Plos ONE: Beclin-1 Expression je pomemben napovednik preživetje pri bolnikih z bezgavko, Pozitivna želodca Cancer

Povzetek

Ozadje

Beclin 1 je glavni akter avtofagija. Izraz Beclin 1 in njene prognostičnega vlogo pri raku želodca je v veliki meri neraziskana. Namen te študije je raziskati izražanje beclin 1 v želodčnih rakavih celic, tkiv in njeno razmerje s prognozo.

Metode

Izraz Beclin 1 je bila odkrita v 271 osebkov limfna vozla pozitivna želodca pacienti z imunohistokemijo. Korelacija Beclin 1 izražanja clinicopathologic funkcij in preživetje raka želodca so proučevali. Beclin-1 izraz v želodcu raka celičnih linijah in kliničnih vzorcev zazna tudi s pomočjo reverzne transkripcije-PCR in Western blot.

Rezultati

Beclin 1 je reguliran tako na mRNA in vsebnosti beljakovin v šest želodca linije rakave celice v primerjavi s tistimi, ki v normalnih sluznica celične linije želodca (GES-1). Izraz Beclin-1 v želodčnih kliničnih vzorcev je tudi višje od tistih v sosednjih noncancerous tkiva. Od 271 bolnikov, je bilo 229 (84,5%) Beclin 1 visokih izražanja tumorjev z imunohistokemijo. Beclin 1 izraz, ki je tesno povezana z intravaskularno embolijo. Kaplan-Meier analiza je pokazala visoko beclin je 1 izraz, povezan z daljšim celotnem preživetju. Oba univariatne analize in multivariatna analiza je pokazala, da so bile Beclin 1 izraz neodvisni napovedni dejavniki pri bolnikih z rakom želodca, pozitivnimi bezgavkami.

Sklepi

Naše ugotovitve močno nakazujejo, da ima Beclin 1 potencialno vlogo pri tumorigeneze raka želodca in bi bilo obetavno biomarkerjev za napovedovanje prognozo bolnikov z limfnega raka želodca pozitivnimi bezgavkami. Ki jo lahko služi tudi kot nove terapevtske tarče za zdravljenja raka želodca

Navedba. Geng Q-R, Xu D-Z, je L-J, Lu J-B, Zhou Z-W Zhan Y-Q, et al. (2012) Beclin-1 Expression je pomemben napovednik preživetje pri bolnikih z limfnih vozlov, Pozitivne želodca raka. PLoS ONE 7 (9): e45968. doi: 10,1371 /journal.pone.0045968

Urednik: Alejandro H. Corvalan, Katoliška univerza Catolica de Chile, Čile

Prejeto: 4. april 2012; Sprejeto: 23. avgust 2012; Objavljeno: 27. september 2012

Copyright: © Geng et al. To je odprtega dostopa članek razširja pod pogoji Creative Commons Attribution License, ki omogoča neomejeno uporabo, distribucijo in razmnoževanje v katerem koli mediju, pod pogojem, da prvotni avtor in vir knjižijo

Financiranje:. To delo je podprl Medical Science Foundation provinci Guangdong (št 2010B031600071). Med financerji imel nobene vloge pri oblikovanju študije, zbiranje in analizo podatkov, sklep, da se objavi, ali pripravi rokopisa

nasprotujočimi si interesi.. Avtorji so izjavili, da ne obstajajo konkurenčni interesi

Uvod

rak želodca ostaja velik javno zdravstveni problem po vsem svetu, še posebej v vzhodnoazijskih državah, starostna standardizirana incidenčna stopnja je > 20 na 100.000 [1]. Za napredovalega raka želodca, njegova prognoza je še vedno slaba, z ocenjenim splošni 5-letno preživetje 25% ali manj [2], [3]. Bezgavka metastaze je najmočnejši napovedni kazalec po kurativno resekcijo [4] - [7]. Približno 75% naprednih bolnikov ima raka, pozitivnimi bezgavkami želodca, katerega prognoza bili bistveno slabši kot pri tistih z bezgavkami negativen bolezni [4].

