PLoS ONE: Beclin-1 Expression ist ein signifikanter Prädiktor für das Überleben bei Patienten mit Lymph Node-positivem Magen Cancer

Abstrakt

Hintergrund

Beclin 1 ein Hauptakteur der Autophagie ist. Die Expression von Beclin 1 und ihre prognostische Rolle bei Magenkrebs ist weitgehend unerforscht. Der Zweck der vorliegenden Studie ist es, die Expression von BECLIN 1 bei Magenkrebs Zellen, Geweben und seine Beziehung mit der Prognose zu untersuchen.

Methoden

Die Expression von Beclin 1 in 271 Exemplaren nachgewiesen Lymphknoten-positiven Magenkrebs-Patienten durch Immunhistochemie. Die Korrelation von Beclin 1-Expression auf klinisch-pathologische Merkmale und das Überleben von Magenkrebs untersucht. Beclin-1-Expression in Magenkrebs-Zelllinien und klinischen Proben wird auch reverse Transkription-PCR und Western Blot nachgewiesen werden.

Ergebnisse |

Beclin 1 ist hochreguliert sowohl auf mRNA und Protein-Ebene in sechs Magenkrebs-Zelllinien im Vergleich mit denen in normalen Magenschleimhaut Zellinie (GES-1). Die Expression von Beclin-1 im Magen klinischen Proben ist ebenfalls höher als diejenigen in den benachbarten nicht-kanzeröse Gewebe. Von den 271 Patienten, 229 (84,5%) waren Beclin 1 hohe Expression Tumoren durch Immunhistochemie. Beclin 1-Expression steht in engem Zusammenhang mit intravaskulären Embolie in Verbindung gebracht. Kaplan-Meier-Analyse zeigte eine hohe Beclin 1-Expression mit einer längeren Überlebenszeit verbunden war. Sowohl univariaten Analyse und multivariate Analyse ergab, dass Beclin 1-Expression unabhängige prognostische Faktoren bei Patienten mit Lymphknoten-positivem Magenkrebs waren.

Schlussfolgerungen

Unsere Ergebnisse legen nahe, dass Beclin 1 eine potentielle Rolle bei der tumorigenesis von Magenkrebs und konnte eine vielversprechende Biomarker für die Vorhersage der Prognose von Patienten mit Lymphknoten-positive Magenkrebs sein. Es könnte auch als ein neues therapeutisches Ziel für Magenkrebs Behandlung dienen

Citation. Geng Q-R, Xu D-Z, He L-J, Lu J-B, Zhou Z-W, Zhan Y-Q, et al. (2012) Beclin-1 Expression ist ein signifikanter Prädiktor für das Überleben bei Patienten mit Lymphknoten-positivem Magenkrebs. PLoS ONE 7 (9): e45968. doi: 10.1371 /journal.pone.0045968

Editor: Alejandro H. Corvalan, Pontificia Universidad Católica de Chile, Chile

Empfangen: 4. April 2012; Akzeptiert: 23. August 2012; Veröffentlicht am: 27. September 2012

Copyright: © Geng et al. Dies ist eine Open-Access-Artikel unter den Bedingungen der Lizenz Creative Commons, die uneingeschränkte Nutzung erlaubt, die Verteilung und Vervielfältigung in jedem Medium, vorausgesetzt, der ursprüngliche Autor und Quelle genannt werden

Finanzierung:. Diese Arbeit wurde von der Medical Science Foundation der Provinz Guangdong (Nr 2010B031600071) unterstützt. Die Geldgeber hatten keine Rolle in Studiendesign, Datenerfassung und Analyse, Entscheidung oder Vorbereitung des Manuskripts zur Veröffentlichung

Konkurrierende Interessen:.. Die Autoren haben erklärt, dass keine Interessenkonflikte bestehen

Einführung

Magenkrebs bleibt ein großes Problem der öffentlichen Gesundheit weltweit, vor allem in den ostasiatischen Ländern, die altersstandardisierte Inzidenzrate ist > 20 pro 100.000 [1]. Für den fortgeschrittenen Magenkrebs, ist seine Prognose immer noch schlecht, mit einem geschätzten Gesamt 5-Jahres-Überlebensrate von 25% oder weniger [2], [3]. Lymphknotenmetastasen ist der stärkste prognostischer Indikator nach kurativer Resektion [4] - [7]. Etwa 75% der Patienten mit fortgeschrittenem haben Knoten-positivem Magenkrebs, deren Prognose waren deutlich schlechter als für die mit node-negative Krankheit [4].

