PLOS ONE: Beclin-1 Expression är en betydande prediktor för överlevnaden hos patienter med maligna nodpositiv Gastric Cancer

Abstrakt

Bakgrund

Beclin en är en huvudaktör av autophagy. Uttrycket av Beclin en och dess prognostisk roll i magcancer är till stor del outforskad. Syftet med denna studie är att undersöka uttrycket av beclin en i gastric cancerceller, vävnader och dess relation med prognosen.

Metoder

Uttrycket av Beclin ett upptäcktes i 271 exemplar av lymfkörtel positiva gastric cancerpatienter genom immunhistokemi. Korrelationen mellan Beclin ett uttryck för clinicopathologic funktioner och överlevnad magcancer studerades. Beclin-1 uttryck i gastric cancercellinjer och kliniska prover även detekteras med hjälp av omvänd transkription-PCR och Western blotting.

Resultat

Beclin 1 uppregleras både mRNA och proteinnivåer i sex gastric cancercellinjer jämfört med dem i normala magslemhinnan cellinje (GES-1). Uttrycket av Beclin-1 i mag kliniska prover är också högre än i de angränsande noncancerous vävnader. Av de 271 patienter, 229 (84,5%) var Beclin 1 höga uttrycks tumörer genom immunohistokemi. Beclin ett uttryck är nära förknippad med intravaskulärt embolus. Kaplan-Meier-analys visade hög beclin ett uttryck i samband med längre total överlevnad. Både endimensionella analys och multivariat analys visade att Beclin ett uttryck var oberoende prognostiska faktorer hos patienter med nodpositiv magcancer.

Slutsatser

Våra resultat tyder starkt på att Beclin en har en potentiell roll i tumörbildning av magcancer och kan vara en lovande biomarkör för att förutsäga prognosen för patienter med lymfkörtel-positiv magsäckscancer. Det kan också fungera som ett nytt terapeutiskt mål för magcancer behandling

Citation:. Geng Q-R, Xu D-Z, Han L-J, Lu J-B, Zhou Z-W, Zhan Y-Q, et al. (2012) Beclin-1 Expression är en betydande prediktor för överlevnaden hos patienter med Lymph Node-positiv magcancer. PLoS ONE 7 (9): e45968. doi: 10.1371 /journal.pone.0045968

Redaktör: Alejandro H. Corvalan, Pontificia Universidad Catolica de Chile, Chile

Mottagna: 4 april 2012, Accepteras: 23 augusti 2012; Publicerad: 27 september 2012 |

Copyright: © Geng et al. Detta är en öppen tillgång artikel distribueras enligt villkoren i Creative Commons Attribution License, som tillåter obegränsad användning, distribution och reproduktion i alla medier, förutsatt den ursprungliga författaren och källan kredit

Finansiering:. Detta arbete stöddes av Medical Science Foundation i provinsen Guangdong (nr 2010B031600071). Finansiärerna hade ingen roll i studiedesign, datainsamling och analys, beslut att publicera, eller beredning av manuskriptet

Konkurrerande intressen:.. Författarna har förklarat att inga konkurrerande intressen finns

Introduktion

Gastric cancer är fortfarande ett stort folkhälsoproblem i världen, speciellt i östasiatiska länder, den åldersstandardiserade incidensen är > 20 per 100.000 [1]. För avancerad magsäckscancer, är dess prognos fortfarande är dålig, med en beräknad total 5-års överlevnad på 25% eller mindre [2], [3]. Lymfkörtel metastas är den mest kraftfulla prognosindikator efter kurativ resektion [4] - [7]. Cirka 75% av avancerade patienter har nodpositiv magcancer, vars prognos var betydligt sämre än för dem med nodnegativ sjukdom [4].

I tidigare studier har vi funnit positiva lymfkörtel förhållandet är en oberoende prognostisk indikator för de patienter med nodpositiv magcancer och intraperitoneal kemoterapi kan vara fördelaktigt [8], [9]. Men ett viktigt steg mot att förbättra överlevnaden hos patienter med lymfkörtelpositiv magcancer ligger i den ökade förståelsen av tumören biologiska beteende och söka efter möjliga mål för individuell terapi [10], [11]. Till exempel har den humana epidermala tillväxtfaktorreceptorn 2 (HER2) blir nu en ny markör för magcancer enlighet med evidensbaserade principer [12] .Adding trastuzumab mot befintliga cellgifter kan ändra dålig överlevnad av patienter med HER2-positiv magsäckscancer [13] - [15]

Nyligen har den roll som autophagy i cancerutveckling och cancerbehandling fått stor oro [16] - [18].. Beclin 1, en nyckelregulator för autophagy bildning, hittades överuttryck i en mängd olika humana cancerformer [19] - [22].

