PLoS ONE: microRNA-9 onderdrukt de proliferatie, invasie en uitzaaiing van maagkanker cellen door Targeting Cycline D1 en Ets1

Abstract

Uit recente gegevens blijkt dat de gewijzigde microRNA-9 (miR-9) expressie wordt betrokken bij de progressie van maagkanker. De precieze rol en de onderliggende mechanismen van miR-9 in de proliferatie, invasie en metastase van maagkanker nog onopgehelderd. In deze studie, miR-9 bleek te zijn neerwaarts gereguleerd en omgekeerd gecorreleerd met de expressie van cycline D1 en v-ets erythroblastose virus E26 oncogeen homoloog 1 (Ets1) bij maagkanker weefsels en cellijnen. Bioinformatica analyse onthulde de vermeende miR-9 bindingsplaatsen in de 3'-ongetranslateerde gebieden (3'-UTR) van cycline D1 en Ets1 mRNA. Ectopische expressie of knock-down van miR-9 resulteerde in reactie daarop veranderde expressie van cycline D1, Ets1 en hun downstream targets gefosforyleerd retinoblastoom en matrix metalloproteïnase 9 in gekweekte maagkanker cellijnen SGC-7901 en AGS. In het luciferase reporter-systeem, miR-9 direct gericht op de 3'-UTR van cycline D1 en Ets1, en deze effecten werden afgeschaft door het muteren van de miR-9-bindende plaatsen. Overexpressie van miR-9 onderdrukt de proliferatie, invasie en metastase van SGC-7901 en AGS cellen In vitro Kopen en In vivo
. Restauratie van miR-9-gemedieerde down-regulatie van cycline D1 en Ets1 door voorbijgaande transfectie, redde de kankercellen uit afname van de proliferatie, migratie en invasie. Bovendien, anti-miR-9 inhibitor bevorderde de proliferatie, migratie en invasie van maagkanker cellen, terwijl het neerhalen van cycline D1 of Ets1 de effecten van de miR-9 overexpressie gedeeltelijk phenocopied. Deze gegevens aan dat miR-9 onderdrukt de expressie van cycline D1 en Ets1 via de bindingsplaatsen in de 3'-UTR, en verhindert daarmee de proliferatie, invasie en metastase van maagkanker

Citation:. Zheng L, Qi T, Yang D, M Qi, Li D, X Xiang, et al. (2013) microRNA-9 onderdrukt de proliferatie, invasie en uitzaaiing van maagkanker cellen door Targeting Cycline D1 en Ets1. PLoS ONE 8 (1): e55719. doi: 10.1371 /journal.pone.0055719

Uitgever: Alejandro H. Corvalan, Pontificia Universidad Catolica de Chile, Chili

​​Ontvangen: 14 september 2012; Aanvaard: 29 december 2012; Gepubliceerd: 31 januari 2013 |

Copyright: © 2013 Zheng et al. Dit is een open-access artikel gedistribueerd onder de voorwaarden van de Creative Commons Attribution License, die onbeperkt gebruik, distributie en reproductie maakt in elk medium, op voorwaarde dat de oorspronkelijke auteur en de bron worden gecrediteerd

Financiering:. Ondersteund door de National Natural Science Foundation of China (nr 30600278, nr 30772359, nr 81071997, nr 81072073, nr 81272779), Programma voor New Century Excellent talents in University (NCET-06-0641), Wetenschappelijk Onderzoek Stichting tot teruggekeerd Overseas Chinese Geleerden (2008-889), en fundamenteel onderzoek fondsen voor de Central Universiteiten (2012QN224). De financiers hadden geen rol in de studie design, het verzamelen van gegevens en analyse, besluit te publiceren, of de voorbereiding van het manuscript

Competing belangen:.. De auteurs hebben verklaard dat er geen tegenstrijdige belangen bestaan ​​

Introductie

Maagkanker is de vierde meest voorkomende kanker in de wereld [1]. Ondanks de verbetering van de chirurgische en multimodale therapie de prognose voor de gevorderde maagkanker nog steeds slecht als gevolg van de herhaling, invasie en metastase, met een 5-jaarsoverleving minder dan 30% [1]. Een betere kennis van de mechanismen die ten grondslag liggen aan progressie van de tumor is gerechtvaardigd om nieuwe paradigma's voor de diagnose en behandeling van maagkanker ontdekken [2]. MicroRNAs (miRNAs), een recent geïdentificeerde categorie kleine sterk geconserveerde niet-coderende RNA's kunnen deelnemen in de post-transcriptionele regulatie van genexpressie door middel van gedeeltelijke complementaire binding met de 3 'onvertaalde gebieden (3'-UTR) van doelwit-mRNA, resulterend in translationele repressie of mRNA degradatie [3]. Opkomende bewijs dat miRNAs betrokken zijn bij de biologische processen gerelateerd aan apoptose, proliferatie, differentiatie en métastase, terwijl deregulering van die cruciaal is voor initiatie en progressie van kanker [3]. Het is momenteel dringend om de rol van miRNAs en hun doelgenen in tumorprogressie door experimentele modellen onderzocht.

