PLoS ONE: Den romlige fordelingen av LGR5 + Cells korrelerer med Gastric Cancer Progresjon

Abstract

I denne studien testet vi utbredelsen, histoanatomical distribusjon og svulst biologiske betydningen av Wnt målet protein og kreft stamcelle markør LGR5 i svulster i fordøyelsessystem. Differensiell ekspresjon av LGR5 ble studert på transkripsjonen (real-time PCR) og translasjonelt nivå (immunhistokjemi) i maligne og tilsvarende ikke-maligne vev av 127 pasienter som består av seks forskjellige primære tumor-stedet, for eksempel spiserør, mage, lever, pancreas, colon og rektum. Den klinisk-patologisk betydning LGR5 uttrykk ble undersøkt hos 100 pasienter med magekreft (GC). Ikke-neoplastisk vev vanligvis næret bare svært få spredt LGR5 ^{+ celler. De tilsvarende karsinom i spiserøret, magesekk, lever, bukspyttkjertel, tykktarm og endetarm viste signifikant flere LGR5 + celler samt betydelig høyere nivåer av LGR5-mRNA sammenlignet med tilsvarende ikke-neoplastisk vev. Doble flekker eksperimenter viste en koekspresjon av LGR5 med de antatte stamcellemarkører CD44, Musashi-1 og ADAM17. Neste vi testet hypotesen om at de sekvensielle endringer av magekreftutvikling, dvs. kronisk atrofisk gastritt, intestinal metaplasi og invasivt karsinom, er forbundet med en omfordeling av LGR5 + celler. Interessant, den romlige fordelingen av LGR5 endret: i ikke-neoplastiske mageslimhinnene, LGR5 + celler ble funnet hovedsakelig i den mukøse nakkeregionen; i intestinal metaplasi LGR5 + celler ble lokalisert ved krypten base, og i GC LGR5 + celler var tilstede på luminal overflaten, svulsten sentrum og invasjonen fronten. Uttrykket av LGR5 i svulsten sentrum og invasjon foran GC korrelerte signifikant med den lokale tumorvekst (T-kategorien) og nodal spredning (N-kategori). Videre pasienter med LGR5 + GCer hadde en kortere median overlevelse (28,0 ± 8,6 måneder) enn pasienter med LGR5 - GCer (54,5 ± 6,3 måneder). Våre resultater viser at LGR5 er forskjellig uttrykt i gastrointestinale kreftformer, og at den romlige histoanatomical fordelingen av LGR5 + celler har å bli vurdert når deres svulst biologiske betydningen er søkt}

Citation. Simon E, Petke D, Böger C, Behrens HM, Warneke V, Ebert M, et al. (2012) Den romlige fordelingen av LGR5 ^{+ Cells korrelerer med Gastric Cancer Progresjon. PLoS ONE 7 (4): e35486. doi: 10,1371 /journal.pone.0035486}

Redaktør: Irina V. Lebedeva, Enzo Life Sciences, Inc., USA

mottatt: 5 juli 2011; Godkjent: 16 mars 2012; Publisert: 18 april 2012

Copyright: © 2012 Simon et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres

Finansiering:. Disse forfatterne har ingen støtte eller finansiering for å rapportere

konkurrerende interesser:.. forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer

Innledning

Gastrointestinale Kreftsvulster er blant de vanligste kreftformer og er en ledende årsak til kreft dødsfall på verdensbasis [1], [2]. Årsakene til den dårlige prognosene er komplekse: mange kreft i mage-tarmkanalen er diagnostisert i avansert stadium eksklusive kurativ behandling, er det ingen pålitelige tumor markører som kan tillate tidlig diagnose eller screening av høyrisikogrupper. Behandlingsalternativene er begrenset i lokalavansert eller metastatisk sykdom, og et betydelig antall tumorer gjenoppstå til tross for innledende terapeutisk respons [3]. En antatte forklaring av en lite effektiv terapi er tilstedeværelsen av kreft stamceller (CSC). CSC hypotese postulerer at en svulst er et konglomerat av heterogene cellepopulasjoner. Bare en subpopulasjon av dette konglomerat opprettholder evnen til kolonidannelse, og følgelig tilbakefall og metastatisk spredning. Cscs er mer resistente overfor kjemoterapi, som fører til tumor gjentakelse, progresjon og pasient til slutt død [4], [5]. Mens CSC-modellen er i økende grad akseptert, er identifikasjon og bekreftelse av såkalte stamcellemarkører i naturlig humant vev vanskelig og stort sett fraværende. Nylig, leucine-rik, G-proteinkoblet reseptor (GPCR) og Wnt målet genet LGR5
ble identifisert som en roman stamcelle markør av tynntarm, tykktarm og i hårsekkene til mus [6] . Uttrykk av LGR5 i flere andre organer indikerer at det kan representere en global markør for voksne stamceller. Men lite er kjent om dens uttrykk i lever og mage-tarmkanalen hos mennesker.

