PLOS ONE: A sobre-regulação da autofagia-relacionadas Gene-5 (ATG-5) está associada a chemoresistance no câncer gástrico humano

Sumário

relacionadas com o gene de Autophagy-5 (ATG-5) é um dos principais reguladores da morte celular autophagic. Tem sido amplamente considerada como um mecanismo molecular para a protecção de células de tumor durante o tratamento de quimioterapia. No presente estudo, nós investigamos o padrão de expressão de ATG-5 e multirresistência-associado proteína-1 (MRP-1) em 135 cancros gástricos (GC) dos pacientes que foram tratados com epirrubicina, cisplatina e 5-FU quimioterapia adjuvante (ECF ) após a ressecção cirúrgica e explorou sua importância clínica potencial. Descobrimos que tanto ATG-5 (77,78%) e MRP-1 (79,26%) foram altamente expresso em pacientes GC. ATG-5 expressão foi significativamente associada com profundidade de invasão da parede, estágios TNM e metástase distante do GC (P < 0,05), enquanto MRP-1 expressão foi significativamente associada com o tamanho do tumor, profundidade de invasão da parede, metástases em linfonodos, estágios TNM e estado de diferenciação (P < 0,05). ATG-5 expressão foi positivamente correlacionada com MRP-1 (R = 0,616, P < 0,01). O aumento da expressão ATG-5 e MPR-1 foi significativamente correlacionada com pior sobrevida global (OS; P < 0,01) e sobrevida livre de doença (DFS; P < 0,01) da nossa coorte GC. Além disso, foi demonstrado que ATG-5 foi envolvido em resistente a drogas de células de GC, que foi principalmente através do controle autofagia. Nossos dados sugerem que a expressão regulada positivamente de ATG-5, uma característica molecular importante de autofagia protetora, está associada com chemoresistance no GC. Expressão da ATG-5 e MRP-1 podem ser marcadores prognósticos independentes para tratamento GC

Citation:. Ge J, Chen Z, Huang J, Chen J, Yuan W, Deng Z, et al. (2014) regulação positiva de Autophagy-relacionadas Gene-5 (ATG-5) está associada a chemoresistance no câncer gástrico humano. PLoS ONE 9 (10): e110293. doi: 10.1371 /journal.pone.0110293

editor: Pankaj K. Singh, University of Nebraska Medical Center, Estados Unidos da América

Recebido: 05 de agosto de 2014; Aceito: 18 de setembro de 2014; Publicação: 17 de outubro de 2014

Direitos de autor: © 2014 Ge et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Data Availability:. O autores confirmam que todos os dados subjacentes às conclusões estão totalmente disponíveis sem restrições. Todos os dados relevantes estão dentro do papel

Financiamento:. Este trabalho foi financiado pela National Science Foundation Natural da província de Hunan, China (No. 2012FJ6088). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

Apesar de uma queda considerável em sua taxa de incidência em muitos países desenvolvidos, o cancro gástrico (GC) continua a ser a quarta neoplasia mais comumente diagnosticado ea segunda principal causa de mortes relacionadas ao câncer em todo o mundo [1]. Nas últimas décadas, as estratégias de tratamento multimodal padrão em conjunto com outras opções recomendadas (por exemplo D2 dissecção e quimioterapia adjuvante) não conseguiram curar uma grande proporção de pacientes afetados com GC, especialmente para aqueles com doenças avançadas e metastáticos, com taxas de sobrevivência piores sendo vistos provavelmente devido à presença de quimioresistência durante o tratamento [2]. Assim, a identificação de eventos moleculares novos subjacentes ao desenvolvimento desta doença maligna e seu mau prognóstico, bem como a compreensão dos mecanismos de chemoresistance GC são urgentemente necessárias para a intervenção clínica mais eficaz e uma melhor gestão dos pacientes.

