Abstract
Fundo
beclin 1 é um ator principal de autofagia. A expressão de beclin 1 e seu papel prognóstico no câncer gástrico é largamente inexplorado. O objetivo do presente estudo é investigar a expressão de beclin 1 em células cancerosas gástricas, tecidos e sua relação com o prognóstico.
A expressão de beclin 1 foi detectada em 271 espécimes de linfonodo pacientes com câncer gástrico positivos por imuno-histoquímica. A correlação de beclin 1 expressão às características clínico-patológicas e sobrevida do câncer gástrico foi estudada. Beclin-1 expressão em linhas celulares de cancro gástrico e amostras clínicas também é detectada através de transcrição-PCR e Western blot inverso.
beclin 1 é regulado para cima em ambas mRNA e os níveis de proteína em seis linhas celulares de cancro gástrico em comparação com aqueles na linha celular gástrica mucosa normal (GES-1). A expressão de beclin-1 em espécimes clínicos gástricas é também mais elevado do que aqueles nos tecidos adjacentes não cancerosas. Dos 271 pacientes, 229 (84,5%) foram beclin 1 tumores de expressão elevados por imuno-histoquímica. Beclin 1 expressão está intimamente associada com embolia intravascular. Kaplan-Meier análise mostrou alta beclin 1 expressão foi associada com a sobrevivência global mais longa. Tanto a análise univariada e análise multivariada revelou que beclin 1 expressão foram fatores prognósticos independentes nos pacientes com câncer gástrico nódulo positivo.
Nossas descobertas sugerem fortemente que beclin 1 tem um papel potencial na tumorigênese do câncer gástrico e poderia ser um promissor biomarcador para predizer o prognóstico de pacientes com câncer gástrico nódulo positivo linfa. Ele também pode servir como um novo alvo terapêutico para o tratamento do cancro gástrico
citação:. Geng Q-R, Xu D-Z, ele G-J, Lu J-B, Zhou Z-W, Zhan Y-Q, et ai. (2012) beclin-1 Expression é um preditor significativo de sobrevida em pacientes com linfonodo-positivo câncer gástrico. PLoS ONE 7 (9): e45968. doi: 10.1371 /journal.pone.0045968
editor: Alejandro H. Corvalan, Pontificia Universidad Catolica de Chile, Chile
Recebido: 04 de abril de 2012; Aceito: 23 de agosto de 2012; Publicado: September 27, 2012 |
Direitos de autor: © Geng et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Financiamento:. Este trabalho foi apoiado pelo Medical Science Foundation da província de Guangdong (No. 2010B031600071). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito
CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes
Introdução
o câncer gástrico continua sendo um grande problema de saúde pública em todo o mundo, especialmente nos países do leste Asiático, a taxa de incidência idade-padronizados é > 20 por 100.000 [1]. Para o cancro gástrico avançado, o seu prognóstico ainda é ruim, com uma taxa de sobrevida estimada em 5 anos de 25% ou menos [2], [3]. metástase ganglionar é o indicador prognóstico mais poderoso após a ressecção curativa [4] - [7]. Cerca de 75% dos pacientes avançados têm câncer gástrico nódulo positivo, cujo prognóstico foi significativamente pior do que para aqueles com doença do nó-negativos [4].
Relação de linfonodo positivo
Em estudos anteriores, nós encontramos é uma organização independente indicador de prognóstico para os pacientes com câncer gástrico nódulo positivo e quimioterapia intraperitoneal pode ser benéfico [8], [9]. No entanto, um passo fundamental para melhorar a sobrevida de pacientes com câncer gástrico linfonodo-positivo reside no aumento da compreensão do comportamento biológico do tumor e procurando os possíveis alvos para a terapia individual [10], [11]. Por exemplo, o receptor humano de crescimento epidérmico fator 2 (HER2) tornou-se agora um novo marcador de câncer gástrico seguintes princípios baseados em evidências [12] .Adding trastuzumab à quimioterapia padrão pode mudar os pobres sobrevida dos pacientes com câncer gástrico metastático HER2-positivo [13] - [15]
recentemente, foi dado o papel da autofagia no desenvolvimento do câncer e tratamento do câncer de grande preocupação [16] - [18].. Beclin 1, um regulador chave da formação de autofagia, foi encontrada a sobre-expressão de uma variedade de cancros humanos [19] - [22].