I denne studien vi forsøkte å fylle dette gapet av informasjon og testet hypotesen om at kreftstamcelle markør LGR5 har prognostisk og svulst biologisk betydning.

Materialer og metoder

fag

Formalin-fiksert og parafin-embedded ondartede og tilsvarende ikke-ondartet vev fra 127 pasienter med seks anatomiske steder i lever og mage kanalen (dvs. spiserør, magesekk, lever, bukspyttkjertel, tykktarm og endetarm) ble hentet fra arkiver i Institutes of Pathology av Christian-Albrechts-universitetet i Kiel og Charité universitetssykehus Berlin (begge Tyskland). Alle pasientene ble operert i begge universitetssykehus Schleswig-Holstein (1997-2009) eller Charité universitetssykehus Berlin (1995-2008, tabell 1). Ufikserte, friskt frosset vev var tilgjengelig fra 105 av disse pasientene med åtte forskjellige tumortyper, dvs. Barretts adenokarsinomceller (9 pasienter) og karsinomer (7) av spiserøret, tarmen (19) og diffuse (21) type magekreft, adenokarsinom i tykktarmen (19) og endetarmen (20), hepatocellulært karsinom (HCC, 4), og kolangiokarsinom (CC, 6). De pasientkarakteristika er oppsummert i tabell 1.

En uavhengig serie av 487 mage kreftpasienter ble hentet fra arkivet ved Institutt for patologi av Christian-Albrechts-University (tabell 2 og tabell 3). Disse pasientene hadde gjennomgått enten helt eller delvis gastrektomi for adenokarsinomer i magen eller oesophago-mage-krysset. Hver reseksjon prøven hadde gjennomgått histologisk undersøkelse av kvalifisert kirurgiske patologer. Tidspunktet for pasientens død ble hentet fra Epidemiologisk Kreftregisteret
av staten Schleswig-Holstein, Tyskland. Oppfølgingsdata for pasienter fortsatt i live ble hentet fra sykehuset poster og ved å kontakte de allmennleger.

Etikk erklæringen

Alle vevsprøver ble oppnådd som en del av en diagnostisk eller terapeutisk kirurgi utført etter pasienten ga skriftlig informert samtykke. Pasienter som tilbyr prøvene for studien ble pseudonymized og analysert anonymt, så ingen individuelle relaterte data finnes i databasen. Studien ble godkjent av lokale etikkutvalg ved Universitetssykehuset i Kiel, Tyskland (ref. Nummer D 453/10).

Sanntids revers transkriptase polymerase chain reaction

Total RNA var isolert fra dyrkede celler og cryoconserved vev ved hjelp Ambion sin Mirvana miRNA Isolation Kit (Applied Biosystems, Darmstadt, Tyskland) etterfulgt av en DNase behandling med Turbo DNA-free kit (Ambion). RNA kvalitet ble vurdert i en 1,5% agarosegel. For cDNA-syntese, 2 mikrogram av total RNA ble revers transkribert ved hjelp av Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit (Roche Diagnostics, Mannheim, Tyskland). Genspesifikke primere ble syntetisert ved Biomers.net (Ulm, Tyskland) (tabell S1). Sanntids revers transkriptase polymerasekjedereaksjon (Real-time RT-PCR) ble utført ved anvendelse av LightCyler® 480 Probes Master (Roche) og LightCycler® 480 System (Roche). Sammenlignings Ct-verdier ble normalisert til at tre housekeeping gener: Homo sapiens succinatdehydrogenase komplekse, underenhet A, flavoprotein (Fp) (SDHA), Homo sapiens kalpain 2 (CAPN2) Hotell og Cyklofilin C ( CYCC)
. Templat-kontroller (ingen cDNA i PCR) ble kjørt for hvert gen å oppdage uspesifikke eller genomisk forsterkning og primer dimerization. Alle forsøkene ble utført i duplikater.