Em condições fisiológicas, autofagia é um sistema auto-digestão dependente do lisossoma principal responsável pela remoção e reciclagem de proteínas de longa duração e danificou /intracellularorganelles obsoletos, a fim de manter a homeostase celular [3]. As proteínas e organelas destinados à destruição são sequestradas dentro vacúolos "double-membrana" (autofagossomas), seguido por fusão com lisossomos para construir complexos conhecidos como autofagossomas, onde os conteúdos são degradadas por hidrolases lisossomais [4]. Tem sido documentado que a autofagia poderia ser induzida em resposta a muitas condições desfavoráveis, incluindo a privação de nutrientes, estresse oxidativo ou dano de ADN e serve como um mecanismo celular adaptativa, eventualmente, permitindo que as células para sobreviver e proliferar, enquanto extensas ou persistentes resultados autophagy em morte celular [ ,,,0],5]. Deficiências na fisiológico ativação, montagem e função da via autofágica têm sido cada vez mais observado em uma grande variedade de cancros humanos, embora o exato papel da autofagia na gênese e progressão do câncer ainda está em controvérsia. Alguns dados favorecem a idéia de que a autofagia suprime tumorigênese, enquanto outras evidências sugerem que a autofagia é capaz de desencadear iniciação do tumor e protege as células tumorais de apoptose [6]. Curiosamente, a inibição da autofagia recentemente foi encontrado para aumentar a actividade anti-tumor de vários agentes citotóxicos. Li e colegas relataram que autofagia foi activado como um mecanismo de protecção contra os efeitos celulares de 5-FU-tratamento e inibição da autofagia por 3-metiladenina aumentada apoptose induzida por 5-FU em células de cancro do cólon [7], [8]. Por outro lado, algumas drogas anticancerígenas (por exemplo, cetuximab e dasatinib) foram demonstrados para induzir a morte de células através de diferentes mecanismos autophagic em algumas células cancerosas [9] - [13]. O mecanismo molecular pelo qual a autofagia regula a sobrevivência ou a morte das células neoplásicas permanece até hoje em grande parte obscura. A via autofagia é um processo altamente modulada dinâmica predominantemente executado pelo (ATG) da família relacionadas com a autofagia de genes, que é regida por várias quinases-chave, incluindo mTOR, via PI3K /Akt, AMPK e MAPK [14], [15]. ATG-5 é um regulador central necessário para a autofagia em termos de seu envolvimento no alongamento autophagosome [16]. expressão forçada de ATG-5 células tumorais sensibilizados ao tratamento anticâncer drogas tanto in vitro
e in vivo
; em contraste inibição da ATG-5 siRNA mediada levou a resistência parcial à quimioterapia [17]

pós-operatório quimioterapia adjuvante é, actualmente, um importante tratamento para GC.; No entanto, a eficácia global da quimioterapia continua a ser fraca, possivelmente como uma consequência da presença de resistência a múltiplas drogas (MDR) fenótipo. Ao contrário de outras entidades tumorais, a expressão das moléculas clássicas MDR-mediadores, tais como a glutationa-S-transferase e o gene de resistência a múltiplos fármacos 1 não é muito predominante nos tecidos de GC, o que indica que pode existir um mecanismo complicado para o desenvolvimento de MDR nesta doença maligna [ ,,,0],18]. Como um dos mecanismos resistentes aos medicamentos clássicos, multidroga proteína associada a resistência 1 (MRP1 /ABCC1) foi encontrado para ser fortemente expressa em GC e, assim, podem exercer um papel central na mediação da MDR em GC [19], [20]. No entanto, não se sabe se a expressão de MRP-1 está associado com a expressão ATG-5. E também se a autofagia está envolvido em chemoresistence em pacientes do GC não é clara.

No presente estudo, utilizado pela primeira vez imunohistoquímica para investigar o perfil da ATG-5 e MRP1 expressão em uma soma de 135 pacientes que receberam GC ECF (epirrubicina, cisplatina e 5-FU) quimioterapia adjuvante após ressecção cirúrgica. As correlações entre ATG-5 e MRP-1 expressão, bem como a sua expressão com várias características clinicopatológicas de GC e clínicos resultados também foram avaliados.