No entanto, ainda há relativamente poucos estudos que investigaram a associação entre beclin 1 e câncer de intestino. Em particular, não há dados sobre os seus efeitos sobre o prognóstico no câncer gástrico, ainda não foram relatados.
O presente estudo investigou beclin 1 expressão em células de câncer gástrico, tecidos e seu significado clínico-patológico em pacientes com gástrica linfonodo-positivo Câncer. Além disso, analisamos as relações entre a expressão beclin 1 com o prognóstico para determinar se beclin 1 pode prever o resultado clínico.
linhas de células e condições de cultura
linhas celulares de cancro gástrico humano HGC-27, MKN803, MGC-803, SGC-7901, MKN-28, BGC-823 foram presentes de Peking University School of Oncology (Beijing, República Popular da China.) [23], [24]. A linha normal de células da mucosa gástrica, GES-1, derivado de um feto epitélio da mucosa gástrica humana, foi obtido a partir do Primeiro Hospital Affiliated Sun Yat-sen University [25]. Estas linhas de células foram mantidas em meio RPMI 1640 (Invitrogen) suplementado com 10% de soro bovino fetal (Hyclone), penicilina (100 unidades /ml) e estreptomicina (100 unidades /ml) a 37 ° C e 5% de CO2 numa incubadora humidificada .
A transcrição reversa-PCR
O RNA total foi extraído usando o método TRIzol. O ARN foi pré-tratada com DNase e utilizado para a síntese de ADNc com hexâmeros aleatórios. A mistura (25 ul total) para PCR consistiu em 0,5 uL de ADNc, 0,5 U de polimerase Taq de ADN, 2,5 ul de tampão 10 × de PCR, dNTP 2,5 mM de mistura, e 50 sensoriais pM e anti-sentido iniciadores cada. Beclin 1 foram analisados por seguintes iniciadores: beclin 1 5'CGTGGAATGGAATGAGAT3 '
reversa iniciador 5' GTAAGGAACAAGTCGGTAT3 ';
Actin: 5'AGCCATGTACGTAGCCATCC3'
e 5 'GTGGTGGTGAAGCTGTAGC 3 '.
as células foram lisadas em tampão de lise e a concentração de proteína foi determinada pelo método de corante de Bradford (Bio-Rad Laboratories). Quantidades iguais de extracto de células foram submetidas a SDS-PAGE e transferidas para membrana de PVDF (Bio-Rad). Expressão de beclin 1 foi determinada com um anticorpo monoclonal de coelho (1:1000, Novus Biologicals, NB500-249) de acordo com protocolos sugeridos pelo fabricante.
O estudo consistiu em 271 gástrica pacientes com câncer submetidos à ressecção radical para confirmação histológica de carcinoma gástrico Cancer Center de Sun Yat-sen University entre janeiro de 1998 e dezembro de 2006. Obtivemos o consentimento informado de todos os participantes envolvidos neste estudo. A aprovação ética foi obtida a partir de Sun Yat-sen University Cancer Center comitê de ética em pesquisa. Os critérios de elegibilidade incluíram confirmado histologicamente ressecção R0, que foi definida como ausência de tumor residual macroscópica e microscópica e tempo de sobrevivência pós-operatória ≥6 meses. Os pacientes com metástases distantes ou terapia pré-operatória ou linfonodos negativos linfa foram excluídos do estudo. A classificação 7thTNM pelo American Joint Committee on Cancer e União Internacional Contra o Câncer critérios foi utilizado para o estadiamento patológico [26]
Todos os pacientes tiveram acompanhamento após a cirurgia em intervalos de 6 a 12 meses.; Período médio de acompanhamento foi de 38 meses (10-145 intervalo) para todos os pacientes. A sobrevida global foi definida como foi definida como o período entre o momento da cirurgia e da morte ou foi censurado no último follow-up.
