PLOS ONE: MUC5AC Upstream Complexo polimorfismos de comprimento repetitivo região estão associados à susceptibilidade e estágio clínico da gástrica Cancer

Abstract

MUC5AC foi considerado para ser envolvido na carcinogênese gástrica já que a expressão aberrante MUC5AC foi detectado várias vezes em pacientes com câncer gástrico (GC). Neste estudo, os polimorfismos de comprimento em uma região repetitiva complicada adjacente ao MUC5AC
promotor foram avaliadas em 230 pacientes com GC e 328 controles sem câncer. Alelos de 1,4 e 1,8 kb foram significativamente mais prevalentes no grupo GC que nos controles. Em contraste, 2,3 e 2,8 kb alelos ocorreu em frequências significativamente menores nos pacientes do que nos controles. Alelos foram então classificadas em suscetível (S; 1,4 e 1,8 kb), proteção (P; 2,3 e 2,8 kb) e nula (N; todos os outros alelos) categorias com respeito à sua ligação com a susceptibilidade à GC. Os indivíduos com genótipo SS tinham um risco 2,7 vezes da ocorrência de GC, mas PN genótipo foi associada com um risco significativamente reduzido de cancro esta. Além disso, homozigotos ou heterozigotos com uma ou duas cópias do alelo 1,4 kb mostrou uma idade mais precoce de início e estágio de metástase mais avançada em comparação com pacientes sem esse alelo (Bonferroni corrigido p = 1,35 × 10 ^{-4 e 6,60 × 10 -4 de acordo), enquanto os pacientes homozigotos com duas cópias do alelo 1,8 kb foram ligados a menos avançado estágio GC TNM. Nossos resultados sugerem que certas variações genéticas em MUC5AC
montante região repetitiva estão associados com a susceptibilidade e progressão da GC}

Citation:. Wang C, Wang J, Liu Y, Guo X, Zhang C (2014) MUC5AC
Upstream Complexo polimorfismos de comprimento repetitivo região estão associados à susceptibilidade e estágio clínico do câncer gástrico. PLoS ONE 9 (6): e98327. doi: 10.1371 /journal.pone.0098327

editor: Javier S. Castresana, da Universidade de Navarra, Espanha |

Recebido: 14 de fevereiro de 2014; Aceito: 30 de abril de 2014; Publicação: 02 de junho de 2014

Direitos de autor: © 2014 Wang et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiada pela National Science Foundation Natural da China para Inovação Research Group (No. 81.370.590). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o câncer gástrico (GC) é uma das neoplasias mais comuns ea segunda principal causa de morte relacionada ao câncer em todo o mundo [1]. No entanto, seu mecanismo permanece obscuro. Apesar de alguns fatores ambientais, como dieta, tabagismo e Helicobacter pylori
, pode contribuir para a carcinogênese das células epiteliais gástricas [2] - [4], apenas uma fração da população exposta a esses fatores de risco desenvolver GC durante a sua vida. Isto sugere que factores genéticos desempenham um papel crucial na determinação da susceptibilidade de um indivíduo de GC [5], [6].

As mucinas são um grupo de diversas e complexas, proteínas extracelulares altamente glicosiladas importantes na manutenção da homeostase epitelial. As células cancerosas são frequentemente observados para expressar formas aberrantes ou quantidades de mucinas, e estas aberrações são pensados ​​para desempenhar um papel na carcinogénese, especialmente na regulação da diferenciação de células de tumor, proliferação e invasão de tumores [7]. Por exemplo, a sobre-expressão da proteína MUC1 e MUC4 em várias formas diferentes de adenocarcinoma contribuiu para a regulação da proliferação de células cancerosas através de uma interacção com o regulador do factor de crescimento epidérmico (EGFR) e cinases reguladas por sinais extracelulares [8]. Velcich et al
. demonstrou que MUC2
^{- /- ratos desenvolver adenomas no intestino que evoluem para adenocarcinomas invasivos [9], sugerindo um papel protetor para MUC2 na tumorigênese intestinal}