In menselijke maagkanker, verschillende miRNAs werden gerapporteerd dat afwijkend overexpressie of down-gereguleerd tijdens de progressie van maagkanker, met inbegrip van miR-21 [4], miR-15b [5], miR-16 [5], en miR-101 [6]. Deze miRNAs spelen oncogene of tumor-onderdrukkende rol in de regulering van de celgroei, migratie en invasie door het onderdrukken van hun doelgroep genen. Bijvoorbeeld oncogene miR-21 is afwijkend overexpressie gebracht bij maagkanker en verbetert de verspreiding en invasiviteit van maagkanker cellen doelwit reversion inducerende cysteïnerijke eiwitten met Kazal motieven [4]. Ondertussen, miR-15b en miR-16 neerwaarts gereguleerd maagkanker en bijdragen aan multidrug resistentie van maagkanker cellen door modulatie van apoptose via targeting B-celleukemie /lymfoom 2 [5]. miR-101 is down-gereguleerd bij maagkanker weefsels en cellijnen, terwijl ectopische expressie van miR-101 aanzienlijk remt de proliferatie, migratie en invasie van maagkanker cellen door zich te richten enhancer van Zeste homoloog 2, cytochroom c oxidase subunit II en myeloïde cel leukemie volgorde 1 [6]. Daarom heeft een focus om de expressie en functie van miRNA verder onderzoeken in de tumor biologie van maagkanker is.

MicroRNA 9 (miR-9) eerst geïdentificeerd als een van de belangrijkste regulatoren voor de ontwikkeling , fysiologie en pathologie van het zenuwstelsel in verschillende organismen, waaronder Drosophila
, zebravis, en zoogdieren [7] - [9]. Een aantal latere studies hebben aangetoond dat veranderde miR-9-expressie is geassocieerd met de ontwikkeling en progressie van kanker [10] - [14]. Er werd vastgesteld dat miR-9 significant neerwaarts gereguleerd bij maagkanker, impliceert het potentiële rol in tumorprogressie [15] - [18]. Ook wordt aangegeven dat miR-9 de proliferatie van maagkanker cellen kunnen moduleren via gericht op de caudale Type homeobox 2 (CDX2) [19] en NF-kappa B (NF-KB) [16]. De exacte functie en de onderliggende mechanismen van miR-9 in de progressie van maagkanker nog rechtvaardigen verder onderzoek. In deze studie tonen we voor de eerste keer dat miR-9 rechtstreeks gericht cycline D1 en v-ets erythroblastose virus E26 oncogeen homoloog 1 (Ets1), en onderdrukt de proliferatie, invasie en metastase van maagkanker cellen in vitro Kopen en in vivo
.

Resultaten

miR-9 werd down-gereguleerd en omgekeerd gecorreleerd met de expressie van cycline D1 en Ets1 bij maagkanker weefsels en cellijnen