Imunohistoquímica
beclin 1 foi detectado com um anticorpo monoclonal de coelho ( 1:100, Novus Biologicals, NB500-249). Todas as amostras de tumor foram obtidas a partir de cancros gástricos cirurgicamente ressecados antes da terapia adjuvante. , blocos de tecido embebidos em parafina e fixados em formalina foram armazenadas à temperatura ambiente, identificada por um número de identificação. Os procedimentos foram realizados de modo semelhante ao método anteriormente descrito [23]. As secções foram avaliadas e tecidos de adenocarcinomas da próstata humana serviu como controlo positivo. Todas as lâminas foram avaliadas por dois observadores independentes com base na proporção de células de tumor coradas positivamente e intensidade de coloração. De acordo com os critérios descritos recentemente para classificação beclin uma expressão, a intensidade de coloração da membrana variaram de fraca a forte: 0 (sem coloração), 1 (coloração fraca), 2 (coloração moderada) e e 3 (coloração intensa) [27]. A percentagem de células tumorais positivas foi pontuada como 0 (< 5%), 1 (6% a 25%), 2 (26% a 50%), 3 (51% a 70%) e 4 (> 70% ). índice de coloração foi calculado somando a pontuação intensidade de coloração e a percentagem de células positivas marcar. Imunorreativo pontuação igual ou superior a 4 foi utilizado para classificar tumores com alta beclin 1 expressão, e uma pontuação abaixo de 4 coloração foi utilizada para indicar baixa expressão beclin 1.
Todas as análises estatísticas foram realizados utilizando software SPSS (versão 18 para Windows; SPSS, Chicago, IL). Diferenças na P < 0,05 foram considerados como sendo estatisticamente significativo. A associação de beclin-1 expressão com várias características clinicalopathologic foi analisada utilizando o teste do qui-quadrado. As curvas de sobrevida foram traçadas pelo método de Kaplan-Meier e comparadas pelo teste de log-rank. Um modelo de riscos proporcionais de Cox (para trás, passo a passo) para a análise multivariada foi aplicada para os fatores que alcançaram significância na análise univariada.
beclin 1 expressão em linhas celulares de cancro gástrico
a sobre-expressão de um beclin tem sido relatada em muitos cancros. O seu estado de expressão em linhas celulares de cancro gástrico, no entanto, permanece obscura. Para determinar os níveis de beclin-1 transcritos e proteínas, reverso análise de transcrição-PCR semi-quantitativa e análise de transferência de Western de expressão foram realizados separadamente em células humanas normais epiteliais gástricas (GES-1) e seis linhas de células de cancro gástrico (HGC-27, MKN803, MGC-803, SGC-7901, MKN-28, BGC-823). Descobrimos que beclin 1 mRNA e proteína nível de expressão regulados positivamente em todas as seis linhas celulares de cancro gástrico em comparação com células epiteliais gástricas normais GES-1. (Fig. 1 A e B)
beclin 1 expressão em tecidos de câncer gástrico
Para determinar beclin-1 mRNA e expressão da proteína em tecidos com câncer gástrico, 4 emparelhado tecidos de câncer gástrico e tecidos não cancerosos adjacentes para cancro lesões foram detectadas por análise da transcrição reversa-PCR e análise de transferência de western, separadamente. Verificou-se que beclin-1 em todas as quatro amostras de tecidos tumorais apresentaram uma expressão significativamente mais elevada em ambos os níveis de mRNA e proteína do que as do tecido normal adjacente ao tumor a partir dos mesmos pacientes (Fig. 1 C e D).
beclin 1 expressão no câncer gástrico
Para investigar se beclin-1 poderia clinicamente se correlacionam com a progressão do cancro gástrico, expressão e localização subcelular de beclin 1 proteína foi detectada por imuno-histoquímica em 271 tecidos com cancro gástrico embebidos em parafina. Específico beclin uma coloração foi encontrada principalmente na membrana de plasma e no citoplasma das células cancerosas, ocasionalmente, o núcleo. A Figura 2 mostra exemplos representativos de uma beclin imunocoloração. Dos 271 pacientes, 229 (84,5%) foram beclin 1 tumores de expressão elevados.
Os pacientes com beclin 1 câncer gástrico baixa expressão mostrou taxas de sobrevida global em 5 anos significativamente mais curtos (OS , p = 0,011; a Fig. 3) e sobrevida livre de doença (DFS, p = 0,010; Fig 4) do que aqueles com beclin 1 os de alta expressão.. A expressão de beclin 1 está intimamente relacionado com embolia intravascular (P = 0,017). No entanto, não houve correlação significativa entre o nível de expressão de beclin 1 e idade, sexo, localização, tamanho do tumor, classificação T, classificação N, ou estágio patológico de pacientes com câncer gástrico (Tabela 1). Beclin 1 expressão, local, embolia intravascular, classificação T patológica, classificação N patológica e estágio patológico foram fatores prognósticos independentes na análise univariada (dados não mostrados) .Na análise multivariada, beclin 1 expressão, embolia intravascular, local e estágio patológico foram significativas independente fator prognóstico para o tempo de sobrevivência (Tabela 2).