V prejšnjih raziskavah smo ugotovili pozitivno razmerje bezgavka je neodvisna prognostični kazalec na bolnikih z rakom želodca, pozitivnimi bezgavkami in intraperitonealno kemoterapijo je lahko koristna [8], [9]. Vendar pa je temeljni korak k izboljšanju preživetja bolnikov z bezgavko-pozitivnim rakom želodca je v večjo razumevanje biološkega vedenja tumorja in iskanje možnih ciljev za posamezne terapije [10], [11]. Na primer, je človeški epidermalni rastni dejavnik receptorja 2 (HER2) postala nov označevalec raka želodca po načelih, ki temeljijo na dokazih [12] .Adding trastuzumab na standardni kemoterapiji lahko spremeni slabo preživetje bolnikov z metastatskim rakom želodca HER2 pozitivno [13] - [15]

Pred kratkim je bila dana vloga avtofagija pri razvoju raka in zdravljenja raka veliko zaskrbljenost [16] - [18].. Beclin 1, ključni regulator postavitev avtofagija, je bilo ugotovljeno čezmerno v različnih človeških rakavih obolenj [19] - [22].

Vendar pa je še vedno relativno malo študij, ki so preiskali združenje med Beclin 1 in rak želodca. Še posebej, so še poročali o nobenih podatkov o njihovih učinkih na prognozo raka želodca.

Ta študiji so raziskovali Beclin 1 izraz v želodčnih rakavih celic, tkiv in njeno clinicopathologic pomembna pri bolnikih z bezgavka pozitivna želodcu rak. Poleg tega smo analizirali razmerja med Beclin 1 izražanja z napovedjo, da se ugotovi, ali Beclin 1 more napovedati rezultatov kliničnih raziskav.

Materiali in metode

Celične linije in pogoji kultiviranja

linije človekovih želodca rakava celica HGC-27, MKN803, MGC-803, SGC-7901, MKN-28, BGC-823 so bili darila iz Peking University School of Oncology (Peking, PR China.) [23], [24]. Normalna želodčne sluznice celična linija, GES-1, ki izhajajo iz človeškega ploda želodčne sluznice epitela, dobimo iz prve odvisnimi bolnišnice Sun Yat-Sen univerze [25]. Te celične linije smo vzdrževali v RPMI 1640 medija (Invitrogen), dopolnjenem z 10% fetalnega govejega seruma (Hyclone), penicilin (100 enot /ml) in streptomicin (100 enot /ml) pri 37 ° C in 5% CO2 v vlažnem inkubatorju .

Reverse prepis-PCR

Total RNA je bila vzeta z metodo TRIzola. RNA smo obdelali z DNazo in se uporablja za cDNA sintezo z naključnimi heksamerov. Mešanica (25 xl skupaj) za PCR sestavljalo 0,5 ul cDNA, 0.5 U Taq DNA polimerazo, 2.5 xl 10 × PCR pufer, 2,5 mM dNTP mešanice in 50 pM smiselnimi in protismiselnimi primerji vsak. Beclin 1 smo analizirali z naslednjimi primerji: Beclin 1 5'CGTGGAATGGAATGAGAT3 '

povratne premaz, 5' GTAAGGAACAAGTCGGTAT3 ';

Actin: 5'AGCCATGTACGTAGCCATCC3 "

in 5' GTGGTGGTGAAGCTGTAGC 3 '.

Western blot analizo

Celice smo lizirali v liznem pufru in koncentracijo proteina določimo z metodo Bradfordu barvila (Bio-Rad Laboratories). Enaka količina ekstrakta celic so bili izpostavljeni SDS-PAGE in prenesli na PVDF membrano (Bio-Rad). Izražanje Beclin 1 je bila določena z protitelesa zajec monoklonsko (1:1000, Novus Biologicals, NB500-249), v skladu s predlaganimi protokolov proizvajalca.