de miR-9 expressie in maagkanker, maagkanker weefsels en naburige niet-neoplastische mucosa werden verzameld van 86 primaire gevallen onderzoeken. Real-time kwantitatieve reverse transcriptie PCR (RT-PCR) liet zien dat miR-9 werd down-gereguleerd bij maagkanker weefsels dan in naburige niet-neoplastische mucosa ( P
= 0,001, Fig. 1A). De miR-9 expressie was significant lager bij maagkanker gevallen met diepere maagwand invasie ( P Restaurant < 0,001), lymfeklier metastase ( P Restaurant < 0,001), metastasen op afstand ( P
= 0,022), en geavanceerde TNM stadium ( P
= 0,01) (Tabel S1). In tegenstelling tot hogere cycline D1 en Ets1 transcript niveaus werden aangetroffen bij maagkanker weefsels ( P Restaurant < 0,0001 en P Restaurant <.. 0,0001, respectievelijk figuur 1B en figuur 1C). Er was een omgekeerde correlatie tussen miR-9 expressie en cycline D1 transcript niveaus in maagkanker weefsels ( P
. ≪ 0,001, figuur 1D). Daarnaast werd er een omgekeerde correlatie tussen miR-9 expressie en Ets1 transcript niveaus ook opgemerkt in deze kanker weefsels ( P
. ≪ 0,001, figuur 1E). Lagere miR-9 expressie en hogere transcript niveaus van cycline D1 en Ets1 waargenomen bij maagkanker cellijnen niet onder normale maagepitheel GES-1-cellen [20] (figuur 1F.). Immunohistochemische kleuring werd uitgevoerd om de expressie van cycline D1 en Ets1 observeren deze kanker monsters (Fig. S1). Nucleaire cycline D1 werd opgemerkt bij 26/86 (30,2%) gevallen, terwijl de nucleaire en cytoplasma kleuring van Ets1 in 58/86 (67,4%) gevallen (tabel S1) werd waargenomen. De immunoreactiviteit van cycline D1 en Ets1 significant hoger bij maagkanker gevallen diepere maagwand invasie ( P
< 0,001 en P
= 0,001), lymfeklier ( P Restaurant < 0,001 en P Restaurant < 0,001), metastasen op afstand ( P Restaurant < 0,001 en P Restaurant < 0,001), en geavanceerde TNM stadium ( P Restaurant < 0,001 en P
= 0,004) (Tabel S1). Lagere miR-9 expressie werd waargenomen in maagkanker weefsels met hogere immunokleuring van cycline D1 ( P Restaurant < 0,0001, figuur 1G.) Of Ets1 ( P
. ≪ 0,0001, Fig 1H ). Deze resultaten gaven aan dat miR-9 werd down-gereguleerd en omgekeerd gecorreleerd met expressie van cycline D1 en Ets1 bij maagkanker weefsels en cellijnen.

miR-9 down-gereguleerd de expressie van cycline D1 en Ets1 door post -transcriptional repressie

de hypothese dat miR-9 de expressie van cycline D1 en Ets1 kunnen beïnvloeden maagkanker onderzoeken, werd computationele voorspelling uitgevoerd door miRNA databases. Potentiële bindingsplaatsen van miR-9 met een hoge complementariteit werden waargenomen bij bases 2974-2995 van de cycline D1 3'-UTR en 2648-2670 van de Ets1 3'-UTR (Fig. 2A). De directe effecten van miR-9 op de expressie van cycline D1 en Ets1 bij maagkanker cellen te onderzoeken, voerden we het miRNA overexpressie experimenten. Stabiele transfectie van miR-9 voorloper in SGC-7901 en AGS cellen leidde tot toename van miR-9 niveaus (afb. S2). Western blot, RT-PCR en real-time kwantitatieve RT-PCR liet zien dat over-expressie van miR-9 tot een verlaagde proteïne en transcriptionele niveaus van cycline D1 en Ets1 bij maagkanker cellen dan getransfecteerd met een negatieve controlevector (mock) ( fig. 2B, fig. 2C en Fig. 2D). Bovendien, de niveaus van gefosforyleerd retinoblastoom (PRB een stroomafwaartse effector van cycline D1) [21] en matrix metalloproteinase 9 (MMP-9, een stroomafwaarts gen Ets1) [22] werden afgenomen miR-9 overexpressie kankercellen (Fig. 2B, Fig. 2C en Fig. 2D). De onderdrukkende functie van miR-9 in de expressie van cycline D1 en Ets1 verder te onderzoeken, voerden wij de miR-9 knockdown experimenten door transfectie van anti-miR-9 of negatieve controle (anti-NC) inhibitoren in GES-1, SGC -7901 en AGS-cellen. Transfectie van anti-miR-9 remmer duidelijk verminderde de endogene miR-9 expressie (Fig. S3A) en opgereguleerd de eiwitniveaus van cycline D1, prB, Ets1 en MMP-9 dan getransfecteerd met anti-NC (fig. 2E en fig. S4A). Real-time kwantitatieve RT-PCR analyses toonde de verhoogde transcriptie niveaus van cycline D1, Ets1 en MMP-9 in gekweekte cellen die met anti-miR-9 inhibitor, in vergelijking met die getransfecteerd waren met anti-NC (fig. 2F en Fig. S4B). Over het algemeen zijn deze resultaten toonden aan dat miR-9 van de expressie van cycline D1 en Ets1 aanzienlijk geremd door post-transcriptionele repressie.