Produksjon og rensing av en anti-LGR5-antistoff

Polyklonalt antisera ble samlet mot den karboksy-terminale hale av den humane LGR5 reseptoren. Kaniner ble immunisert med tre forskjellige peptider av identiteten til SPAYPVTESCHLSSVAFVPCL (kalt Cterm), RSKHPSLMSINSDDVEKQSC (kalt 11b), CSITYDLPPSSVPSPAYPVTE (kalt 12) ved Pineda-abservice (Berlin, Tyskland). Monospesifikt IgG ble renset ved hjelp av hurtig protein-væskekromatografi med ÄKTAprime ™ -system (GE Healthcare, Uppsala, Sverige) ved anvendelse av en protein A-kolonne (GE Healthcare). For alle påfølgende analyser, dvs. immunfluorescens, immunocytochemistry, western blot og immunhistokjemi, de mono IgG-fraksjonen var affinitetsrenset mot immuniserer peptider ved Pineda-abservice. I dot blot analyser og immunhistokjemiske undersøkelser, vises de mono IgG anti-LGR5-11b antistoff høy affinitet sammen med sterk og spesifikk farging. Derfor ble dette antistoffet anvendt i denne studien. Reaktiviteten og spesifisiteten av det monospesifikke antistoffet ble karakterisert ved western blot; immunfluorescens og immunocytokjemiske analyser.

Plasmid konstruere

Expression konstruerer for LGR5 ble generert ved å forsterke hele kodende sekvens av humant LGR5 plakater (NM_003667.2) ved PCR (tabell S1 ). For å lette subkloning av det amplifiserte fragment i ekspresjonsvektoren pcDNA3.1 (-), foroverprimeren inneholdt et Nhel restriksjonssete adapter og den reverse primeren inneholdt et BamHI-sete og et c-myc-tag for å bekrefte vellykket transfeksjon. PCR-fragmenter og pcDNA3.1 (-) ekspresjonsvektoren ble spaltet separat med Nhel og BamHI før ligering med T4-Ligase (Roche). Plasmidet ble verifisert ved fordøyelse med Nhel og BamHI og DNA-sekvensering ved hjelp av ABI PRISM BigDye Terminator Cycle Sequencing Klar Reaksjons Kits, versjon 2.0 (PE Applied Biosystems, Langen, Tyskland).

Cell kultur og transfeksjon

den menneskelige magekreft cellelinje MKN74 ble hentet fra det japanske helsefaglig forskning Resource (Osaka, Japan), MKN45 Bank og fra den tyske samlingen av mikroorganismer og cellekulturer (Braunschweig, Tyskland). HEK293 EBNA celler ble kjøpt av Invitrogen (Carlsbad, CA, USA). Cellene ble dyrket i RPMI 1640-medium (MKN74, MKN45) eller Dulbeccos modifiserte Eagle-medium (HEK293) supplert med 10% (MKN74, HEK293) eller 20% (MKN45) føtalt bovint serum, 100 U /ml penicillin og 100 ug /mL streptomycin (PAA Laboratories GmbH, Pasching, Østerrike). DNA transfeksjon av HEK293 EBNA, MKN74 og MKN45 celler ble gjort ved hjelp Lipofectamine LTX reagens (Invitrogen) i henhold til produsentens anvisninger. I korthet ble cellene dyrket i seks-brønns plater. Stabil transfeksjon av MKN74 og MKN45 med ekspresjonsplasmidene ble utført som tidligere beskrevet [7]. For transient transfeksjon av HEK293-celler 1 pg plasmid-DNA og 5 pl Lipofectamine LTX-reagens ble fortynnet i 500 ul Dulbeccos modifiserte Eagle-medium uten serum, respektivt. Etter inkubering i 30 minutter ved romtemperatur ble blandingen tilsatt til HEK293-celler. Førtiåtte timer etter transfeksjon, ble transfekterte celler høstet og RNA eller proteiner ble isolert. Celler transfektert med vektoren pcDNA3.1 (-) alene og utransfekterte celler tjente som negative kontroller