Materiais e Métodos

Pacientes e amostras de tecido

Um total de 135 pacientes GC constituída por 91 homens e 44 mulheres que se submeteram à cirurgia no Departamento de cirurgia Gastrointestinal, Hospital Xiangya, Centro Universitário do Sul (CSU), China, entre 1º de janeiro de 2007 e 31 de dezembro de 2008 foram incluídos no este estudo. A idade média dos participantes era de 53,62 ± 9,73 anos, com uma gama de 26 a 72. tumor Theprimary GC tissuesand combinados não-cancerosos (NC) tecidos localizados pelo menos 5 cm de distância do núcleo de tumor foram obtidos após a ressecção cirúrgica e imediatamente processados e armazenado até à sua utilização. Nenhum dos doentes recrutados tinham quimioterapia ou radioterapia antes da operação cirúrgica. O diagnóstico histopatológico foi realizada no pré-operatório e confirmado por cirurgia. Todos os participantes com o estádio IB a IV tumores receberam ECF quimioterapia após a cirurgia (dose: epirrubicina a 50 mg /m ^{2 no dia 1, a cisplatina 60 mg /m 2 no dia 1 e infusão intravenosa contínua de 5-FU 500 mg /m 2 /d para 4 dias, repetido a cada 3 semanas até 24 semanas). As características clínicas desses pacientes foram listadas na Tabela 1.}

Todos os casos deste estudo foram revistos e todos os espécimes foram histopatologicamente reexaminada em outubro de 2012. A profundidade da invasão da parede, linfonodo metástases regionais, e grau histológico foram confirmados pelo mesmo grupo de dois patologistas seniores experientes. Os pacientes foram categorizados com base no estado de diferenciação das células cancerosas em três graus histológicos: bem, moderada e fraca. Com base em uma combinação de envolvimento tumoral loco-regional ea presença de metástase, todos os casos foram classificados de acordo com a Classificação TNM do agrupamento estágio maligno Tumores (TNM) [21]. Para a análise de sobrevivência, a data da operação foi usado para representar o ponto de início da visita de acompanhamento. Os pacientes que morreram de outras doenças, em vez de GC ou outros eventos inesperados foram excluídos da recolha de caso. A causa da morte recrutados neste estudo foi de agravamento da GC. A sobrevida global (OS) foi calculado como um período a partir da data da cirurgia inicial para a data da morte ou a data do último follow-up como o ponto final. A sobrevida livre de doença (DFS) foi definido como o intervalo de tempo desde a cirurgia até a data de recidiva local ou metástase primeiro órgão distante. consentimento informado por escrito foi obtido de cada paciente antes da cirurgia e este estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa da Universidade Central do Sul, China. Todas as amostras foram tratadas e tornados anónimos de acordo com as diretrizes éticas e legais.

Imunohistoquímica

Os espécimes frescos foram fixados em formalina a 10% tamponada neutra e, posteriormente incorporado com parafina. Os tecidos embebidos em parafina foram cortados em 4 mm e, em seguida, desparafinados com xileno e reidratadas para posterior H & E ou coloração imuno-histoquímica da peroxidase usando o sistema EnVision DAKO. Em resumo, após a digestão proteolítica e com bloqueio da peroxidase endógena, as lâminas de tecido foram incubadas com os anticorpos primários (Atg5: ab54033; MRP1: ab32574; Abcam Inc., Cambridge, Reino Unido) contra respectivas proteínas alvo, a uma diluição de 1:500 durante a noite a 4 ° C. Após lavagem com PBS, polímero marcado com peroxidase e substrato-cromogénio foram então empregues, a fim de visualizar a coloração immnohistochemical. Finalmente, as secções foram contrastadas com hematoxilina, capa-deslizado com meio de montagem, e examinadas por microscopia de luz. Todos os procedimentos foram realizados no Departamento de Patologia, Hospital Xiangya, C.S.U. As lâminas foram interpretadas de forma independente por dois patologistas experientes, que eram cegos à informação dos pacientes. Foram quantificados intensidade de coloração e a percentagem de células coradas, utilizando uma abordagem descrita previamente [22], [23]: a percentagem de células coradas positivamente (0% -100%) foi multiplicado por o padrão de intensidade de coloração dominante, considerando um como negativo ou rastrear, como fraco 2, 3 e 4 como moderados como forte. Portanto, a pontuação geral variou de 0 a 400. Os pacientes foram posteriormente divididos em quatro subgrupos diferentes: marcar 0-99, marcar 100-199, 200-299 marcar e marcar 300-400

