla relevanta uppgifter inom pappers-

Finansiering:. Detta arbete stöddes av National Natural Science Foundation i Hunan-provinsen, Kina (nr 2012FJ6088). Finansiärerna hade ingen roll i studiedesign, datainsamling och analys, beslut att publicera, eller beredning av manuskriptet

Konkurrerande intressen:.. Författarna har förklarat att inga konkurrerande intressen finns

Introduktion

Trots en betydande nedgång i sin incidensen i många utvecklade länder, magsäckscancer (GC) är fortfarande den fjärde vanligaste diagnosen malignitet, och den näst vanligaste orsaken till cancerrelaterade dödsfall i världen [1]. Under de senaste decennierna, standard multimodala behandling strategier tillsammans med andra rekommenderade alternativ (t.ex. D2 dissektion och adjuvant kemoterapi) har misslyckats med att bota en stor andel av patienter som drabbats med GC, särskilt för de med avancerade och metastatiska sjukdomar, med sämre överlevnad som sett förmodligen på grund av närvaron av chemoresistance under behandlingen [2]. Därför, identifiering av nya molekylära händelser som ligger bakom utvecklingen av denna malignitet och dess dålig prognos samt förståelse mekanismerna för GC chemoresistance finns ett trängande behov för mer effektiv klinisk ingripande och bättre behandling av patienter.

Under fysiologiska förhållanden, autophagy är en lysosom beroende själv smälta systemet i första hand är ansvarig för avlägsnande och återvinning av långlivade proteiner och skadade /föråldrade intracellularorganelles för att upprätthålla cell homeostas [3]. Proteinerna och organ avsedda för destruktion är bundet i "dubbel-membran" vakuoler (autophagosomes), följt av fusion med lysosomer att bygga komplex kallas autophagosomes, där innehållet bryts ned av lysosomala hydro [4]. Det har dokumenterats att autophagy kan induceras som svar på många ogynnsamma förhållanden, inklusive närings deprivation, oxidativ stress eller DNA-skador och fungerar som en adaptiv cellmekanism, så småningom låta cellerna att överleva och föröka sig, medan omfattande eller ihållande Autophagy resulterar i celldöd [ ,,,0],5]. Försämringar i fysiologisk aktivering, montering och funktion av den autophagic reaktionsvägen har blivit allt observerats i en mängd olika humana cancerformer, även om den exakta roll som spelas av autophagy i cancer genes och progression är fortfarande under kontroverser. Vissa data gynnar idén att autophagy undertrycker tumörbildning, medan andra bevis tyder på att autophagy kan utlösa tumör initiering och skyddar tumörceller från att genomgå apoptos [6]. Interestingly, hämning av autophagy har nyligen visat sig förbättra den anti-tumöraktiviteten hos flera cytotoxiska medel. Li och kollegor rapporterade att autophagy aktiverades som ett skydd mot de cellulära effekterna av 5-FU-behandling och hämning av autophagy av 3-metyladenin augmented 5-FU-inducerad apoptos i koloncancerceller [7], [8]. Å andra sidan har vissa anticancerläkemedel (t ex cetuximabnivåerna och dasatinib) visat att inducera autophagic celldöd genom olika mekanismer i vissa cancerceller [9] - [13]. Den molekylära maskiner genom vilken autophagy reglerar överlevnad eller död av neoplastiska celler i stort sett oklar hittills. Den autophagy vägen är en mycket modulerad dynamisk process huvudsakligen utförs av autophagy relaterade (ATG) familj av gener, som styrs av flera viktiga kinaser inklusive mTOR, PI3K /Akt, AMPK och MAPK [14], [15]. ATG-5 är en central tillsynsmyndighet som krävs för autophagy i termer av dess inblandning i autophagosome förlängning [16]. Påtvingad uttryck av ATG-5 sensibiliserade tumörceller att cancerläkemedel behandling både In vitro Mössor och In vivo
; i kontrast siRNA-medierad hämning av ATG-5 ledde till partiell resistens mot kemoterapi [17]