immunfluorescens

Tjuefire timer etter såing på CultureSlides (BD Biosciences, Erembodegem, Belgia),. cellene ble vasket med fosfatbufret saltløsning, fiksert i 07:03 acetone:methanol (20 min, -20 ° C) og deretter permeabilisert med 0,1% Triton-X (5 minutter, romtemperatur). Slides ble deretter inkubert med c-myc monoklonalt antistoff (Clontech, Mountain View, CA, USA) over natten ved 5 ° C i en fuktig kammer, etterfulgt av en anti-mus Alexa Fluor 555 konjugert sekundært antistoff (Invitrogen). For å detektere en vellykket transfeksjon av LGR5, ble celler inkubert med anti-LGR5-antistoff etterfulgt av et anti-kanin-sekundært antistoff konjugert med Alexa Fluor 488 (Invitrogen) som hver i én time ved romtemperatur. Utelatelse av primære antistoffer på LGR5 transfektert HEK293 EBNA celler tjente som negativ kontroll. Montering og kontra ble gjort med Vectashield Hard-Set inkludert DAPI (Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA, USA).

Immunocytochemistry

immunocytokjemisk farging ble utført på formalinfiksert, parafin- innebygd MKN45 mage kreftceller. For dette formål ble MKN45 cellene innleiret i små agarosekuler slik som beskrevet tidligere [8]. Videre behandling og farging med anti-LGR5-antistoff (fortynning 1:1000) ble utført i henhold til den immunhistokjemiske analyser av humane vevssnitt (se nedenfor). Utelatelse av det primære antistoff på LGR5 transfekterte celler MKN45 tjente som negativ kontroll, mens spesifisiteten av anti-LGR5-antistoff-farging ble bekreftet ved å inkubere antistoffet med det immuniserende peptid som blokkerer.

Western blotting

Protein lysates ble oppnådd ved å inkubere menneskelige mage vev og dyrkede mage celler med ProteoJET ™ Mammalian Cell Lysis Reagent (Fermentas, St. Leon-Rot, Tyskland) og proteasehemmer cocktail (Complete EDTA-fri, Roche). Proteinprøver ble denaturert i Laemmli-buffer (60 mM Tris-HCl pH 6,8, 2% natriumdodecylsulfat, 10% glycerol, 5% β-merkaptoetanol og 0,01% bromfenol blå) ved oppvarming til 95 ° C i ti minutter og ble deretter lastet på 4% til 16,5% SDS-polyakrylamidgeler og synliggjort ved farging med Coomassie-blått. Etter separering, ble proteiner på ufargede polyakrylamidgeler overført til en nitrocellulosemembran (Amersham, Freiburg, Tyskland), immunoblottet med anti-LGR5-antistoff (fortynning 1:20,000) og et anti-β-aktin-antistoff (1:10,000; klone AC-15, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) for å sikre like lasting beløp. Membran bundet HRP merket sekundære antistoffer (DakoCytomation, Glostrup, Danmark) ble oppdaget av forbedret chemiluminescence hjelp av ECL-system (Amersham). Utelatelse av det primære antistoff tjente som negativ kontroll, mens spesifisiteten av anti-LGR5-antistoff-farging ble bekreftet ved å inkubere antistoffet med det immuniserende peptid som blokkerer.

Histologi

For histologisk analyse, vev prøvene ble fiksert i 10% nøytralisert formalin og innstøpt i parafin. Deparaffinized seksjonene ble farget med hematoxylin og eosin (H & E). Magekarsinom ble klassifisert i henhold til WHO klassifisering [9]. Den pTNM stadium ble bestemt i henhold til 7 ^{th utgaven av International Union Against Cancer [10].}

Tissue micro array bygging

Formalin-fiksert og prøver parafininnstøpte vev var anvendt for å danne vev mikro matriser som tidligere beskrevet [11]. Fire mikrometer deler av den resulterende tumorvevet mikrofylte blokk ble skåret ut for videre analyse. Vellykket overføring av svulstvev ble bekreftet mikroskopisk bruker H &. E-fargede seksjoner