análise de Western blot <. br>

os extractos celulares totais foram preparados usando 0,14 M de NaCl, 0,2 M de trietanolamina, 0,2% de desoxicolato de sódio, 0,5% de Nonidet P-40 e suplementado com um inibidor de protease (todos os produtos eram da Sigma, St. Louis, Missouri , EUA). Em seguida, a amostra de proteína foi executado através de um gel de dodecilsulfato de sódio a 12% de electroforese em gel de poliacrilamida-sulfato (SDS-PAGE) e transferidos para uma membrana. As membranas transferidas foram subsequentemente incubadas durante a noite a 4 ° C com um anticorpo primário. Após a lavagem, a membrana foi incubada com uma peroxidase de rábano (HRP) -linked anticorpo secundário durante 1 h à temperatura ambiente. Os anticorpos primários foram anti-ATG-5 (Santa Cruz, CA, EUA), anti-LC3A /B (Abcam, Cambridge, Reino Unido) e anti-β-Actina (Santa Cruz, CA, EUA). Todos os resultados reportados são os índices médios de três diferentes experiências independentes.

proliferação celular ensaio

As células foram semeadas em placas de 96 poços (10000 células /poço) durante 24 h antes do tratamento. ensaios MTT foram usadas para avaliar a proliferação de células em diferentes pontos de tempo após o tratamento. O ensaio de MTT foi realizado como se segue: Adicionou-se MTT a cada poço e as placas foram incubadas a 37 ° C durante 4 h. A mistura de meio de MTT foi depois removido e 150 ul de dimetilsulfóxido (DMSO) foi adicionado a cada poço. A absorvância foi medida a 570 nm utilizando um espectrofotómetro multiwall

ARN interferência

ARNic em cadeia dupla de segmentação ATG-5 foram sintetizados como se segue: siARN-ATG5-486:. GACGUUG GUAACUGACAAATT; siRNA-ATG5-695: GUCCAUCUAAGGAUGCAAUTT e siRNA-ATG5-938: GACCUUUCAUUCAGAAGCUTT. ARNic em cadeia dupla contendo sequências não específicas foram usadas como um controlo negativo (CN): UUCUCCGAACGUGUCACGUTT. Diferentes siRNAs foram transfectados separadamente em células usando o reagente Lipofectamine 2000, e o meio foi substituído 6 h após a transfecção.

em tempo real de RT-PCR

o ARN total de linhas celulares e tecidos eram extraído usando o reagente Trizol (Invitrogen, Carlsbad, EUA), seguindo as instruções do fabricante. A concentração de ARN foi medida usando um espectrofotómetro. Um conjunto de ADNc foi sintetizado utilizando 1 ug de ARN total e TaqMan transcrição reversa Reagentes (Applied Biosystems, Foster City, EUA) como descrito pelo fabricante. A expressão do gene alvo foi avaliada utilizando uma abordagem de quantificação relativa (2 ^{-ΔΔCt method) com β-actina como referência interna.}