MUC5AC é um secretado. mucina de formação de gel e um marcador de células epiteliais gástricas foveolares [10]. MUC5AC foi considerado para ser envolvido na carcinogénese gástrica desde carcinoma gástrico mostrou conter um nível mais baixo de expressão de MUC5AC de mucosa gástrica normal, [11] - [13], e vários estudos clínicos demonstraram que o nível de expressão de MUC5AC foi associada com a gravidade de GC; No entanto, estes dados eram inconsistentes [12], [14]. Tem havido pouca pesquisa sobre a função MUC5AC e os mecanismos subjacentes ao seu papel no desenvolvimento do GC, até recentemente, foi relatado que o silenciamento MUC5AC, usando um pequeno hairpin lentivírus contendo RNA, o aumento da invasão de células de câncer gástrico e migração in vitro [13]. Isso contribui para evidenciar que os níveis alterados de expressão de MUC5AC pode estar envolvido na patogénese de GC. polimorfismos genéticos funcionais na região de regulamentação pode afetar MUC5AC
expressão gênica e, em seguida, contribuir para a susceptibilidade de um indivíduo ao câncer gástrico.

regiões repetitivas de DNA são comuns em todo o genoma humano e são caracterizados por suas dinâmicas, características instáveis ​​[15], [16]. Eles são o principal gerador de variação genética e são considerados ser a base variabilidade genética substancial, com novas mutações nessas regiões explicando grande parte da 'falta' hereditariedade nas doenças poligênicos [17], [18], incluindo GC [19]. No entanto, este tipo de variação genética não pode ser incluído no estudo de associação genômica ampla painéis (GWAS) e é um desafio para avaliar de forma confiável. revisão intensiva do MUC5AC e região regulação a montante e ao redor identificou uma região repetitiva complicada (denominado MUC5AC-u e região repetitiva). Realizamos este estudo de caso-controle para determinar a natureza e extensão dos polimorfismos genéticos dentro desta região, e para explorar a associação de cada variante genética com a ocorrência e progressão de GC.

Métodos

pesquisas de banco de dados e análise da região a montante do MUC5AC

o UCSC genoma navegador (http://genome.ucsc.edu) eo GRCh37 liberação /hg19 do genoma humano foram usadas para gerar um mapa mostrando a localização e as principais características genómicas do gene MUC5AC
, incluindo histona H3 lisina 27 acetilação status (H3K27AC), locais de ligação do factor de transcrição, polimorfismos de nucleotídeo único comuns (SNPs) e genômica seqüência repetitiva características da região a montante. A sequência de DNA da região a montante foi transferido da Ensembl (http://useast.ensembl.org/Homo_sapiens/Info /Index).

Ética declaração

Este estudo foi realizado com o aprovação da Comissão de Ética médica da Universidade de Shandong e consentimento informado por escrito foi recebida de todas as disciplinas. O manuscrito não contém informações de identificação do paciente. Os dados foram analisados ​​de forma anônima e todas as investigações clínicas foram realizadas de acordo com os princípios expressos na Declaração de Helsinki.

Os sujeitos do estudo

Duzentos e trinta pacientes com GC foram recrutados na província de Shandong, no nordeste China, entre janeiro de 2011 e dezembro de 2012. Todos os diagnósticos de GC foram patologicamente confirmada; critérios de exclusão incluíram um histórico de câncer de qualquer outro órgão (não originalmente do estômago) ou com radioterapia ou quimioterapia submetidos. Trezentos e vinte e oito pessoas sem câncer, sem quaisquer tipos de câncer detectável ou conhecidos foram coletadas como controle. Todos estes assuntos estavam vivendo nas mesmas áreas residenciais como os casos, a grande maioria deles foram selecionados entre os voluntários saudáveis, e uma pequena porção de nossos controles com idade foram coletadas de pacientes internados com doenças cardiovasculares leves dos hospitais. Sua idade e sexo foram pareados com os de pacientes com GC. Todos os indivíduos eram geneticamente relacionado étnicos chineses han. Cada sujeito foi avaliado individualmente com um questionário pré-testado para obter dados demográficos e informações sobre fatores de risco relacionados, incluindo o tabagismo eo consumo de álcool. Os indivíduos que fumaram pelo menos uma vez por dia, durante mais de um ano foram definidos como fumantes e aqueles que consumiam três ou mais bebidas alcoólicas por semana durante mais de seis meses foram considerados bebedores de álcool. Os dados clínicos e características patológicas dos pacientes foram coletadas e confirmado a partir de seus registros de histórico médico e questionários, e tumor GC, nó e metástase (TNM) etapas foram classificados de acordo com o sistema da Organização Mundial da Saúde (OMS).