Immunohistochemistry

For immunhistokjemi, ble formalinfiksert og parafin-embedded seksjoner brukt. Farging ble utført med anti-LGR5-antistoff (fortynning 1:1000), et monoklonalt antistoff rettet mot CD44 (1:200; Novocastra Laboratories Ltd, Newcastle, GB) og kommersielle polyklonale antistoffer rettet mot LGR5 (LGR5 ^{com , 1:400; Abcam, Inc., Cambridge, MA, USA), ADAM17 (fortynning 1:50; Sigma-Aldrich) og Musashi-en (1:500; Chemicon International Inc., Temecula, CA, USA). Etter 20 minutter blokkerende med hydrogenperoksyd blokk (Thermo Scientific, Waltham, MA, USA), 5 minutters behandling med Ultra V Block (Thermo Scientific) og inkubering med det primære antistoff ble gjort i et fuktig kammer ved romtemperatur i 30 minutter. Platene ble vasket mellom trinnene med Tris-bufret saltvann (TBS). Immunreaksjoner ble visualisert med n-Histofine Simple Stain MAX PO System (Nichirei Bioscience, Tokyo, Japan) og DAB substrat (Linaris, Wertheim-Bettingen, Tyskland). For dobbel farging av LGR5 med CD44, ADAM17 og Musashi-en, ble frie bindingsseter blokkert med mus-IgG og kanin-IgG-kontroll (Abcam) fortynnet i antistoffdiluent (ZYTOMED Systems, Berlin, Tyskland) etter DAB-behandling. Prøvene ble kontra med hematoksylin. Utelatelse av det primære antistoff tjente som negative kontroller. Ikke-neoplastisk menneskelige magen (CD44) og hjernevev (LGR5 com, LGR5 og Musashi-1) tjente som positive kontroller.}

Evaluering av farging

Farging av ikke-neoplastisk epitel og kreftceller ble scoret ved å bruke en immunoreaktivitets scoring system (IRS). Kort beskrevet i kategori A dokumentert intensiteten av immunofarging som 0 (ingen farging), 1 (svak), 2 (middels) og 3 (sterk). Kategori B dokumentert prosentandelen av immunreaktive celler som 0 (negativ), 1 (spredte positive celler; ≤1%), 2 (2-10% positive celler), 3 (11-50%), 4 (51-80%) og 5 (> 80%). Tilsetningen av kategori A og B resulterte i en IRS varierende fra 0 til 8 for hvert enkelt tilfelle. Fordelingsendringer LGR5 ^{+ celler i 100 hele montere deler av tarm typen magekreft ble scoret som følger: antall immunreaktive celler ble kategorisert som 0 (negativ), 1 (< 10 positive celler), 2 (10 -50 positive celler) og 3 (> 50 positive celler) separat for luminal overflaten, tumorsenter og invasjonen foran}

Statistiske analyser

Statistiske analyser ble gjort ved hjelp av PASW Statistikk 18. statistikkpakke (SPSS Inc., Chicago, IL, USA). Sammenligninger mellom grupper ble testet ved anvendelse av Fishers eksakte test. Korrelasjon av LGR5 uttrykk innenfor en gruppe ble etablert av Kendall tau rang-orden korrelasjon. Overlevelseskurver ble utstyrt med Kaplan-Meier metoden og forskjeller i overlevelse vurdert av log rank test. Betydningen av korrelasjoner av LGR5 ekspresjon i primære tumorer og tilsvarende ikke-ondartet vev ble bestemt ved Wilcoxon test. Real-time RT-PCR data, som ble evaluert med en sammenkoblet tosidig t-test, fikk logarithmized å oppnå tilnærmet normalfordelte data. P-verdier. ≪ 0,05 ble ansett som statistisk signifikant

Resultater

LGR5-mRNA er forskjellig uttrykt i lever og mage karsinom

LGR5 ble angivelig uttrykt i murine stamceller tarm krypter [12] og ble ofte overuttrykt i tykktarm kreft cellelinjer [13]. For å undersøke dens uttrykk i ikke-neoplastiske og neoplastiske menneskelig vev, vurderte vi transkripsjons uttrykk for LGR5 i kliniske prøver som består av et bredt spekter av lever og mage-karsinomer. Real-time RT-PCR-analyse ble utført på en serie av 105 pasienter som omfatter ondartede og tilsvarende ikke-ondartet vev, hentet fra de samme pasientene, fra åtte ulike tumortyper: spiserør [Barrett adenokarsinomer (9 pasienter) og plateepitelkarsinom ( 7)], mage [tarm (19) og diffus type (21) gastrisk karsinom], lever [HCCs (4), CCs (6)], tykktarm (19) og endetarmen (20; tabell 1)
<. p> LGR5-mRNA var signifikant forskjellig uttrykt i adenokarsinomer i spiserøret (p = 0,007), mage [tarmtypen (p = 0,006) og diffus type (p = 0,013)], lever [CCs (p = 0,022)], tykktarm (p < 0,001) samt endetarmen (p = 0,002) sammenlignet med den samsvarende ikke-neoplastisk vev. Men ingen differensial uttrykk ble funnet i plateepitelkarsinom i spiserøret (p = 0,503) og HCCs sammenlignet med tilsvarende ikke-neoplastiske vev (p = 0,545; figur 1).