imunofluorescência

As células foram permeabilizadas com 0,3 % de Triton X-100 durante 10 minutos, seguido pela fixação com 2-4% Metanal durante 15 min, e bloqueadas com soro de ovelha de 3% à temperatura ambiente durante 60 min. Em seguida, sondadas com anticorpos primários anti-LC3B (Santa Cruz, CA, EUA) durante a noite à temperatura ambiente, e as células foram lavadas três vezes com PBS. Coradas com 488 de IgG de cabra anti-488 de coelho conjugado com Alexa Fluor durante 1 h à temperatura ambiente, e, em seguida, as células foram lavadas três vezes com PBS. Os núcleos foram visualizadas por coloração com DAPI (Sigma, EUA) durante 2 min. As células marcadas foram observados com microscópio de fluorescência invertido.

A análise estatística

Todas as análises estatísticas foram realizadas com o pacote de software SPSS 15.0 para Windows (SPSS Inc., Chicago, IL, EUA). Os dados quantitativos foram apresentados como média ± SD. χ de Pearson ^{2 teste foi utilizado para comparar a diferença entre os dados classificados, enquanto o teste One-way-ANOVA foi realizada para comparar a diferença entre os dados quantitativos. análises de sobrevivência foram realizadas utilizando o método de Kaplan-Meier e comparadas pelo teste de log-rank. O modelo de Cox-regressão foi realizada para avaliar a taxa de risco independente de cada variável na análise multivariada. A correlação entre Atg5 e MRP1 expressão foi examinada usando correlação bivariada de teste (Pearson). Diferenças foram consideradas estatisticamente significativas quando P
valores foram inferiores a 0,05.}

Resultados

Expressão da ATG-5 e MRP-1 em GC

o padrão de expressão e localização da ATG-5 e MRP-1 em nossos pacientes do GC, que foram tratados com epirubicina, cisplatina e 5-FU quimioterapia adjuvante (ECF) após a ressecção cirúrgica, foram examinadas utilizando análise imunohistoquímica. Entre as amostras de GC 135, 105 (77,78%) foram positivas para ATG-5 imunorreactividade, e 107 (79,26%) foram positivas de MRP-1. Como representado na Figura 1, verificou-se que Atg5 foi predominantemente expresso no citoplasma. Além disso, a sobre-expressão de ATG-5 foi positivamente correlacionada com a de MRP-1 em GC. (R = 0,616, P Art < 0,001), como revelado pelo teste de correlação bivariada. A expressão positiva em tecidos não-cancerosas adjacentes foram 113 (83,70%) de 5-ATG e 89 (65,93%) de MRP-1. Os dados mostraram que tanto ATG-5 e MRP-1 foram expressos em positivamente cancerosas e não cancerosas tecidos, o que sugere que ATG-5 e MRP-1 pode ser induzida por quimioterapia em ambos os tecidos tumorais e não tumorais. Como todas as nossas amostras de pacientes foram tratados com quimioterapia ECF, e descobrimos que ambos ATG-5 e MRP-1 foram altamente expressa e positivamente nas amostras. Enquanto isso, o estudo anterior indica que MRP-1 talvez associado com resistência a múltiplas drogas em GC. Juntamente com a constatação anterior, nossos resultados sugerem que ATG-5 e MRP-1 pode estar envolvido na chemoresistance em pacientes GC.

Associações entre a expressão da ATG-5 ou MRP-1 e as características clinicopatológicas de GC