Bolniki študiral

Študija je sestavljalo 271 želodca bolniki z rakom, ki so šli skozi radikalno resekcijo za histološko potrjenega raka želodca iz Cancer Center Sun Yat-sen Univerze v obdobju od januarja 1998 do decembra 2006 smo pridobili soglasja vseh udeležencev v tej študiji. Etično je bila odobritev pridobljena iz Sun Yat-sen University Cancer Center raziskovalne etiko. Merila za upravičenost vključeni histološko potrjeni kurativna R0 resekcijo, ki je bil definiran kot ne makroskopski in mikroskopski preostalega tumorja in pooperativni čas preživetja ≥6 mesecev. Bolniki z oddaljenih zasevkov ali predoperativno terapijo ali bezgavke-negativni so bili izključeni iz študije. Razvrstitev 7thTNM Skupni odbor ameriškega raka in Mednarodne zveze proti meril za boj proti raku je bil uporabljen za patološko uprizoritev [26]

Vsi bolniki so imeli spremljanje po operaciji na 6 do 12 mesečnih presledkih.; Mediana spremljanja obdobje je bilo 38 (razpon 10-145) mesecev za vse bolnike. Celokupnega preživetja je bila opredeljena kot je bila opredeljena kot obdobje v času med operacijo in smrt, ali je bilo cenzurirano na zadnjem spremljanju.

Imunohistokemija

Beclin 1 je bila odkrita z protitelesa zajec monoklonsko ( 1:100, Novus Biologicals, NB500-249). Vse tumor vzorci so bili pridobljeni s kirurško odstranjenimi želodčnega raka pred adjuvantno terapijo. Formalinu fiksno,-parafin vgrajeni bloki tkiva smo hranili pri sobni temperaturi, označenega z identifikacijsko številko. Postopke smo izvedli podobno metodo prej opisanem [23]. V imunoreaktivnosti odseki so bili ocenjeni in tkiva iz človeških prostate adenokarcinome služil kot pozitivno kontrolo. Vsi preparati so bili ocenjeni z dvema neodvisnima opazovalci na osnovi deleža pozitivno obarvanih tumorskih celic in intenzivnost obarvanja. Glede na nedavno opisanih kriterijih za ocenjevanje Beclin 1 izražanja, intenzivnost membranskega barvanja razlikuje od šibkih do močna: 0 (brez barvanja), 1 (šibko madeži), 2 (zmerno obarvanje) in in 3 (intenzivno obarvanje) [27]. Odstotek pozitivnih tumorskih celic je dosegel vrednost 0 (< 5%), 1 (6% do 25%), 2 (26% do 50%), 3 (51% do 70%) in 4 (> 70% ). Indeks obarvanje je bila izračunana s seštevanjem točk intenzivnosti obarvanja in odstotek pozitivnih celic rezultat. Imunološko rezultat enak ali večji od 4 je bila uporabljena za razvrstitev tumorjev z visoko Beclin 1 izražanja, in obarvanje ocena pod 4 je bil uporabljen pri nizkem Beclin 1 izraz.

Statistične analize

Vse statistične analize so bile izvedene s pomočjo SPSS programske opreme (različica 18 za Windows; SPSS, Chicago, IL). Razlike v P < .05 naj bi bile statistično značilne. Združenje Beclin-1 izražanja z različnimi clinicalopathologic funkcijami smo analizirali s testom hi-kvadrat. Preživetja Krivulje so narisane po metodi Kaplan-Meier, in v primerjavi s testom log-ranga. COX sorazmeren vzorec nevarnosti (nazaj, postopen) je bila uporabljena za multivariabilnega analiz dejavnikov, ki so dosegle pomen v univariablinega analizi.