En polyklonale anti-LGR5- antistoff gjenkjenner menneskelige LGR5 transfektert i HEK293 og MKN45 celler

for ytterligere å undersøke histoanatomical fordeling av LGR5 i menneskelig vev og for å undersøke dens klinisk-patologisk betydning, en LGR5-spesifikt antistoff ble hevet, siden de kommersielt tilgjengelige antistoffer gjorde ikke oppfyller våre krav (Figur 2A). For å utelukke kryssreaktivitet av den nylig genererte antistoff med de strukturelt ligner LGRs, LGR4 og LGR6, vi utført en sekvens innretting med National Center for Biotechnology Information
justeringsverktøyet i forveien (data ikke vist). Ingen sekvens homologi ble funnet med LGR4 eller LGR6 i området ved LGR5 peptidet vi benyttet for immunisering. For valg av et meget spesifikt antistoff mot LGR5, ble klonet full lengde cDNA transfektert inn i HEK293 EBNA-celler og anvendt som en positiv mål å utføre immunfluorescens. Den LGR5 cDNA ble direkte merket med et myc-epitop, som muliggjorde evaluering av transfeksjon med et anti-myc-tag antistoff. Ved hjelp av immunfluorescens, binding av anti-myc-tag antistoff ble funnet etter inkubering med LGR5 /HEK293-celler, men ikke i tom vektor-transfekterte celler (vektor /HEK293), utransfekterte HEK293-celler, eller i den negative kontroll av LGR5 /HEK293-celler inkubert med antistoff-fortynningsmiddel i stedet for det primære antistoff. Samme resultat ble oppnådd når vi brukte anti-LGR5-antistoff (figur 3), noe som viser spesifikk merking av LGR5.

spesifisitet LGR5-immunomerking ble ytterligere validert ved hjelp av formalinfiksert og parafin-embedded MKN45 mage kreftceller. Cellene ble fremstilt og farget på en måte som paralleller til behandling av kliniske humane vevsprøver. Immunocytokjemisk analyse på parafinsnitt viste en positiv farging med anti-LGR5-antistoff på MKN45 celler som er stabilt transfektert med cDNA LGR5 (LGR5 /MKN45). I stedet tom vektor-transfekterte MKN45 celler (vektor /MKN45), så vel som den negative kontroll (utelatelse av det primære antistoff) og peptidet kontroll (pre-inkubering av antistoffet med sin immuniserende blokkerende peptid) av LGR5 /MKN45 celler viste ingen binding av antistoff (Figur S1).

LGR5 protein er spesielt oppdaget av anti-LGR5-antistoff i menneskelig transfektert MKN74 celler

den menneskelige mage kreft cellelinjer MKN74, kjent å besitter en moderat LGR5-mRNA-ekspresjon (data ikke vist) og human ikke-neoplastisk mage, som utviser meget lav LGR5 uttrykket (figur 1) ble valgt for å karakterisere reaktiviteten og spesifisiteten av anti-LGR5-antistoff på proteinnivå.

i western blot-analyse ble LGR5 protein gjenkjent spesifikt av den monospesifikt anti-LGR5-antistoff i en fortynning på 1:20,000. Det identifisert et bånd med en tilsynelatende molekylvekt på 100 kDa i MKN74 cellelysater (figur 4), som samsvarer med molekylmasse beregnet for LGR5 protein. I motsetning til dette ble ingen bånd påvist i lysater av humane ikke-neoplastisk vev magesekken, noe som utelukker en kryssreaktivitet av anti-LGR5-antistoff med cellulære proteiner. I tråd med mRNA-ekspresjon av data, ble sterkere ekspresjon av LGR5 protein observert i MKN74 celler som er stabilt transfektert med cDNA LGR5, sammenlignet med MKN74 kontrollceller transfektert med den tomme vektoren. LGR5 protein uttrykk i menneskets ikke-neoplastisk mageslimhinnene var utenfor deteksjonsgrensen av western blotting, viser ingen band. Utelatelse av den anti-LGR5-antistoff eller tidligere inkubering av antistoffet med sin immuniserende peptid-blokkerende viser ingen proteinbånd, henholdsvis. Påvisning av β-aktin protein (ca 43 kDa, figur 4) fungerte som en lasting kontroll og bekreftet jevnt lastet protein mengder i alle baner