As associações de ATG-5 e MRP1 expressão com vários parâmetros clínico de GC são apresentados na Tabela 1 e Tabela 2, respectivamente. Expressão da ATG-5 foi significativamente associada com profundidade de invasão da parede, metástases à distância e estágios TNM do GC ( P Art < 0,001, P
= 0,018, P
< 0,001, respectivamente). MRP-1 expressão foi significativamente associada com o tamanho do aumento do tumor, profundidade de invasão da parede, linfonodos regionais metástase, estágios TNM ( P
= 0,032, P Art < 0,001, P = 0,016, P < 0,001, respectivamente) e estado de diferenciação ( P
= 0,005). Para determinar ainda o envolvimento d ATG-5 e MRP-1 no desenvolvimento de GC, foi realizada a análise de sobrevivência nas nossas amostras de doentes. Nossas análises de sobrevivência demonstraram que a taxa total de sobrevida global (OS) da nossa coorte GC foi 43,70% com uma sobrevida média de 39.849 meses (IC 95%, 35.636-44.061 meses); enquanto que a sobrevida livre de doença (DFS) taxa foi de 34,07%, com uma sobrevida média de 35.802 meses (IC 95%, 31.618-39.986 meses). A seguir classificaram os pacientes em quatro subgrupos diferentes de acordo com a pontuação de coloração imuno-histoquímica. A análise de sobrevivência de Kaplan-Meier revelou uma maior expressão ATG-5 foi significativamente associada com o OS mais pobre ( P Art < 0,001) e DFS ( P
= 0,003). comparações de pares indicado que os doentes que leva a mais alta expressão ATG-5 (pontuações 300-400) tinha as taxas de sobrevivência mais pobres quando comparada com a de outros subgrupos (Figura 2A e 2B). Consistentemente, upregulated MRP-1 expressão foi encontrado para ser significativamente associada com a má OS ( P
= 0,001) e DFS ( P
= 0,018) dos nossos pacientes do GC. O subgrupo com as pontuações de expressão MRP1 mais altas (0-99) parece ter a pior prognóstico (Figura 2C e 2D) em comparação com outros subgrupos. Nossos dados também mostraram que houve uma correlação significativa entre os estágios TNM e sobrevida dos pacientes do GC. Pacientes com estágio III e IV tumores exibida pior prognóstico em comparação com aqueles que abriga o estádio IB e II tumores ( P < 0,01
) (Figura 2E e 2F). Mais interessante, modelo de regressão de risco multivariada de Cox demonstrou que ATG-5 e MRP-1 níveis de expressão e estágios TNM foram todos os indicadores prognósticos independentes e significativos para a previsão do OS ( P
= 0,037, P
= 0,005, P Art < 0,001, respectivamente) e DFS ( P
= 0,004, P
= 0,008, P Art < 0,001 respectivamente) de GC (Tabela 3). Nossos dados indicam o ATG-5 e MRP-1 estavam intimamente relacionadas com o desenvolvimento GC e pode servir como marcadores de prognóstico pobre no tratamento GC.

ATG-5 foi significativamente regulada em células quimiorresistentes

para explorar melhor o papel da ATG-5 na tumorigénese e resistente à droga. Detectamos a expressão da proteína em várias linhas celulares de cancro gástrico (AGS, BGC-832, SGC7901, SGC7901 /DPP e MKN45) e em uma linha imortalizada humana gástrica células epiteliais da mucosa (GES). Curiosamente, verificou-se que 5-ATG foi dramaticamente sobre-expresso na linha celular resistente a DPP, células SGC7901 /DPP, em comparação com todas as outras linhas de células que incluem células sensíveis SGC7901 DPP (Figura 3A). Nós ainda confirmado que as células SGC7901 /DPP são resistentes ao tratamento DPP. O IC 25, IC50 e IC75 foram de 15,4 uM, 38,7 uM e 93,53 uM em células SGC7901. Em contraste, o IC 25, IC50 e IC75 foram 120,03 iM, iM 271.9 e 423,7 uM em SGC7901 /DPP (Figura 3B). Trata-se de 5 a 9 vezes mais elevada do que em células não resistentes a drogas. Nossa descoberta sugere fortemente que ATG-5 contribui para a droga resistentes das células GC.