miR-9 rechtstreeks gericht cycline D1 en Ets1 bij maagkanker cellen

Om bepalen of miR-9 de expressie van cycline D1 en Ets1 kon onderdrukken doelwit zijn bindingsplaatsen in de 3'-UTR, de PCR producten die intact doelplaatsen of mutatie van miR-9 seed herkenningssequenties (Fig. 3A) werden in de luciferase reporter vector. De plasmiden werden getransfecteerd in maagkanker cellen die stabiel getransfecteerd met negatieve controlevector (mock) of miR-9 precursor. De Renilla
luciferase activiteiten genormaliseerd aan die van vuurvlieg waren significant verminderd in SGC-7901 en AGS-cellen die stabiel getransfecteerd met miR-9 precursor (afb. 3B), en deze effecten werden afgeschaft door het muteren van de vermeende miR-9 bindingsplaatsen in de 3'-UTR van cycline D1 en Ets1 (fig. 3B). Bovendien knockdown van miR-9 met anti-miR-9 remmer verhoogde de luciferase activiteiten in GES-1, SGC-7901 en AGS cellen (Fig. 3C en Fig. S4C), terwijl mutatie van miR-9 herkenningsplaats afgeschaft deze effecten (Fig. 3C en Fig. S4C). Deze resultaten gaven aan dat miR-9 rechtstreeks en specifiek interactie met de doelgroep sites in de 3'-UTR van cycline D1 en Ets1.

miR-9 onderdrukte de In vitro
proliferatie van maagkanker cellen door targeting cycline D1

Aangezien bovengenoemde gegevens blijkt dat miR-9 remde de cycline D1 expressie, en het combineren van het feit dat cycline D1 speelt een cruciale rol in de celcyclus en proliferatie van kankercellen [21], we nader onderzoek gedaan naar de effecten van de miR-9 over-expressie en target-gen restauratie op gekweekte maagkanker cellen. Western blot en real-time kwantitatieve RT-PCR gaven aan dat transfectie van cycline D1, maar niet Ets1, redde de miR-9-geïnduceerde neerwaartse regulatie van cycline D1 (Fig. 4A en fig. 4B). In kolonievorming assay miR-9 overexpressie verzwakt de groei van SGC-7901 en AGS-cellen, vergeleken met die getransfecteerd met negatieve controlevector (mock) (Fig. 4C). Flowcytometrie aangegeven dat miR-9 overexpressie geïnduceerde celcyclus bij G _{0 /G 1 fase in SGC-7901 en AGS-cellen (Fig. 4D). Bovendien transfectie van cycline D1, maar niet Ets1, in SGC-7901 en AGS cellen die weer de proliferatie remmen en celcyclus geïnduceerd door overexpressie van miR-9 (Fig. 4C en Fig. 4D). Anderzijds, onderzochten we de effecten van miR-9 knockdown on GES-1, SGC-7901 en AGS cellen. Instelling van anti-miR-9 remmers in deze cellen leidde tot verhoogde capaciteiten in proliferatie (fig. S3B) en de voortgang van de celcyclus (Fig. S3C). Deze resultaten gaven aan dat miR-9 opmerkelijk onderdrukte de In vitro
proliferatie en voortgang van de celcyclus van maagkanker cellen door targeting cycline D1.}

miR-9 verzwakt de In vitro
migratie en invasie van maagkanker cellen door targeting Ets1

Sinds vorige studies wijzen op de belangrijke rol van Ets1 in de invasie en uitzaaiing van kankercellen [23], [24], we nader onderzoek gedaan naar de effecten van de buitenspiegels 9 over-expressie en doelgen restauratie van de migratie en invasie van maagkanker SGC-7901 en AGS-cellen. Western blot en real-time kwantitatieve RT-PCR gaven aan dat transfectie van Ets1, maar niet die van cycline D1, redde de miR-9-geïnduceerde neerwaartse regulering van Ets1 (fig. 5A en fig. 5B). In Transwell migratieanalyse, maagkanker cellen stabiel getransfecteerd met miR-9 precursor gepresenteerd een verslechterde migratie capaciteit dan getransfecteerd met een negatieve controlevector (mock) (Fig. 5C). In Matrigel invasie assay, miR-9 overexpressie verzwakt het invasieve karakter van SGC-7901 en AGS-cellen (Fig. 5D). Daarnaast transfectie van Ets1, maar niet die van cycline D1, in SGC-7901 en AGS cellijnen herstelde de miR-9-meditaed remming van de migratie en invasie (Fig. 5C en fig. 5D). Verder hebben we onderzocht de effecten van miR-9 knock-down on GES-1, SGC-7901 en AGS-cellen. Transfectie van anti-miR-9 remmer resulteerde in verhoogde migratie en invasie van deze cellen (Fig. S3D en fig. S3E). Deze resultaten gaven aan dat miR-9 opmerkelijk verzwakt de In vitro
migratie en invasie van maagkanker cellen door targeting Ets1.