Postoperativ adjuvant kemoterapi är för närvarande en stor behandling för GC.; förblir emellertid den totala effektiviteten av kemoterapi dålig möjligen som en konsekvens av närvaron av multiläkemedelsresistens (MDR) fenotyp. Till skillnad från andra tumör enheter, är uttrycket av de klassiska MDR-medierande molekyler såsom glutation-S-transferas och multiläkemedelsresistensgenen en inte särskilt utbredd i GC vävnader, vilket tyder på att det kan finnas en komplicerad mekanism för utvecklingen av MDR i tumörsjukdomen [ ,,,0],18]. Som en av de klassiska läkemedelsresistenta mekanismer, har multidrogresistens-associerat protein 1 (MRP1 /ABCC1) befunnits vara starkt uttryckt i GC och därmed kan utöva avgörande roller vid medie MDR i GC [19], [20]. Det är dock fortfarande okänt om MRP-1 expression är associerad med ATG-5 uttryck. Och även om autophagy är inblandad i chemoresistence i GC patienter är oklar.

I den aktuella studien, vi först användes immunohistokemi för att undersöka uttrycksprofilen av ATG-5 och MRP1 i en summa av 135 GC patienter som fick ECF (epirubicin, cisplatin och 5-FU) adjuvant kemoterapi efter kirurgisk resektion. Sambanden mellan ATG-5 och MRP-1 uttryck samt deras uttryck med olika kliniskt patologiska egenskaper hos GC och kliniska resultat bedömdes också.

Material och metoder

Patienter och vävnadsprover

En totalt 135 GC patienter som består av 91 män och 44 kvinnor som genomgick kirurgi vid institutionen för Gastrointestinal kirurgi, Xiangya Hospital, Central South University (CSU), Kina, mellan 1 januari 2007 och 31 december 2008 var inskrivna i den här studien. Medelåldern av kohorten var 53,62 ± 9,73 år, med ett intervall av 26 till 72. Theprimary GC tumör tissuesand matchade godartade (NC) vävnader som ligger minst 5 cm från tumören kärnan erhölls efter kirurgisk resektion och omedelbart behandlas och lagras tills vidare användning. Ingen av de rekryterade patienterna hade kemoterapi eller strålbehandling före operation. Den histopatologiska diagnos utfördes preoperativt och bekräftas av kirurgi. Alla deltagare med stadium IB till IV tumörer fick ECF kemoterapi efter operation (Dos: epirubicin 50 mg /m ^{2 på dag 1, cisplatin 60 mg /m 2 på dag 1 och kontinuerlig intravenös infusion av 5-FU 500 mg /m 2 /d under 4 dagar, vilket upprepas var 3 veckor upp till 24 veckor). De kliniska egenskaperna hos dessa patienter noterades i Tabell 1.}

Alla fall i denna studie granskades och alla prover histopatologiskt omprövas i oktober 2012. djup väggen invasion, regional lymfkörtel metastas, och histologiska grad bekräftades av samma grupp av två erfarna patologer. Patienterna kategoriserades baserat på differentieringsstatusen av cancerceller i tre histologiska kvaliteter: bra, måttlig och fattiga. Baserat på en kombination av loco-regional tumör engagemang och närvaron av metastaser, var samtliga fall iscensatt enligt TNM klassificering av malignt Tumörer (TNM) etapp gruppering [21]. För analys av överlevnad, var dagen för operationen används för att representera startpunkten för uppföljningsbesök. Patienter som dött av andra sjukdomar snarare än GC eller andra oförutsedda händelser uteslöts från fallet samlingen. Dödsorsaken rekryteras i denna studie var försämringen av GC. Den totala överlevnaden (OS) beräknades som tiden från och med dagen för den första operationen till dagen för dödsfall eller den dag då den sista uppföljningen som slutpunkt. Den sjukdomsfri överlevnad (DFS) definierades som tidsintervallet från operation till dagen för lokala återfall eller första avlägsen organ metastaser. Informerat skriftligt samtycke erhölls från varje patient före operationen och denna studie har godkänts av Forskningsetiska kommittén för Central South University, Kina. Alla prover hanteras och avidentifieras enligt de etiska och juridiska riktlinjer.