A inibição de células quimiorresistentes ATG-5 sensibilizados para tratamento medicamentoso

Para provar ainda que ATG-5 contribui para a resistente a drogas de células de GC, foi utilizado pequenos ARN interferentes (siRNAs) para a expressão de knockdown ATG-5. Três siRNAs foram concebidos. O nosso PCR em tempo real e os resultados de Western blot mostrou que todos os três siRNAs inibiu a expressão de ATG-5, tanto a nível de ARNm e de proteína (Figura 4A e 4B). Nós escolhemos um, siRNA-ATG5-695, com maior eficiência knockdown para realizar o seguinte experimento. Nós knockdown ATG-5 expressão e depois tratou-se as células com DPP. capacidade de proliferação celular foi analisada aos 0, 48 e 72 horas após o tratamento. O nosso resultado mostrou que knockdowning ATG-5 não afectou a proliferação celular em células SGC7901 /DPP em comparação com ARNsi de controlo (siARN NC). tratamento de DPP sozinho inibiu ligeiramente a proliferação das células. Curiosamente, quando a expressão de knockdown ATG-5 e tratou-se as células com DPP, ao mesmo tempo, a capacidade de proliferação de células foi ainda suprimida em comparação com as células tratadas com DPP sozinho 48 e 72 horas após o tratamento (Figura 4 C). Os nossos dados suportam ainda que ATG-5 contribui para a droga resistentes de células GC.

Autophagy estava envolvido na droga resistentes de células DC

Como ATG-5 é um regulador central da autofagia, especulamos que autofagia podem estar envolvidos no resistente a drogas de células de GC. Assim, utilizou-3MA, que é um inibidor autofagia, para o tratamento das células resistentes a drogas. Como esperado, verificou-se que com o tratamento em conjunto 3MA DPP teve um efeito semelhante com ATG-5 kncokdown em conjunto com o tratamento de DPP (Figura 4C e 4D). Os dados demonstram que a autofagia contribui para a droga resistente. Em seguida, nós examinamos se a autofagia foi alterado durante o tratamento. Utilizou-se ensaios de imunofluorescência para detectar o nível de expressão LC3B, que é um marcador autofagia nas células. Os nossos dados mostraram que a autofagia foi suprimida após o silenciamento ATG-5 ou o tratamento das células com 3MA (Figura 5A). E resultado western blot confirmou ainda que a expressão da proteína LC3A /B só foi afetada em células tratadas com siRNA-Atg5 ou 3MA. Deste modo, a proliferação celular foi ainda inibida apenas quando autofagia foi inibida (Figura 4 e Figura 5). Portanto, nossos dados revelaram que ATG-5 estava envolvido na droga resistentes de células DC, que foi afetada principalmente por meio da autofagia das células cancerosas.

Discussão

GC permanece um dos mais tumores malignos freqüentes em uma base global, apesar da sua incidência em declínio e o número total está previsto para subir continuamente, como resultado do crescimento da população. Nos homens, a GC ocupa o segundo em taxa de mortalidade; em mulheres, é o quarto da mortalidade [24], [25]. A taxa bruta de mortalidade de GC na China foi de 25,2 por 100 000 [26]. No nosso estudo, foi examinada a expressão de ATG-5 e MRP-1 em uma coorte de GC paciente após a quimioterapia. Em seguida, foi demonstrado que ATG-5 foi regulada positivamente em células resistentes a cisplatina linha (DDP). Além disso, após o ATG 5-expressão ou aotophogy foi inibida, as células cancerosas foram sensibilizadas para tratamento de DPP. Nossos resultados fornecem uma nova visão sobre o mecanismo de resistente à quimioterapia na progressão GC.

Foram avaliados o perfil exression da ATG-5 e MRP-1 em 135 pacientes GC chineses. Em um acordo com relatório anterior [22], nossos resultados mostraram que uma elevada percentagem de tecidos GC expressa ATG-5 e ATG-5 expressão foi estatisticamente associada à profundidade de invasão da parede, metástases à distância e estágios TNM do GC. Estes resultados suportam uma noção de que o nível de expressão elevada Atg5 podem contribuir para, em certa medida, um fenótipo mais agressivo e maligno em GC. Este ponto de vista é ainda apoiada por nossa descoberta da associação entre maior expressão Atg5 no GC e mais pobre prognóstico dos pacientes (veja mais discussão abaixo). Mais importante, nós identificamos uma correlação positiva entre ATG-5 e MRP1 expressão em nossa coorte GC. Considerando o facto de que MRP1 é uma proteína de transporte transmembranar ABC bem conhecida para promover o fenótipo MDR em GC, é razoável propor que ATG-5 pode também ser implicado em conferir GC quimiorresistência através de certos mecanismos moleculares desconhecidas.