miR-9 verzwakt de groei en uitzaaiing van maagkanker cellen in vivo

vervolgens onderzochten we de effectiviteit van miR-9 tegen tumorgroei en metastase in vivo
. Stabiele transfectie van miR-9 precursor in SGC-7901 of AGS cellen resulteerde in verminderde groei en het gewicht van subcutane xenograft tumoren in athymische naakt muizen, in vergelijking met die stabiel met negatieve controlevector (mock) (fig. 6A en fig. 6B ). Bovendien is de expressie van cycline D1, Ets1 en downstream MMP-9 werd verlaagd met stabiele transfectie van miR-9 precursor (fig. 6C). Het CD31-positieve gemiddelde vaatdichtheid werd binnen tumoren gevormd door injectie van kankercellen stabiel getransfecteerd met miR-9 precursor (fig. 6D) verminderd. In de experimentele metastase studies, SGC-7901 of AGS-cellen die stabiel getransfecteerd met miR-9 voorloper opgericht statistisch minder longen uitgezaaide kolonies dan mock-groep (fig. 6E). Deze resultaten suggereren dat miR-9 remde de groei en uitzaaiing van maagkanker cellen In vivo
.

Knockdown van cycline D1 en Ets1 phenocopied miR-9 overexpressie-gemedieerde remming van de proliferatie , migratie en invasie van maagkanker cellen in vitro

Sinds bovenstaande resultaten gewezen op de negatieve regulatie van cycline D1 en Ets1 expressie door miR-9, we de hypothese dat knock-down van cycline D1 en Ets1 macht oefenen vergelijkbare effecten op gekweekte cellen maagkanker. De kleine interfererende RNA's (siRNA's) gericht op de coderende gebied van cycline D1 en Ets1, si-CCND1 en si-Ets1, werden ontworpen en getransfecteerd in SGC-7901 en AGS-cellen. Transfectie van si-CCND1 en si-Ets1 leidt tot een verminderde expressie van cycline D1, prB, Ets1 en MMP-9 bij maagkanker cellen, respectievelijk, in vergelijking met die getransfecteerd met scramble siRNA (si-Scb) (Fig. 7A, Fig . 7D en fig. S5). Knockdown van cycline D1 onderdrukt de proliferatie en geïnduceerde celcyclus bij G _{0 /G 1 fase in SGC-7901 en AGS-cellen (Fig. 7B en fig. 7C). Bovendien knockdown van Ets1 in SGC-7901 en AGS cellen leidt tot een verminderde capaciteit van migratie en invasie (fig. 7E en fig. 7F). Deze resultaten suggereren dat knock-down van cycline D1 en Ets1 phenocopied miR-9 over-expressie in het remmen van de proliferatie, migratie en invasie van maagkanker cellen In vitro
.}

Discussie

het is algemeen bekend dat de miR-9 expressie profiel in kanker is afhankelijk van weefsel distributie. In primaire hersentumoren, miR-9 is verhoogd en functioneert als een essentiële factor voor neurale carcinogenese [10]. miR-9 is ook overexpressie gebracht bij cervicale kanker [11], wijst erop tumorpromotor rol bij tumorontwikkeling en progressie. Echter, miR-9 neerwaarts gereguleerd in verschillende menselijke kankers, waaronder alvleesklierkanker [12], ovariale kanker [13] en colorectale kanker [14], en wordt geassocieerd met maligne progressie van borstkanker [25] en colorectale kanker ( 14). Luo et al.
Nota genomen van de down-regulatie van miR-9 in 24 maagkanker specimens [15], die vervolgens in 9 [16] werd bevestigd, 72 [17] en 13 [18] maagkanker gevallen. Echter, Inoue et al.
Meldde de opregulatie van miR-9 in 5 maagkankerpatienten door real-time PCR-gebaseerde miRNA arrays [26], en dat anders vaststelling in miR-9 expressieprofiel kan worden veroorzaakt door de heterogeniteit van beperkte specimens. In deze studie demonstreren we dat miR-9 significant neerwaarts gereguleerd in 86 primaire maagkanker monsters dan in naburige niet-neoplastische weefsels, hetgeen consistent is met eerdere bevindingen [15] - [18]. Belangrijker bevestigen wij dat miR-9 expressie omgekeerd geassocieerd met klinische fasen, invasie en metastase van maagkanker. Bij mensen wordt het rijpe miR-9 gecodeerd door drie onafhankelijke genen, miR-9-1, miR-9-2 en miR-9-3, van bij chromosomen 1, 5 en 15, respectievelijk [27]. Er werd vastgesteld dat de downgereguleerde miR-9 expressie bij maagkanker wordt veroorzaakt door afwijkende hypermethylering van het promotorgebied van miR-9 coderende genen [17]. Evenzo wordt afwijkende hypermethylatie van miR-9 familie genen ook gemeld bij sommige primaire tumoren met lymfeknoop metastase, zoals darmkanker, longkanker, borstkanker, melanoom en [14], [28]. Belangrijk is dat de huidige studie rapporteerde de inverse correlatie tussen miR-9 niveaus en de expressie van cycline D1 en Ets1 bij maagkanker weefsels, implicerend dat cycline D1 en Ets1 negatief worden gereguleerd door miR-9.