In früheren Studien haben wir positive Lymphknoten-Verhältnis gefunden ist eine unabhängige prognostischer Indikator für die Patienten mit Lymphknoten-positivem Magenkrebs und intraperitoneale Chemotherapie kann vorteilhaft sein [8], [9]. Allerdings liegt in der erhöhten Verständnis des Tumors biologischen Verhaltens und der Suche nach der möglichen Ziele für die individuelle Therapie [10], ein grundlegender Schritt in Richtung auf das Überleben von Patienten mit Lymphknoten-positivem Magenkrebs zu verbessern [11]. Zum Beispiel hat der humanen epidermalen Wachstumsfaktor-Rezeptor 2 (HER2) jetzt ein neuer Marker von Magenkrebs nach evidenzbasierten Grundsätze werden [12] .Adding Trastuzumab zur Standard-Chemotherapie konnte die Armen das Überleben von Patienten mit HER2-positivem metastasierendem Magenkrebs ändern [13] - [15]

Vor kurzem Behandlung die Rolle der Autophagie in der Entwicklung von Krebs und Krebs gegeben großer Sorge wurde [16] - [18].. Beclin 1 ist ein Schlüsselregulator der autophagy Bildung, Überexpression in einer Vielzahl von menschlichen Krebsarten gefunden wurde [19] - [22].

Es gibt jedoch immer noch relativ wenige Studien, die die Assoziation zwischen Beclin suchten 1 und Magenkrebs. Insbesondere in Bezug auf keine Daten, um ihre Auswirkungen auf die Prognose bei Magenkrebs, haben noch berichtet.

Die vorliegende Studie Beclin 1-Expression in Magenkrebs Zellen, Geweben und seine klinisch-pathologische Bedeutung bei Patienten mit Lymphknoten-positivem Magensucht Krebs. Darüber hinaus analysierten wir die Beziehungen zwischen dem Beclin 1-Expression mit der Prognose, um zu bestimmen, ob Beclin 1 klinische Ergebnis vorhersagen kann.

Materialien und Methoden

Die Zelllinien und Kulturbedingungen

menschlichen Magenkrebszelllinien HGC-27, MKN803, MGC-803, SGC-7901, MKN-28, BGC-823 waren Geschenke von Peking University School of Oncology (Peking, VR China.) [23], [24]. Die normale Magenschleimhaut Zelllinie, GES-1, die von einem menschlichen fetalen Magenschleimhaut Epithel abgeleitet wurde aus dem Ersten Affiliated Hospital der Sun Yat-Sen-Universität [25] erhalten. Diese Zelllinien wurden in RPMI 1640-Medium (Invitrogen) supplementiert mit 10% fötalem Rinderserum (Hyclone), Penicillin (100 Einheiten /ml) und Streptomycin (100 Einheiten /ml) bei 37 ° C und 5% CO 2 in einem befeuchteten Inkubator gehalten .

Transkriptions-PCR

Die Gesamt-RNA unter Verwendung von TRIzol Verfahren extrahiert wurde umkehren. Die RNA wurde mit DNase vorbehandelt und für die cDNA-Synthese mit zufälligen Hexameren verwendet. Das Gemisch (25 ul insgesamt) für die PCR bestand aus 0,5 ul cDNA, 0,5 U Taq-DNA-Polymerase, 2,5 ul 10 × PCR-Puffer, 2,5 mM dNTP-Gemisch und 50 pM Sense- und Antisense-Primer je. Beclin 1 wurden durch folgende Primer analysiert: Beclin 1 5'CGTGGAATGGAATGAGAT3 '

Reverse-Primer 5' GTAAGGAACAAGTCGGTAT3 ';

Actin: 5'AGCCATGTACGTAGCCATCC3'

und 5 'GTGGTGGTGAAGCTGTAGC 3 '.