Det finns dock fortfarande relativt få studier som har undersökt sambandet mellan Beclin 1 och magcancer. Framförallt sågs inga uppgifter om deras effekter på prognosen i magcancer, har ännu inte rapporterats.

Den aktuella studien undersökte Beclin ett uttryck i gastric cancerceller, vävnader och dess clinicopathologic betydelse hos patienter med lymfkörtel-positiv magsäcks cancer. Dessutom analyserade vi förhållandet mellan Beclin ett uttryck med prognosen att avgöra om Beclin en kan förutsäga det kliniska resultatet.

Material och metoder

Cellinjer och odlingsbetingelser

mänskliga gastric cancercellinjer HGC-27, MKN803, MGC-803, SGC-7901, MKN-28, BGC-823 var gåvor från Peking University School of Oncology (Beijing, Kina.) [23], [24]. Den normala magslemhinnan cellinje, GES-1, härledd från ett humant fetalt magslemhinnan epitel, erhölls från den första Anslutna sjukhus Sun Yat-Sen University [25]. Dessa cellinjer hölls i RPMI 1640-medium (Invitrogen) kompletterat med 10% fetalt bovint serum (Hyclone), penicillin (100 enheter /ml) och streptomycin (100 enheter /ml) vid 37 ° C och 5% CO2 i en fuktad inkubator .

Omvänd transkription-PCR

Totalt RNA extraherades med användning av TRIzol-metoden. RNA förbehandlades med DNas och användes för cDNA-syntes med slumpmässiga hexamerer. Blandningen (25 | il totalt) för PCR bestod av 0,5 | j, l cDNA, 0,5 U Taq DNA-polymeras, 2,5 | il 10 x PCR-buffert, 2,5 mM dNTP blandning, och 50 pM sense- och antisense-primrar vardera. Beclin ett analyserades med följande primers: Beclin en 5'CGTGGAATGGAATGAGAT3 '

omvänd primer 5' GTAAGGAACAAGTCGGTAT3 ",

Actin: 5'AGCCATGTACGTAGCCATCC3 '

och 5' GTGGTGGTGAAGCTGTAGC 3 '.

Western blot-analys

Celler lyserades i lysbuffert och koncentrationen av proteinet bestämdes genom Bradford-färgmetoden (Bio-Rad Laboratories). Lika stora mängder av cellextrakt underkastades SDS-PAGE och överfördes till PVDF-membran (Bio-Rad). Uttryck av Beclin en bestämdes med en kanin monoklonal antikropp (1:1000, Novus Biologicals, NB500-249) enligt tillverkarens föreslagna protokoll.

Patienter studerade

Undersökningen bestod av 271 gastric cancerpatienter som genomgick radikal resektion för histologiskt bekräftade magcancer från Cancer Center i Sun Yat-sen universitetet mellan januari 1998 och december 2006. Vi fick informerat samtycke från alla inblandade i denna studie deltagarna. Etiskt godkännande erhölls från Sun Yat-sen universitetet Cancer Center forskningsetisk kommitté. Urvalskriterierna ingår histologiskt bekräftade R0 resektion, som definierades som ingen makroskopisk och mikroskopisk rest tumör och postoperativ överlevnadstiden ≥6 månader. Patienter med fjärrmetastaser eller preoperativ terapi eller lymfkörtel-negativa uteslöts från studien. Den 7thTNM klassificeringen av den amerikanska kommittén för cancer och International Union Against Cancer kriterier användes för patologisk staging [26]

Alla patienter hade uppföljning efter operation på sex till tolv månaders intervall. Median uppföljningsperioden var 38 (intervall 10-145) månader för alla patienter. Total överlevnad definierades som definierades som perioden mellan tidpunkten för kirurgi och död eller censurerades vid den sista uppföljningen.