Immunohistokemi

De färska proverna fixerades i 10% neutral buffrad formalin och därefter inbäddade med paraffin. Paraffininbäddade vävnader skars vid 4 pm och sedan avparaffineras med xylen och rehydreras för ytterligare H & E eller peroxidas immunohistokemi färgning med hjälp av DAKO EnVision System. I korthet, efter proteolytisk digestion och blockering med endogent peroxidas, var vävnadsobjektglasen inkuberades med de primära antikropparna (ATG5: ab54033; MRP1: ab32574; Abcam Inc., Cambridge, Storbritannien) mot respektive målproteiner vid en utspädning av 1:500 över natten vid 4 ° C. Efter tvättning med PBS peroxidasmärkt polymer och substrat-kromogen användes därefter för att visualisera immnohistochemical färgning. Slutligen var sektionerna motfärgades med hematoxylin, cover-gled med monteringsmedium och undersöktes med Ijusmikroskopi. Alla förfaranden utfördes vid avdelningen för patologi, Xiangya Hospital, C.S.U. Diabilder tolkades oberoende av två erfarna patologer, som var blind för patienternas information. Vi kvantifierade färgningsintensitet och andelen färgade celler genom att använda en tidigare beskriven metod [22], [23]: procentandelen positivt färgade celler (0% -100%) multiplicerades med den dominerande intensitet färgningsmönster, med tanke på ett så negativt eller spåra, 2 så svag, 3 som måttlig och 4 lika stark. Därför den totala poängen varierade från 0 till 400. Patienterna därefter delas in i fyra olika undergrupper: poäng 0-99, poäng 100-199, poäng 200-299 och göra 300-400

Western blot-analys <. br>

Helcellextrakt framställdes med användning 0,14 M NaCl, 0,2 M trietanolamin, 0,2% natriumdeoxikolat, 0,5% Nonidet P-40 och med tillsats av en proteasinhibitor (samtliga produkter var från Sigma, St. Louis, Missouri , USA). Därefter tillsattes proteinprovet kördes genom en 12% natriumdodecylsulfat-polyakrylamidgelelektrofores (SDS-PAGE) -gel och överfördes till ett membran. De överförda membranen inkuberades därefter över natten vid 4 ° C med en primär antikropp. Efter tvättning inkuberades membranet med en pepparrotsperoxidas (HRP) -länkade sekundär antikropp under 1 h vid rumstemperatur. De primära antikropparna var anti-ATG-5 (Santa Cruz, CA, USA), anti-LC3A /B (Abcam, Cambridge, UK) och anti-β-aktin (Santa Cruz, CA, USA). Alla rapporterade resultaten är de genomsnittliga förhållandena av tre olika oberoende experiment.

cellprolifereringsanalys

Celler såddes på plattor med 96 brunnar (10000 celler /brunn) för 24 h före behandling. MTT-analyser användes för att bedöma cellproliferation vid olika tidpunkt efter behandling. MTT-analysen utfördes enligt följande: MTT sattes till varje brunn och plattorna inkuberades vid 37 ° C under 4 h. MTT mediumblandningen avlägsnades sedan och 150

• PLOS ONE: Jämförelse av Operativa Resultat och lärande kurvor mellan Laparoscopic och Robotic Gastrectomy för Gastric Cancer
• PLOS ONE: Prediction för magcancer utveckling av serum Pepsinogen Test och Helicobacter pylori seropositivitet i östra asiater: en systematisk genomgång och meta-Analysis