De functie en doelwitgenen van miR-9 zijn tumorspecifieke en afhankelijk van de cellulaire context. miR-9 kan E-cadherine-expressie te onderdrukken bij borstkanker [29], waardoor de nucleaire translocatie van β-catenine en zijn binding met transcriptiefactoren T-cel groeifactor /lymfoïde enhancer factor 1, en vervolgens opwaarts gereguleerd transcriptie van genen die proliferatie en angiogenese [29] cellen vergemakkelijken. Geforceerde miR-9-expressie in borstkanker cellijnen leidt ook tot significante veranderingen van meerdere genen in de p53-gerelateerde apoptotische route [30] expressie. Door direct targeting NF-KB, ectopische expressie van miR-9 remt de In vitro Kopen en In vivo
groei van eierstokkanker cellen [31] en de groei en uitzaaiing van melanomen [32] . In neuroblatoma, overexpressie van miR-9 remt de invasie, metastase en angiogenese van tumorcellen door targeting matrix metalloproteinase 14 [33]. Wan et al.
Gemeld dat overexpressie van miR-9 remde de In vitro Kopen en In vivo
groei van adenocarcinoom cellijn MGC803 door middel van het onderdrukken van NF-KB bij de post-transcriptie niveau [16]. Echter, in een recente studie, Rotkrua et al.
Aangegeven dat miR-9 zou kunnen worden betrokken bij maagkanker door middel van naar beneden reguleren CDX2 en knock-down van miR-9 daalde de In vitro
proliferatie van maagkanker MKN-45 cellen [19], terwijl hun bevindingen verder hoeven te worden versterkt met miR-9 over-expressie, target-gen redding, en in vivo
studies. Bovendien is het momenteel controversieel of CDX2 een oncogeen of tumor suppressor rol bij maagkanker [34] bereikt, [35]. Bovendien is de potentiële rol van miR-9 in de invasie en metastase van maagkanker zijn tot nu toe niet opgehelderd. Dus de functie en directe doelwitten van miR-9 bij maagkanker rechtvaardigen verder onderzoek.

In deze studie hebben we aangetoond dat overexpressie van miR-9 verzwakt de proliferatie, migratie en invasie van maagkanker cellen, die overeenkomt met die van cycline D1 of Ets1 knockdown, suggereert de mogelijke toepassing van miR-9 als doelwit voor de therapeutische maagkanker. Bovendien, onze data bevestigden dat miR-9 rechtstreeks gericht cycline D1 en Ets1 bij maagkanker cellen door 3'-UTR luciferase reporter assay. Aangezien uit recente cijfers blijkt dat bepaalde miRNAs als alternatief kan moduleren genexpressie door interactie met de initiatiefnemers [36] - [38], de mogelijke rol van miR-9 in het reguleren van de transcriptie van cycline D1 en Ets1 door middel van interactie met de initiatiefnemers blijven onduidelijk en garandeert onze verdere onderzoek. Cycline D1 is een proto-oncogen, dat behoort tot de familie van G _{1 cyclinen, en speelt een belangrijke rol bij de celcyclus G 1 S overgang in bindende partners cycline afhankelijke kinase 4 en 6 tot fosforyleren en inactiveren de RB-eiwit [21]. Overexpressie van cycline D1 is een vroege gebeurtenis bij carcinogenese in humane colorectale, slokdarm en galblaas kanker [39] en is een prognostische indicator geassocieerd met slechte overleving bij slokdarmkanker, borst en urinaire kanker [39]. Cycline D1 overexpressie in menselijke kankers wordt toegelicht door meerdere mechanismen, waaronder genomische veranderingen, post-transcriptionele regulatie, en post-translationele eiwit stabilisatie [39]. Uit recente gegevens blijkt dat miR-16-1 onderdrukt cycline D1 uitdrukking bij de post-transcriptie regelen via binding haar 3'-UTR in mantelcellymfoom [40]. In de huidige studie, onze bevindingen toonden aan dat miR-9-gemedieerde inhibitie op de voortgang van de celcyclus en celproliferatie werd gered door herstel van cycline D1 expressie in maagkanker cellen, wat suggereert dat de identificatie van cycline D1 als miR-9 doelgen, kan verklaren, althans ten dele, waarom overexpressie van miR-9 onderdrukt de proliferatie van maagkanker cellen.}