é amplamente aceito que a recorrência e metástase são dois grandes obstáculos em nossos esforços para melhorar baixo OS e taxa de sobrevivência DFS de GC. Chemoresistance continua sendo uma das razões mais importantes que levam ao repovoamento tumor /recorrência após o tratamento. opção apropriada do tratamento individual será, sem dúvida benéfico para melhorar o resultado clínico; no entanto, a decisão de tratamento atual é em grande parte dependente das fases TNM [27], [28]. A nossa análise de sobrevivência nos 135 pacientes GC com o estádio IB a IV tumores revelaram que tanto a expressão ATG-5 e MRP-1 foram capazes de prever de forma independente a OS e DFS após o tratamento com quimioterapia adjuvante ECF, sugerindo que a monitorização dos seus níveis de expressão de combinação de marcadores prognósticos convencionais podem nos fornecer informações valiosas adicionais para uma melhor avaliação do efeito da quimioterapia em pacientes GC. Curiosamente, encontramos o ATG-5 foi sobre-expresso em linhas celulares GC resistentes aos medicamentos. E silenciamento ATG-5 pode sensibilizados as células resistentes aos medicamentos para quimioterapia novamente. Nossos dados sugerem que ATG-5 pode ser um alvo para paitents quimiorresistentes.

Evidências acumuladas sugerem que a autofagia é capaz de desencadear tanto a sobrevivência e morte celular em diferentes contextos. Liu et al relataram que, através da inibição da via PI3K /Akt /mTOR, β-elemeno poderia induzir autofagia protector para ajudar células GC melhor se adaptar às condições de stress e protegê-las de sofrer apoptose morte [29]. Além disso, estudos recentes demonstraram que a via PI3K /Akt /mTOR via de sinalização activada é frequentemente em malignidades gastrointestinais humanos [30]. A sinalização PI3K /Akt também modula MDR em células GC através da regulação da glicoproteína-p, Bcl2 e Bax [31]. Da mesma forma, alguns agentes anticancro têm sido relatados para inibir a sinalização de mTOR e induzir autofagia em células cancerosas através da degradação de muitos componentes principais no eixo de mTOR [14], [32]. No geral, estes dados sugerem que a autofagia poderia ser induzido durante a quimioterapia e a supressão de percursos autofágicos usando inibidor autofagia têm potencial para melhorar a eficácia quimioterapêutico em pacientes com GC-5 ATG expressão elevada. Em apoio, descobrimos que quando a autofagia foi inibida, as células resistentes a drogas também foram sensibilizados ao tratamento medicamentoso novamente como silenciamento ATG 5-expressão. Assim, o nosso apoio resultado que contribui para autofagia resistente à quimioterapia em pacientes.

Em resumo, a sobre-expressão de ATG-5, um jogador chave molecular da via autophagic, está associada com quimiorresistência em GC. Expressão da ATG-5 e MRP-1 pode ser considerado como marcadores prognósticos independentes para predizer OS e DFS de pacientes GC com base nos dados actualmente obtidos. Com base nas fases TNM, detecção dos seus níveis de expressão podem ser clinicamente significativa para melhor previsão dos resultados dos tratamentos quimioterapêuticos em pacientes que sofrem desta doença maligna. estudos envolvendo a avaliação de um maior número de casos, de preferência a partir de uma origem étnica diferente, são definitivamente garantido para confirmar nossos achados neste estudo.

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