LGR5 er uttrykt i ikke-neoplastiske og neoplastisk vev av lever og mage. skrift

uttrykket og histoanatomical fordeling av LGR5 ble deretter undersøkt ved immunhistokjemi i en serie av 127 vev lysbilder oppnås fra tilsvarende ikke-neoplastiske og neoplastisk vev av den hepato-mage-tarmkanalen, omfattende spiserør (14 pasienter), magesekken (32), lever (24), bukspyttkjertel (17), tykktarm (20), og rektum (20; tabell 1). Ut fra denne kohort neoplastisk og tilsvarende vevsprøver på 105 pasienter som ikke-neoplastiske ble også undersøkt på transkripsjonsnivået (se ovenfor).

LGR5 uttrykk for den samlede kullet var positiv i 65 tilfeller (51%) av alle ikke-maligne vev og 103 tilfeller (81%) av alle kreftvevet. Lokalisering av LGR5 uttrykk ble observert som hovedsakelig cytoplasmatic, mens også en sporadisk membran eller kjernemembranen aksentuert uttrykk skjedde. En LGR5-immunoreaktivitet ble funnet i alle vevskomponenter, dvs. stromaceller, endotelceller, celler i den ikke-neoplastisk epitel og kreftceller (figur 5). LGR5-immunoreaktivitet i stromaceller ble observert i 49 (39%) av alle ikke-maligne vev og i 80 tilfeller (63%) av alle kreftvevet. En endotelial immunreaktiviteten av LGR5 ble observert i 42 tilfeller (33%) av alle vev.

I den ikke-ondartet epitel, LGR5 ble vanligvis funnet i noen få spredte celler nær basalmembranen av gastrisk mucosal enheten bukspyttkjertelen kanaler, og kolorektal krypter. LGR5 ble ikke funnet i plateepitel i spiserøret, intrahepatisk galleganger, og hepatocytter (figur 6). For alle typer vev bortsett fra i spiserøret vev middelverdien av IRS var signifikant høyere for tumorvevet i forhold til den samsvarende ikke-ondartet vev, noe som bekrefter våre funn på transkripsjonsnivået (tabell 1).

LGR5 er til stede i spredte celler i normal gastrisk mucosa

eksistensen av multipotente stamceller i det murine magen ble demonstrert ved klonale merking studier. Den definitive identifisering av disse cellene sviktet så langt på grunn av utilgjengelighet av spesifikke endogene markører [14]. Ved hjelp av seriesnitt hentet fra en ermet reseksjon prøven, som vanligvis oppnås for behandling av overvekt, og viste ingen histologiske tegn på magekreft eller kronisk gastritt, vi søkte etter LGR5 ^{+ epitelceller. Interessant, spredte LGR5 + celler ble funnet i slimete nakkeregionen mellom foveolae og kjertler (figur 7).}

LGR5 er koekspresjon med andre potensielle mage stamcelle eller stamcellemarkører

Stamceller av ikke-neoplastisk vev og cscs er vanligvis identifisert og validert av uttrykk for mer enn en enkelt stamcelle markør [15]. Ved hjelp av immunhistokjemi, vi neste analyserte koekspresjon av LGR5 med andre antatte CSC markører, dvs. ADAM17, CD44, Musashi-1 [16] - [21]. ADAM17 ble valgt, da tidligere studier identifisert ADAM17 som en antatt stamcelle markør i magen [8]. Farging (enten dobbelt flekker eller flekker av seriesnitt) ble utført på en magekreft prøven og på sunn uninflammed mageslimhinnen oppnås ved sleeve gastrectomy. Generelt er bare noen få spredte celler som viste positiv farging for en og /eller den andre antatte stamcelle markør. Interessant, havner den ikke-neoplastiske mageslimhinnen celler som hver ADAM17 ^{+ /LGR5 + (som representerer omtrent en tredjedel av alle immunreaktive celler) og ADAM17 + /LGR5 - (to tredeler) og ADAM17 - /LGR5 + (noen spredte celler, figur 2C-E)}