amostras e DNA extração

Uma amostra de sangue periférico mL foi coletada de cada sujeito. O ADN genómico foi isolado a partir de cada amostra utilizando uma técnica de extracção de sal modificadas [20].

Obtivemos amostras de tecido a partir de 36 pacientes GC na nossa coorte, e amostras de cada paciente consistiu de tecido canceroso, o respectivo para- carcinoma (definido como sendo de 1,0 cm de distância da massa de tumor) e os tecidos circundantes da mucosa gástrica não cancerosas. DNA genômico foi extraído a partir destas amostras usando o Sangue e Cultura Celular DNA Mini Kit (Tiangen Biotech, Beijing, China).

Avaliação de tamanhos de alelos

MUC5AC-u
genotipagem região repetitiva foi realizada utilizando a reacção em cadeia da polimerase (PCR); as sequências dos iniciadores específicos do gene utilizados foram como se segue: 5'-sentido TCCACCCTAACCCTGTCAGCCGC-3 '; anti-sentido 5'-GTGGCAGGAGTGTGGGGAAAGG G-3 '. A amplificação por PCR de ADN foi realizada num volume total de reacção de 50 uL, contendo 100 ng de DNA genómico, 0,2 uM de cada iniciador e 25 uL Primestar Max ADN Polimerase (Takara, Japão). A PCR foi conduzida num Thermacycler 9700 (Perkin-Elmer, CA, EUA) da seguinte forma: uma desnaturação inicial de 5 minutos a 94 ° C, seguido de 30 ciclos de 10 s a 98 ° C e 2 minutos a 68 ° C. Os produtos de PCR foram analisados ​​por electroforese em gel (1 volt /cm) em tampão TAE através de gel de agarose a 1,0%.

A sequenciação do ADN de ensaio

Para confirmar os resultados de genotipagem, amostras de DNA amplificados por PCR (amplicões ) foram selecionados e enviados para BGI tech (Pequim, China) para a purificação e seqüenciamento Sanger. Este ensaio foi realizado às cegas com relação ao espécimes e estudo de design.

A análise estatística

SPSS 13.0 (SPSS, Chicago, IL, EUA) foi utilizado para a análise estatística. Diferenças nas variáveis ​​demográficas, hábitos de fumar e beber, e freqüências alélicas agrupadas entre casos e controles participantes foram comparadas pelo teste do qui-quadrado ou teste exato de Fisher. Análises de regressão foram realizadas para determinar as razões de chances (OR) para a associação de GC e MUC5AC-u
genótipos região repetitivos entre os controles e os pacientes do GC. RUP foram estimadas usando o logaritmo natural e seu erro padrão. O teste qui-quadrado ou teste exato de Fisher foram utilizados para comparação das características clínicas e patológicas de pacientes. A fim de permitir comparações múltiplas, os valores de p foram corrigidos (pc) utilizando a correcção de Bonferroni; pc = p × 31 como, ao longo de todo o estudo, foram realizados 31 testes estatísticos. Todos os testes foram em frente e verso, com pc. ≪ 0,05 considerado estatisticamente significativa