Discussão
a autofagia é um mecanismo de auto-degradação e associada com a progressão do tumor. Beclin 1, um ortólogo de mamífero de Atg6 fermento, desempenha um papel crucial no processo de vesícula nucleação de autofagia [28]. É um gene indispensável para as primeiras fases de autofagia [29] - [30].
O presente estudo tem, pela primeira vez, mostrou beclin 1 é regulado para cima em ambos os níveis de mRNA e proteína em seis linhas celulares de cancro gástrico em comparação com aqueles na normais gástricas células epiteliais GES-1. Também revelou beclin uma expressão elevada em tumores gástricos primários em comparação com quatro amostras de cancro gástrico emparelhados adjacentes a tumores a partir dos mesmos doentes por transcrição reversa-PCR e transferência de Western. Os resultados diferem daqueles apresentados nas células cancerígenas do fígado e células de câncer cervical, que mostrou beclin 1 expressão significativamente menor em comparação com os correspondentes tecidos normais [31], [32]. A explicação possível é que uma beclin-expressão em cancros gástricos contribuir para a indução da morte celular autophagic, produzindo, assim, a pressão selectiva para substituir a morte celular durante o desenvolvimento do cancro [27], [33].
No presente estudo , observou-se que 229 (84,5%) pacientes tiveram alta expressão beclin 1 em 271 pacientes com câncer gástrico, de acordo com a conclusão do estudo prévio de dados Ahn et al.Their não mostrou nenhuma ou expressão muito fraca de Beclin1 em células da mucosa normais de estômago por imuno-histoquímica [27]. No entanto, eles não explorar a expressão beclin-1 ao nível do ARNm em linhas de células, nem investigar o seu papel no prognóstico.
Em seguida, analisamos a relação entre a expressão de beclin-1 e as características clínicas de pacientes . Não houve correlação significativa entre a expressão de beclin-1 e idade, sexo, classificação T, classificação N, ou estágio de pacientes com câncer gástrico. Interessante, em nosso estudo, houve uma relação significativa entre a expressão de beclin-1 e embolia intravascular. É o que sugere que beclin-1 pode ser usado como uma embolia intravascular marcador em pacientes com cancro gástrico nódulo positivo. Estas observações destacar o importante papel da beclin-1 no desenvolvimento do câncer gástrico.
Além disso, encontramos baixa beclin-1 expressão foi fortemente associada com diminuição da sobrevida em pacientes com câncer gástrico ( P Para o nosso conhecimento, o estudo é o primeiro relatório que beclin 1 teve um significativamente mais elevada expressão em células de cancro gástrico e tecidos, tanto ARNm e os níveis de proteína em comparação com as suas contrapartidas normais. Além disso, encontramos alta beclin 1 expressão foi associada com a sobrevivência global mais longa. Tanto a análise univariada e análise multivariada mostrou beclin 1 expressão, local, embolia intravascular e estágio patológico foram fatores prognósticos independentes. Os resultados sugerem fortemente que beclin 1 tem um potencial papel na tumorigênese do câncer gástrico. Poderia ser um biomarcador promissor e uma novas estratégias terapêuticas para pacientes com câncer gástrico nódulo positivo linfa. Também são necessários mais estudos para esclarecer o mecanismo pelo qual o ator autofagia beclin 1 está envolvido no desenvolvimento e progressão do cancro gástrico.
= 0,011) eo subconjunto embolia intravascular ( P
= 0,017). Na análise multivariada, beclin-1 expressão reteve sua independência como fator prognóstico ( P
= 0,044). Estes resultados sugerem uma utilidade potencialmente promissoras de beclin-1 como um indicador de prognóstico e sobrevivência. O mecanismo ainda não está claro. A explicação alternativa para isso pode ser que beclin-1 expressão em cânceres gástrico limites instabilidade cromossômica e diminui a frequência de mutação adicional [34].
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