Immunohistokemi

Beclin en detekterades med en kanin monoklonal antikropp ( 1:100, Novus Biologicals, NB500-249). Alla tumörprover erhölls från kirurgiskt resekterade gastric cancer innan adjuvant terapi. Formalinfixerade, paraffininbäddade vävnadsblock lagrades vid rumstemperatur identifieras av ett identifikationsnummer. De förfaranden som gjordes på liknande sätt som den metod som tidigare beskrivits [23]. De immunfärgades sektioner utvärderades och vävnader från humana prostata adenokarcinom tjänade som positiv kontroll. Alla bilder utvärderades av två oberoende observatörer som bygger på andelen positivt färgade tumörceller och intensitet färgning. Enligt nyligen beskrivna kriterier för bedömning Beclin ett uttryck, intensiteten av membranfärgning varierade från svag till stark: 0 (ingen färgning), en (svag färgning), 2 (måttlig färgning) och och 3 (intensiv färgning) [27]. Andelen positiva tumörceller poängsattes som 0 (< 5%), 1 (6% till 25%), 2 (26% till 50%), 3 (51% till 70%) och 4 (> 70% ). Färgningsindex beräknades genom att summera det färgningsintensitetspoäng och den procentuella andelen positiva celler score. Immunoreaktiva poäng lika med eller högre än 4 användes för att klassificera tumörer med hög Beclin ett uttryck, och en färgning score under 4 användes för att indikera låg Beclin ett uttryck.

Statistiska analyser

Alla statistiska analyser utfördes med användning av SPSS-programvara (version 18 för Windows, SPSS, Chicago, IL). Skillnader på P < 0,05 ansågs vara statistiskt signifikant. Associationen av Beclin-1 expression med olika clinicalopathologic funktioner analyserades med användning av chi-två test. Överlevnadskurvorna plottades av Kaplan-Meier-metoden och jämfördes med log-rank test. En Cox proportionella hazardmodell (bakåt, stegvis) för flerdimensionell analys tillämpades för faktorer som uppnått betydelse i univariable analys.

Resultat

Beclin ett uttryck i gastric cancercellinjer

Uttryck av Beclin en har rapporterats i många cancerformer. Dess uttryck status i magcancer cellinjer, dock fortfarande oklart. För att bestämma de expressionsnivåer av beclin-1-transkript och protein, semikvantitativ omvänd transkription-PCR-analys och Western blotting-analys genomfördes separat i normala humana gastriska epitelceller (GES-1) och sex gastriska cancercellinjer (HGC-27, MKN803, MGC-803, SGC-7901, MKN-28, BGC-823). Vi fann att Beclin ett mRNA och proteinuttryck nivå uppreglerad i alla sex gastric cancercellinjer jämfört med normala gastric epitelceller GES-1. (Fig. 1 A och B) katalog

Beclin ett uttryck i magcancer vävnader

För att bestämma beclin-1-mRNA och proteinuttryck i magcancer vävnader, 4 parade magcancer vävnader och noncancerous vävnader angränsande till cancer lesioner detekterades genom omvänd transkription-PCR-analys och Western blotting-analys, var för sig. Man fann att Beclin-1 i alla fyra tumörvävnadsprover hade en signifikant högre expression vid båda mRNA och proteinnivåer än de i den normala vävnaden intill tumörer från samma patienter (Fig. 1 C och D).

Beclin ett uttryck i magcancer

för att undersöka om beclin-1 kan kliniskt korrelerar med magcancer progression, uttryck och subcellulär lokalisering av Beclin ett protein detekterades genom immunhistokemi i 271 paraffininbäddade magcancer vävnader. Specifik Beclin en färgning var mestadels finns på membran plasma och cytoplasman i cancercellerna, ibland kärnan. Figur 2 visar representativa exempel på Beclin en immunfärgning. Av de 271 patienter, var 229 (84,5%) Beclin ett högt uttryck tumörer.

Överlevnadsanalys

Patienter med Beclin en låg uttryck magcancer uppvisade signifikant kortare fem år övergripande överlevnaden (OS , p = 0,011; Fig. 3) och sjukdomsfri överlevnad (DFS, p = 0,010; figur 4) än de med Beclin 1 hög uttrycks sådana.. Uttrycket av Beclin en är nära förknippad med intravaskulärt embolus (P = 0,017). Det fanns emellertid ingen signifikant korrelation mellan expressionsnivån av Beclin 1 och ålder, kön, plats, tumörstorlek, T klassificering, N klassificering, eller patologiskt stadium av gastric cancerpatienter (tabell 1). Beclin ett uttryck, plats, intravaskulär embolus, patologiska T klassificering, patologisk N klassificering och patologiskt stadium var oberoende prognostiska faktorer i univariata analys (data visas ej) .I flerdimensionell analys, Beclin ett uttryck, intravaskulärt embolus, plats och patologiskt stadium var betydande oberoende prognostisk faktor för överlevnadstiden (tabell 2).