Western blot analysis

die Zellen wurden in Lyse-Puffer und die Konzentration von Protein lysiert wurde durch das Bradford-Farbstoff-Verfahren (Bio-Rad Laboratories) bestimmt. Gleiche Mengen der Zellextrakt wurden auf SDS-PAGE unterworfen und auf PVDF-Membran überführt (Bio-Rad). Die Expression von Beclin 1 mit einem Kaninchen monoklonalen Antikörper (1:1000, Novus Biologicals, NB500-249) nach den vom Hersteller empfohlenen Protokolle bestimmt.

Die Patienten untersucht

Die Studie bestand aus 271 Magen Krebspatienten, die radikale Resektion für histologisch gesichertem Magenkarzinom von Cancer Center von Sun Yat-sen Universität zwischen Januar 1998 und Dezember 2006 erhielten wir informierten Zustimmung aller beteiligten Teilnehmer in dieser Studie unterzogen. Ethische Genehmigung wurde von Sun Yat-sen University Cancer Center Forschungsethikkommission erhalten. Die Zulassungskriterien enthalten histologisch R0-Resektion bestätigt, die wie keine makroskopischen und mikroskopischen Resttumor und postoperativen Überlebenszeit ≥6 Monate festgelegt wurde. Patienten mit Fernmetastasen oder präoperative Therapie oder Lymphknoten-negativ waren von der Studie ausgeschlossen. Die 7thTNM Klassifikation durch die American Joint Committee on Cancer und der Internationalen Union gegen Krebs Kriterien wurde für pathologische Staging verwendet [26]

Alle Patienten hatten Follow-up nach der Operation bei 6 bis 12 monatigen Abständen. Median Nachbeobachtungszeit betrug 38 (Bereich von 10 bis 145) Monaten für alle Patienten. Das Gesamtüberleben wurde definiert als der Zeitraum zwischen dem Zeitpunkt der Operation und Tod oder wurde zensiert bei der letzten Follow-up definiert wurde.

Immunhistochemie

Beclin 1 mit einem Kaninchen monoklonalen Antikörper nachgewiesen wurde ( 1:100, Novus Biologicals, NB500-249). Alle Tumorproben wurden aus operativ reseziert Magenkrebs vor adjuvante Therapie erhalten. Formalin-fixierte, in Paraffin eingebettete Gewebeblöcke wurden bei Raumtemperatur durch eine Identifikationsnummer identifiziert gespeichert. Die Verfahren wurden zuvor beschriebenen ähnlich zu dem Verfahren durchgeführt [23]. Die immunogefärbten Schnitte wurden ausgewertet und Gewebe von menschlichen Prostata-Adenokarzinome diente als positive Kontrolle. Alle Objektträger wurden durch zwei unabhängige Beobachter auf der Grundlage der Anteil der positiv gefärbten Tumorzellen und Intensität der Färbung bewertet. Laut kürzlich beschriebenen Kriterien für die Bewertung Beclin 1-Expression, die Intensität der Membranfärbung von schwach bis stark variiert: 0 (keine Färbung), 1 (schwache Färbung), 2 (moderate Färbung) und 3 (intensive Färbung) [27]. , 1 (6% bis 25%), 2 (26% bis 50%), 3 (51% bis 70%) und 4 (> der Prozentsatz der positiven Tumorzellen wurde als 0 (5% <), erzielte 70% ). Die Färbung Index wurde durch Summierung der Färbeintensität Punktzahl und den Prozentsatz der positiven Zellen Score berechnet. Immunoreaktives punkten gleich oder höher als 4 verwendet wurde, Tumoren mit hoher Beclin 1-Expression, und eine Färbung Score unter 4 verwendet wurde, zu klassifizieren niedrigen Beclin 1-Expression anzuzeigen.

Statistische Analysen

Alle statistischen Analysen mit SPSS Software (Version 18 für Windows, SPSS, Chicago, IL) durchgeführt wurden. Die Unterschiede bei P < 0,05 wurden als statistisch signifikant zu sein. Der Verband der Beclin-1-Expression mit verschiedenen clinicalopathologic Eigenschaften wurde mit dem Chi-Quadrat-Test analysiert. Überlebenskurven wurden von der Kaplan-Meier-Methode und verglichen mit dem Log-Rank-Test aufgetragen. Ein Cox Proportional Hazard Modell (rückwärts, schrittweise) für multivariable Analyse wurde für Faktoren angewendet, die Bedeutung in univariable Analyse erreicht.