Ets1, lid van ETS familie van transcriptiefactoren, bindt aan specifieke DNA-sequenties die een GGAA /T kern motief [22], en neemt in tumorinvasie en metastase door de transcriptionele regulatie van verschillende genen voor extracellulaire matrix remodeling, migratie en invasie, zoals matrix metalloproteinase en urokinase plasminogeen activator [22]. Tot op heden zijn een toenemend aantal klinische studies de belangrijke rol van Ets1 getoond in tumorontwikkeling en progressie van diverse solide tumoren [23], [24]. Er werd vastgesteld dat Ets1 expressie verband houdt met de klinische en pathologische kenmerken van maagkanker, waaronder tumor infiltratie en lymfeklieren of distale metastase, wijst erop cruciale rol in de invasie en metastase van maagkanker [41]. Echter, de mechanismen die ten grondslag liggen aan de Ets1 over-expressie bij maagkanker nog steeds grotendeels onbekend. Recente studies onthullen de post-transcriptionele regulatie van Ets1 door miR-125b in borstkankercellen [42], en door miR-200b in endotheelcellen [43]. In deze studie hebben we aangetoond dat een direct doelwit van miR-9, Ets1 werd opwaarts gereguleerd bij maagkanker en bijgedragen aan de migratie en invasie van kankercellen. Knockdown van Ets1 gedeeltelijk de effecten van miR-9 phenocopied overexpressie bij maagkanker cellijnen, terwijl herstel van Ets1 expressie redde de kankercellen van miR-9-gemedieerde remming van de migratie en invasie, onthullen een nieuwe post-transcriptionele regulatiesysteem van Ets1 van miR-9 en de klinische mogelijkheden bij maagkanker.

Samengevat hebben we aangetoond, voor het eerst, dat miR-9 onderdrukt de expressie van cycline D1 en Ets1 met direct gericht zijn 3 ' -UTR verhindert daarmee de proliferatie, invasie en metastase van maagkanker cellen. Deze studie breidt onze kennis over de regulatie van cycline D1 en Ets1 bij de post-transcriptie niveau miRNA, en suggereert dat miR-9 van mogelijke waarden kunnen worden als een nieuw therapeutisch doelwit voor maagkanker.

Materialen en methoden

Patient weefselmonsters

goedkeuring om dit onderzoek uit te voeren werd verkregen uit de Institutional review Board van Tongji Medical College (erkenningsnummer: 2010-S003). Paraffine ingebedde en verse exemplaren van 86 primaire maagkanker gevallen werden verkregen van de afdeling Chirurgie, Union Ziekenhuis van Tongji Medical College. De pathologische diagnose werd bevestigd door ten minste twee pathologen. De demografische en klinische en pathologische gegevens van alle patiënten zijn samengevat in Tabel S1. Grenzend maagslijmvlies dat geen macroscopische tumor bevatte werd verkregen en de niet-neoplastische gebieden werden vervolgens microscopische histologie geverifieerd. De verse tumormonsters en naburige niet-neoplastische mucosa werden verzameld en bewaard bij -80 ° C tot gebruik.