Resultados

Identificação da MUC5AC-u e região repetitiva

revisão intensiva do MUC5AC e região a montante identificou uma complicada bp região 1710 repetitivo (denominado o MUC5AC-u e região repetitiva), localizado entre os nucleótidos -3.162--1.452 a montante do codão de iniciação ATG ( Figura 1). Esta posição é, imediatamente a jusante do locus genómico com a capacidade de se ligar vários factores de transcrição. O MUC5AC-u e região repetitiva contém muitas repetições irregulares interrompidos de diferentes comprimentos e é uma combinação complicada de microssatélites (por exemplo, CTCA), minisatellite (por exemplo, CATTCACT ou CATTCACTCATT) e megasatellite (por exemplo, ACCCATTCACTCACTCACTTATTCACTC) repete. Na região 5 ', uma sequência de 300 pb foi encontrada para ser duplicada exatamente, head-to-tail.

População do estudo

Todos os indivíduos do estudo (328 controles sem câncer e 230 pacientes GC) eram de uma população chinesa Han e sem qualquer doença hereditária conhecida. Ambos os grupos tiveram distribuições semelhantes de idade, sexo e consumo de álcool (χ ^{2 de teste; p = 0,875, p = 0,589, p = 0,770, respectivamente; Tabela S1). Não houve diferença significativa na distribuição de fumo de cigarro entre os pacientes e controles (p = 0,098). De acordo com o sistema TNM, 10,9%, 10,0%, 21,7%, 42,2% e 15,2% dos pacientes tinham fase 0, I, II, III e IV da doença, respectivamente (Tabela S2).}

Associação de repetitivo genótipos região com o risco de GC

amostras de DNA genômico foram isoladas de sangue total de todos os sujeitos e usados ​​como modelos para amplificar o MUC5AC-u e região repetitiva. Oito alelos com tamanhos descontínuas variam de 1,1 a 2,8 kb foram identificados nesta população chinesa Han (Figura 2). O alelo 1,1 kb era mais comum, os 1,8 e 2,0 kb alelos eram menos comuns, e os outros eram todos relativamente incomum (Tabela 1).

A distribuição global do MUC5AC-u
alelos região repetitivos entre os pacientes com GC diferiu significativamente daquela encontrada nos controles (χ ^{2 = 58,44, p = 3,09 × 10 -10). Para uma análise mais aprofundada, as comparações de freqüências alélicas entre pacientes e controles foram feitos individualmente para cada alelo, por meio do teste de Fisher (Tabela 1). 1,4 e 1,8 alelos kb foram significativamente mais prevalentes em pacientes com câncer do que nos controles (3,9% vs
0,0%, pc = 3,00 × 10 -6;. 35,4% vs. 25,8%, pc = 1.56 × 10 -2, respectivamente). Além disso, as frequências dos 2.3 e 2.8 kb alelos foram significativamente menores em pacientes com câncer do que nos controles (3,3% vs. 9,0%, p = 1,51 × 10 -4; 0,0% vs. 1,8%, p = 0,002 , respectivamente), e as comparações múltiplas corrigidos valores de p foram 4,68 x 10 -3 para os 2,3 kb e 0,062 (sugestivo) para o alelo de 2,8 kb. Não foram encontradas diferenças significativas quando as freqüências de outros alelos entre casos e controles foram comparados.}

Com base nestas observações, classificamos os oito alelos como suscetíveis (S), proteção (P), ou nulo, no que diz respeito ao risco (n) como se segue: S, 1,4 ou 1,8 kb; P, 2,3 ou 2,8 kb; e N, todos os outros alelos. Vinte e um MUC5AC-L
genótipos região repetitivas foram totalmente identificadas na nossa população de controlo de casos (Tabela S3), os genótipos foram, então, definida como NN, SN, PN, SP, SS, e não houve PP genótipo em nossa coorte. O genótipo mais comum (NN) foi designado como o grupo de referência. Indivíduos com o genótipo homozigoto SS teve um 2,7 vezes maior risco de ocorrência GC (OR = 2,683, IC 95% = 1,

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