Rezultati

Beclin 1 izraz v želodcu raka celičnih linijah

Čezmerno Beclin 1 so poročali v mnogih raka. Njen izraz stanja v želodcu raka celičnih linijah, pa še vedno ni jasno. Za določitev ravni izražanja beclin-1 transkriptov in beljakovin, semi-kvantitativno reverzno transkripcijo-PCR analizo in zahodni blot analiz so bile opravljene ločeno v normalnih želodčne epitelijskih celic človeških (GES-1) in šest želodčnega raka celičnih linijah (HGC-27, MKN803, MGC-803, SGC-7901, MKN-28, BGC-823). Ugotovili smo, da Beclin 1 mRNA in proteina nivo izražanja up-urejena v vseh šestih želodčnih raka celičnih linijah v primerjavi z običajnimi želodčnih epitelijskih celic GES-1. (Sl. 1 A in B)

Beclin 1 izraz v želodčnih tkivih raka

Če želite ugotoviti, beclin-1 mRNA in proteinov izražanja v želodčnih tkivih raka, 4 v paru želodčni rakavih tkiv in noncancerous tkiv sosednjih do raka lezije so bile odkrite z reverzno analizo prepis-PCR in zahodni blot analizo ločeno. Je bilo ugotovljeno, da so imeli Beclin-1 pri vseh štirih vzorcih tumorskih tkiv bistveno višjo ekspresijo na tako mRNA in beljakovin ravneh od tistih v normalnem tkivu, ki mejijo na tumorje iz istih bolnikov (sl. 1 C in D).

beclin 1 izraz želodčnega
raka

Da bi raziskali, ali beclin-1 lahko klinično korelaciji z želodčno napredovanje raka, izražanja in subcelično lokalizacijo beclin 1 proteina bil odkrit z imunohistokemijo v 271-parafin vgrajeni želodčnega tkiva raka. Specifična Beclin 1 obarvanje je večinoma na voljo na membransko-plazmi in citoplazmi v rakavih celicah, občasno jedra. Slika 2 prikazuje reprezentativne primere Beclin 1 imunskim barvanjem. Od 271 bolnikov, je bilo 229 (84,5%) Beclin 1 visoke izraz tumorji.

Survival analiza

Bolniki z Beclin 1 nizka izražanja rakom želodca je pokazala bistveno krajša splošna stopnja preživetja 5-letno (OS , p = 0,011;. slika 3) in bolezni, preživetje brez (DFS, p = 0,010; slika 4), razen tistih s Beclin 1 visoko izražanja narave.. Izraz Beclin 1 je tesno povezano s intravaskularno embolijo (P = 0,017). Vendar pa ni bilo statistično značilna korelacija med stopnjo ekspresije Beclin 1 in starost, spol, lokacija, velikost tumorja, klasifikacija T, razvrščanje N ali patološko fazi bolnikov želodca z rakom (tabela 1). Beclin 1 izraz, mesto, intravaskularno embolijo, patološki klasifikacija T, patološki klasifikacija N in patološki fazi so neodvisni napovedni dejavniki v univariantne analize (podatki niso prikazani) .V multivariabilnega analize so Beclin 1 izraz, intravaskularno embolijo, mesto in patološki fazi pomemben neodvisen napovedni dejavnik za čas preživetja (tabela 2).

Pogovor

avtofagija je mehanizem samo-degradacijo in povezani z napredovanja tumorja. Beclin 1, pri sesalcih orthologue kvasa Atg6, igra ključno vlogo v procesu Žuborenje nukleacije v avtofagija [28]. Je gen nujna za prvo fazo avtofagija [29] -. [30]