Diskussion

Autophagy är en mekanism självnedbrytning och associerad med tumörprogression. Beclin en, en däggdjurs ortologen av jäst Atg6, spelar en avgörande roll i blåskärn processen för autophagy [28]. Det är en gen nödvändig för de första faserna av autophagy [29] - [30].

Den aktuella studien har, för första gången, visade Beclin 1 uppregleras vid båda mRNA och proteinnivåer i sex magcancer cellinjer jämfört med dem i normala gastric epitelceller GES-1. Vi visade också Beclin ett uttryck är förhöjd i primära gastriska tumörer jämfört med fyra parade magcancer prover intill tumörer från samma patienter genom omvänd transkription-PCR och Western blotting. Resultaten skiljer sig från de som redovisas i levercancerceller och cervical cancerceller, som visade Beclin ett uttryck betydligt lägre jämfört med motsvarande normala vävnader [31], [32]. Den möjliga Explaination är att beclin-1 expression i gastric cancer bidra till induktionen av autophagic celldöd, varigenom selektivt tryck för att åsidosätta celldöd under utvecklingen cancern [27], [33].

I föreliggande studie observerade vi att 229 (84,5%) patienter hade hög uttryck Beclin en i 271 patienter magcancer, i linje med konstaterandet av den tidigare studien av Ahn et al.Their data visade ingen eller mycket svagt uttryck av Beclin1 i normala slemhinneceller av magen genom immunohistokemi [27]. Emellertid, de inte utforska beclin-1 expression vid mRNA-nivån i cellinjer och inte heller undersöka dess roll i den prognos.

Vi analyserade därefter förhållandet mellan uttrycket av beclin-1 och kliniska egenskaperna hos patienterna . Det fanns ingen signifikant korrelation mellan expressionen av beclin-1 och ålder, kön, T klassificering, N klassificering, eller stadium av patienter med gastrisk cancer. Intressant, i vår aktuella studien, fanns ett signifikant samband mellan uttrycket av beclin-1 och intravaskulär embolus. Det tyder på att beclin-1 skulle kunna användas som en markör intravaskulär embolus i patienterna med nodpositiv magcancer. Dessa observationer belysa den viktiga roll som beclin-1 i utvecklingen av magcancer.

Dessutom fann vi låg beclin-1-uttryck var starkt förknippad med minskad överlevnad hos patienter med ventrikelcancer ( P
= 0,011) och den intravaskulära embolus delmängd ( P
= 0,017). I flerdimensionell analys, Beclin-1 uttryck behållit sin självständighet som en prognostisk faktor ( P
= 0,044). Dessa resultat tyder på en potentiellt lovande användbarheten av beclin-1 som en prognostisk och överlevnad indikator. Mekanismen är fortfarande oklar. Alternativet förklaring till detta kan vara att beclin-1 uttryck i magcancer gränser kromosomala instabilitet och minskar frekvensen av ytterligare mutation [34].

Såvitt vi vet är att studera den första rapporten att Beclin en hade en betydligt högre uttryck i magcancer celler och vävnader på både mRNA och proteinnivåer jämfört med deras normala motsvarigheter. Dessutom fann vi högt beclin ett uttryck i samband med längre total överlevnad. Både endimensionella analys och multivariat analys visade Beclin ett uttryck, plats, intravaskulär embolus och patologiskt stadium var oberoende prognostiska faktorer. Resultaten tyder starkt på att Beclin en har en potentiell roll i tumörbildning av magcancer. Det kan vara en lovande biomarkör och en roman terapeutiska strategier för patienter med lymfkörtel-positiv magsäckscancer. Ytterligare studier behövs också för att klargöra den mekanism genom vilken autophagy skådespelaren Beclin en är involverad i utvecklingen och utvecklingen av magcancer.

• PLOS ONE: Interaktion mellan GSTP1 Val allel och H. pylori-infektion, rökning och alkoholkonsumtion och risk för ventrikelcancer bland den kinesiska befolkningen
• PLOS ONE: medfödd immunitet och Non-Hodgkins lymfom (NHL) relaterade gener i en kapslad fall-kontrollstudie för Gastric cancerrisk