Immunohistochemie

Immunohistochemische kleuring werd uitgevoerd zoals eerder beschreven [44], met antilichamen specifiek voor cycline D1, Ets1, MMP-9 en CD31 (Abcam Inc., Cambridge, MA, 1: 200 verdunningen). De negatieve controles opgenomen evenwijdige gedeelten behandeld met weglating van het primaire antilichaam, naast een aangrenzend deel van hetzelfde blok waarin het primaire antilichaam werd vervangen door konijnen polyklonaal IgG (Abcam Inc) als isotype controle. De reactiviteit mate werd bepaald door ten minste twee pathologen zonder kennis van de klinische en pathologische kenmerken van tumoren. De mate van positiviteit werd oorspronkelijk geclassificeerd volgens het percentage positieve kankercellen als de volgende: (-) < 5% cellen positief, (1+) 6-25% cellen positief, (2+) 26-50% cellen positief en (3+) > 50% van de cellen positief. Dia's met een matige positieve (2+) of sterk positief (3+) reactiviteit werden geclassificeerd als met een "hoge expressie", terwijl dia's met een negatieve (-) of zwak positieve (1+) reactiviteit werden geclassificeerd als met een "lage expressie" .

Western blot

cellulair eiwit werd geëxtraheerd met 1 x cell lysis buffer (Promega, Madison, WI). Eiwit (50 ug) van elk monster werd onderworpen aan 4-20% pre-cast polyacrylamide gel (Bio-Rad, Hercules, CA) elektroforese en overgebracht naar nitrocellulose membranen (Bio-Rad). Voor cycline D1, Ets1, MMP-9, PRB en β-actine (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, Californië) detectie, het primaire antilichaam verdunningen waren 1:500, 1:500, 1:500, 1:500 en 1: 1000, respectievelijk, gevolgd door 1:3000 verdunning van geit anti-konijn mierikswortel peroxidase-gelabeld antilichaam (Bio-Rad). Versterkte chemiluminescentie substraat kit (Amersham, Piscataway, NJ) werd gebruikt voor de detectie van signalen chemiluminscent met autoradiografie film (Amersham).

RT-PCR en real-time kwantitatieve RT-PCR

Totaal RNA werd geïsoleerd met RNeasy Mini Kit (Qiagen Inc., Valencia, CA). De reverse transcriptiereacties werden uitgevoerd met Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit (Roche, Indianapolis, IN). De PCR primers voor cycline D1, Ets1, MMP-9 en β-actine werden door Primer Premier 5.0 software (tabel S2). RT-PCR werd uitgevoerd zoals eerder beschreven [44]. Real-time kwantitatieve RT-PCR met SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems, Foster City, CA) werd uitgevoerd onder toepassing van ABI Prism 7700 Sequence Detector (Applied Biosystems). De fluorescentiesignalen werden genoteerd gedurende extensie fase werden Ct-waarden van de monsters berekend en het transcript niveaus van cycline D1, Ets1 en MMP-9 werden genormaliseerd aan die van β-actine van 2 ^{-ΔΔCt methode.}

Het kwantificeren van miR-9 expressie

De niveaus van volwassen miR-9 in de primaire weefsels en cellijnen werden bepaald met behulp van Bulge-Loop ™ miRNAs qPCR Primer Set (RiboBio Co Ltd, Guangzhou, China). Na cDNA werd gesynthetiseerd met een miRNA-specifieke stamlus primer, werd de kwantitatieve PCR uitgevoerd met de specifieke primers (Tabel S2). De miR-9 niveaus werden genormaliseerd aan die van U6 snRNA. Werden

miRNA doelwit voorspelling

miRNA targets voorspeld met behulp van de algoritmes Miranda, miRDB, RNA22 en Targetscan [45]. Om de genen die gewoonlijk voorspeld door vier verschillende algoritmes identificeren, de resultaten van voorspelde targets gesneden middels miRWalk [46].

Celkweek en transfectie

Human maagkanker cellijnen (SGC-7901 en MKN-74) en SV40-getransformeerde, normaal en niet-tumorigene maag epitheel GES-1-cellen [20] werden verkregen van de Type Culture Collection van de Chinese Academie van Wetenschappen (Shanghai, China). Human maagkanker cellijn AGS (CRL-1739) werd gekocht bij American Type Culture Collection (Rockville, MD). Cellen werden gekweekt in RPMI1640 medium (Life Technologies, Inc., Gaithersburg, MD) aangevuld met 10% foetaal runderserum (Life Technologies, Inc.), penicilline (100 U /ml) en streptomycine (100 ug /ml). Cellen werden bij 37 ° C in een bevochtigde atmosfeer van 5% CO _{2 gehandhaafd.}

• PLoS ONE: associatie tussen Vermindering van de Plasma Adiponectin Levels en risico van bacteriële infectie na maagkanker chirurgie
• PLoS ONE: Expressie van AFP en STAT3 is betrokken bij Arseentrioxide-geïnduceerde apoptose en remming van proliferatie in AFP-producerende maagkanker Cellen