Musashi-1 (mSH-1) ble beskrevet som en antatt stamcelle markør i musen tarmen. og human mage [18], [22], og som en CSC markør i tumorer [23]. I neoplastiske og ikke-neoplastiske gastrisk vev positive fargede celler bestående hovedsakelig av MSH-1 ^{+ /LGR5 - (ca. to tredjedeler av alle immunreaktive celler), til en mindre grad av MSH-1 + /LGR5 + (en tredjedel), og få mSH-1 - /LGR5 + celler (figur 2F-H). Endelig overflaten markør for kolorektal cancer og gastrisk stamceller CD44 [21], [24] ga en fordelings sammenlignbar med MSH-1 (figur 2I, J). Sammen er disse funnene støtter hypotesen om at vår anti-LGR5-antistoff gjenkjenner celler med stamcelle uttrykk mønstre i den menneskelige mageslimhinnen.}

Den romlige fordelingen av LGR5 + -celler endringer i løpet tumorgenesen

den sekvensielle endringer i mageslimhinnen som foran utvikling av invasiv kreft er kjent som "forstadier cascade ', først beskrevet i 1975, hvor normal mageslimhinnen blir forvandlet av kronisk atrofisk gastritt og utvikler multifokal atrofi og intestinal metaplasi, etterfulgt av utseendet av dysplasi og endelig invasivt karsinom [25]. Neste vi testet hypotesen om at de nevnte histopatologiske endringer i mageslimhinnene er forbundet med en omfordeling av den LGR5 ^{+ putative stamceller. Vi utforsket systematisk histoanatomical fordelingen av LGR5 + celler i 100 pasienter med tarm typen magekreft. Hele mount vevssnitt ble brukt som omsluttet ikke-neoplastisk, metaplastiske og neoplastiske kreftvev. Det var klart at det histoanatomical fordelingen av LGR5 + -celler endret (se figur 7): i ikke-neoplastiske og ikke-metaplastiske mageslimhinnene, få spredte LGR5 + celler ble funnet i den mukøse halsområdet (figur 7A, E). I intestinal metaplasi, en noe økt antall LGR5 + celler ble lokalisert ved bunnen av metaplastiske krypter (figur 7B, F). Men i tarm typen magekreft lokalisering og antall LGR5 + celler ble påfallende endret. I magekreft, LGR5 + -celler var tilstede ved luminal overflate (figur 7C, G), i tumoren sentrum (mellom luminal overflate og invasjon foran), og ved invasjon foran (figur 7D). Mest interessant er fordelingen av LGR5 + magekreftceller viste karakteristiske mønstre: den LGR5 + celler forekom i sammenhengende flekker av et variabelt antall tumorceller som strekker seg fra < 10, 10-50 og til og med > 50 tumorceller, ofte danner gradienter av avtagende flekker intensiteter. Den totale fordelingen av disse LGR5 + tumorcelle patcher var ujevn og inhomogen. Kollektivt, observerte vi en økning i antallet og intensiteten av LGR5 + celler fra ikke-neoplastisk epitel til magekreft støtter vårt Sanntids RT-PCR og immunhistokjemi data for matchet (ikke-neoplastisk versus neoplastisk) pasient tilfeller (se tabell 1). Våre funn av endret distribusjon mønster av LGR5 + celler er i samsvar med det som er beskrevet av Takeda et al. for kolorektal kreft [26].}

Uttrykket av LGR5 i tarm typen magekreft korrelerer med lokal tumorvekst og nodal spredning

Det er postulert at CSC innflytelse pasient prognose ved deres evne til å danne svulst cellekolonier, en uunnværlig forutsetning for metastatisk spredning og tilbakefall av sykdommen. For ytterligere å undersøke betydningen av LGR5 for magekreft, korrelert vi uttrykk for LGR5 i tarm typen magekreft med ulike klinisk-patologisk pasientkarakteristika.

• PLoS ONE: redusert nivå av Aktiv SMAD2 Correlate med dårlig prognose i Gastric Cancer
• PLoS ONE: Glyoxalase-I er en roman Prognose Factor Associated med Gastric Cancer Progression