Ergebnisse |

Beclin 1-Expression in Magenkrebs-Zelllinien

Die Überexpression von Beclin 1 wurde in vielen Krebsarten berichtet. Seine Expression Status in Magenkrebszelllinien bleibt jedoch unklar. Um die Expressionsniveaus von Beclin-1-Transkripte und Protein, semi-quantitative reverse Transkription-PCR-Analyse und Western-Blotting-Analyse bestimmen, wurden getrennt in normalen menschlichen Magen-Epithelzellen durchgeführt (GES-1) und sechs Magenkrebs-Zelllinien (HGC-27, MKN803, MGC-803, SGC-7901, MKN-28, BGC-823). Wir fanden heraus, dass Beclin 1-mRNA und Protein-Expression Ebene hochreguliert in allen sechs Magenkrebs-Zelllinien im Vergleich zu normalen Magenepithelzellen GES-1. (Abb. 1 A und B)

Beclin 1-Expression in Magenkrebs Gewebe

Beclin-1-mRNA und Protein-Expression in Magenkrebs Gewebe zu bestimmen, 4 Magenkrebsgewebe und noncancerous Gewebe angrenzend gepaart zu Krebs-Läsionen wurden durch reverse Transkription-PCR-Analyse und western-Blotting-Analyse, getrennt detektiert. Es wurde festgestellt, dass Beclin-1 in allen vier Tumorgewebeproben sowohl auf mRNA- und Proteinebene eine wesentlich höhere Expression war als jene in dem normalen Gewebe angrenzend an Tumoren von denselben Patienten (Fig. 1 C und D).

Beclin 1-Expression in Magenkrebs

Um zu untersuchen, ob Beclin-1 klinisch mit Magenkrebs Progression, Expression und subzelluläre Lokalisation von Beclin 1-Protein korrelieren konnte, wurde in 271 in Paraffin eingebetteten Magenkrebsgewebe durch Immunhistochemie nachgewiesen. Spezifische Beclin 1-Färbung wurde vor allem auf die Membran-Plasma und Zytoplasma in den Krebszellen gefunden, gelegentlich den Kern. Abbildung 2 zeigt repräsentative Beispiele für Beclin 1 Immunfärbung. Von den 271 Patienten, 229 (84,5%) waren Beclin 1 hohe Expression Tumoren.

Überlebensanalyse

Patienten mit Beclin 1 niedrige Expression zeigte Magenkrebs signifikant kürzere 5-Jahres-Raten das Gesamtüberleben (OS , p = 0,011; Abb. 3) und das Überleben freie Krankheit (DFS, p = 0,010; Abbildung 4) als diejenigen mit Beclin 1 hohe Expression diejenigen.. Die Expression von Beclin 1 ist eng mit intravaskulären Embolie (P = 0,017) in Verbindung gebracht. Allerdings gab es keine signifikante Korrelation zwischen der Expression von Beclin 1 und Alter, Geschlecht, Standort, Größe des Tumors, T-Klassifikation, N Klassifizierung oder pathologischen Stadium von Magenkrebs-Patienten (Tabelle 1). Beclin 1-Expression, Standort, intravaskuläre Embolie, pathologische T-Klassifikation, pathologischer N Klassifizierung und pathologischen Stadium waren unabhängige prognostische Faktoren in der univariaten Analyse (Daten nicht gezeigt) .In multivariable Analyse, Beclin 1-Expression, intravaskuläre Embolie, Standort und pathologischen Stadium waren bedeutende unabhängige prognostischer Faktor für die Überlebenszeit (Tabelle 2).

Discussion

Autophagy ist ein Selbstabbaumechanismus und mit Tumorprogression assoziiert. Beclin 1, eine Säuger Ortholog von Hefe Atg6, spielt eine entscheidende Rolle in dem Vesikel Nukleationsprozesses von autophagy [28]. Es ist ein unverzichtbares Gen für die ersten Phasen der autophagy [29] - [30].