Sedanja Študija je, prvič, je pokazala Beclin 1 pripravljen reguliran na obeh mRNA in beljakovin ravni v šestih linije želodčni rak celic v primerjavi s tistimi običajnih želodčnih epitelijskih celic GES-1. Prav tako je pokazala Beclin 1 izraz povišano primarnih želodčnih tumorjev v primerjavi s štirimi seznanjenih želodčnih vzorcev z rakom, ki mejijo na tumorje iz istih bolnikov z reverzno transkripcijo-PCR in zahodni blot. Rezultati se razlikujejo od tistih, ki poročajo v rakavih celicah jeter in raka materničnega vratu celic, ki je pokazala Beclin 1 izraz bistveno nižji v primerjavi z ustreznimi normalnih tkivih [31], [32]. Morebitna explaination je, da beclin-1 izraz v želodcu raka prispevajo k indukcijo autophagic celične smrti, s čimer bi proizvedli selektivno pritisk preglasitve odmiranje celic med razvojem raka [27], [33].

V tej študiji smo ugotovili, da je 229 (84,5%) bolnikov visoko izražanje Beclin 1 od 271 bolnikov z rakom želodca, v skladu s tem, kar je prejšnje študije podatkov Ahn et al.Their pokazala nobene ali zelo šibko izražanje Beclin1 v normalnih celic sluzničnih v želodcu, ki ga imunohistokemijo [27]. Vendar pa ni bilo raziskati beclin-1 izraz na ravni mRNA v celičnih linijah, ne preučijo njegovo vlogo v prognozo.

Nato smo analizirali odnos med izražanjem beclin-1 in klinične značilnosti bolnikov . Ni bilo pomembno soodvisnost med izražanjem beclin-1 in starosti, spola, razvrščanje T, razvrščanje N, ali faze pri bolnikih z rakom želodca. Zanimivo je, da v naši trenutni raziskavi, je bila pomembna povezava med izražanjem beclin-1 in intravaskularno embolijo. To kaže, da bi se beclin-1 uporabimo kot označevalca intravaskularne embolijo pri bolnikih z rakom želodca vozlišče-pozitivna. Te ugotovitve poudarjajo pomembno vlogo beclin-1 pri razvoju raka želodca.

Poleg tega smo ugotovili nizko beclin-1 je izraz močno povezana z zmanjšano preživetje bolnikov z rakom želodca ( P
= 0,011) in intravaskularno embolijo podskupino ( P
= 0,017). V multivariabilnega analizi Beclin-1 izraz ohranil svojo neodvisnost kot prognostični dejavnik ( P
= 0,044). Ti rezultati kažejo na potencialno obetavnih uporabnost beclin-1 kot prognostični in preživetje kazalca. Mehanizem še vedno ni jasno. Alternativa razlaga za to je lahko, da beclin-1 izraz v želodčnih rakov omejuje kromosomsko nestabilnost in zmanjša pogostost dodatnega mutacije [34].

Kolikor nam je znano, je študija je prvo poročilo, ki je bilo Beclin 1 a bistveno višje izražanje v želodčnih rakavih celic in tkiv na ravni mRNA in ravni beljakovin v primerjavi s svojimi običajnimi kolegi. Poleg tega smo ugotovili visoko beclin je 1 izraz, povezan z daljšim celotnem preživetju. Oba univariatne analize in multivariatna analiza je pokazala, Beclin 1 izraz, mesto, intravaskularno embolijo in patološki fazi so neodvisni napovedni dejavniki. Rezultati jasno kažejo, da ima Beclin 1 potencialno vlogo pri tumorigeneze raka želodca. To bi bilo obetavno biomarkerjev in roman terapevtskih strategij pri bolnikih s limfnega raka želodca pozitivnimi bezgavkami. Prav tako so potrebne nadaljnje študije, da se pojasni mehanizem, s katerim avtofagija akter Beclin 1 vključeni v razvoj in napredovanje raka želodca.

• Plos ONE: Interakcija med GSTP1 Val alel in H. pylori, okužba, Kajenje in porabo alkohola in tveganja želodčnega raka med kitajskega prebivalstva
• Plos ONE: naravne imunosti in ne-Hodgkinov limfom (NHL) Povezane Geni v zadevi-Control Študija Vgnezdeno za Rak želodca tveganja