Die vorliegende Studie hat zum ersten Mal zeigte Beclin 1 hochreguliert sowohl auf mRNA- und Protein-Spiegel in sechs Magenkrebs-Zelllinien im Vergleich zu denen in normalen Magenepithelzellen GES-1. Wir zeigten auch Beclin 1-Expression in primären Tumoren des Magens im Vergleich mit vier gepaarte Magenkrebs Proben neben Tumoren, die von den gleichen Patienten, die durch reverse Transkription-PCR und Western Blot erhöht ist. Die Ergebnisse unterscheiden sich von denen in der Leber Krebszellen und Gebärmutterhalskrebszellen berichtet, die Beclin 1-Expression zeigte deutlich niedriger im Vergleich zu den entsprechenden normalen Geweben [31], [32]. Die mögliche explaination ist, dass Beclin-1-Expression in Magenkrebs zur Induktion von Autophagie Zelltod beitragen, wodurch selektive Druck erzeugt Zelltod während der Entwicklung der Krebs außer Kraft zu setzen [27], [33].

In dieser Studie wir beobachteten, dass 229 (84,5%) der Patienten mit hoher Expression Beclin 1 in 271 Magenkrebs-Patienten, in Übereinstimmung mit dem Ergebnis der früheren Studie von Ahn et al.Their Daten zeigten keine oder nur sehr schwache Expression von Beclin1 in normalen Schleimhautzellen hatten Magen durch Immunhistochemie [27]. Allerdings hat sie nicht die Beclin-1-Expression auf mRNA-Ebene in Zelllinien erforschen, noch seine Rolle bei der Vorhersage untersuchen.

Wir untersuchten dann die Beziehung zwischen der Expression von Beclin-1 und klinischen Merkmale der Patienten . Es gab keine signifikante Korrelation zwischen der Expression von Beclin-1 und Alter, Geschlecht, T-Klassifikation, N Klassifizierung oder Stadium der Patienten mit Magenkrebs. Interessant war in unserer aktuellen Studie, gibt es eine signifikante Beziehung zwischen der Expression von Beclin-1 und intravaskulären Embolie. Es was darauf hindeutet, dass Beclin-1 könnte als Marker intravaskulären Embolie bei Patienten mit Lymphknoten-positivem Magenkrebs verwendet werden. Diese Beobachtungen unterstreichen die wichtige Rolle der Beclin-1 in der Entwicklung von Magenkrebs.

Darüber hinaus fanden wir geringe Beclin-1-Expression war stark mit einer verringerten Überleben bei Patienten mit Magenkrebs ( P
assoziiert = 0,011) und die intravaskuläre Embolie Teilmenge ( P
= 0,017). In multivariablen Analyse, behielt Beclin-1-Expression seine Unabhängigkeit als prognostischer Faktor ( P
= 0,044). Diese Ergebnisse deuten auf eine potenziell vielversprechenden Nutzen von Beclin-1 als prognostischer und Überleben Indikator. Der Mechanismus ist noch nicht klar. Die alternative Erklärung dafür könnte sein, dass Beclin-1-Expression in Magenkrebs Grenzen chromosomale Instabilität und die Häufigkeit der zusätzlichen Mutation verringert [34].

Nach unserem Wissen, die Studie ist der erste Bericht, dass Beclin 1 a hatte signifikant höhere Expression in Magenkrebs Zellen und Gewebe an beiden mRNA und Proteinspiegel im Vergleich zu ihren normalen gegen~~POS=TRUNC. Darüber hinaus fanden wir hohe Beclin 1-Expression mit einer längeren Überlebenszeit verbunden war. Sowohl univariaten Analyse und multivariate Analyse zeigte Beclin 1-Expression, Standort, intravaskuläre Embolie und pathologischen Stadium waren unabhängige prognostische Faktoren. Die Ergebnisse deuten stark darauf hin, dass Beclin 1 eine mögliche Rolle bei der Tumorentstehung von Magenkrebs hat. Es könnte ein vielversprechender Biomarker und eine neue therapeutische Strategien für Patienten mit Lymphknoten-positivem Magenkrebs sein. Weitere Studien sind auch um den Mechanismus zu klären, benötigt, durch die autophagy Schauspieler Beclin 1 in der Entwicklung und Progression von Magenkrebs beteiligt ist.

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