PLoS ONE: Beclin-1 Expression on merkittävä ennustaja Survival potilailla, joilla imusolmukemääritysmenetelmä-Positiivinen Mahalaukun Cancer

tiivistelmä

Background

Beclin 1 on keskeisin toimija autophagy. Ilmaisu on Beclin 1 ja sen ennustetekijöiden rooli mahasyövässä on paljolti hyödyntämättä. Tarkoituksena Tämän tutkimuksen tarkoituksena on selvittää ilmaus beclin 1 mahasyövän solujen, kudosten ja sen suhdetta ennustetta.

Methods

ilmentymistä Beclin 1 havaittiin 271 yksilöiden imusolmukkeiden positiivinen mahasyöpäpotilaista immunohistokemiallisesti. Korrelaatio Beclin 1 ilmaisun viittaavia tekijöitä ja selviytyminen mahasyövän tutkittiin. Beclin-1 ilmentymisen mahasyövässä solulinjoissa ja kliinisissä näytteissä on myös havaita käyttämällä käänteistranskriptio-PCR ja Western blottauksella.

Tulokset

Beclin 1 säädelty sekä mRNA ja proteiini tasoilla kuusi mahasyövän solulinjoissa verrattuna normaalissa mahalaukun limakalvon solulinja (GES-1). Ekspressio Beclin-1 mahalaukun kliinisissä näytteissä on myös suurempi kuin viereisen noncancerous kudoksiin. Niistä 271 potilasta, 229 (84,5%) oli Beclin 1 korkea ilmentyminen kasvaimissa immunohistokemiallisesti. Beclin 1 ilmentyminen liittyy läheisesti intravaskulaarisen veritulpan. Kaplan-Meier-analyysi osoitti korkealla beclin 1 ilmentyminen liittyi pidempi kokonaiselinaika. Sekä yhden muuttujan analyysiin, ja monimuuttuja-analyysi paljasti, että Beclin 1 ilme olivat riippumattomia ennustettaessa potilaiden paikallisiin imusolmukkeisiin mahasyövän.

Johtopäätökset

havainnot viittaavat vahvasti siihen, että Beclin 1 on mahdollisen roolin tumorigeneesin mahasyöpä- voisi olla lupaava biomarkkereiden ennustamiseksi ennusteen potilaita, joilla imusolmuke-positiivisen mahasyövän. Se voisi myös toimia uutena terapeuttisena kohteena mahalaukun syövän hoitoon.

Citation: Geng Q-R, Xu D-Z, hän L-J, Lu J-B, Zhou Z-W, Zhan Y-Q, et ai. (2012) Beclin-1 Expression on merkittävä ennustaja Survival potilailla, joilla imusolmukemääritysmenetelmä-positiivinen mahalaukun syövän. PLoS ONE 7 (9): e45968. doi: 10,1371 /journal.pone.0045968

Editor: Alejandro H. Corvalan, Pontificia Universidad Catolica de Chile, Chile

vastaanotettu: 04 huhtikuu 2012; Hyväksytty: 23 elokuu 2012; Julkaistu: 27 syyskuu 2012

Copyright: © Geng et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat Lääketieteen säätiö Guangdong (nro 2010B031600071). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Mahalaukun syöpä on edelleen merkittävä kansanterveydellinen ongelma maailmanlaajuisesti, erityisesti Itä-Aasian maissa Ikävakioitu esiintyvyys on > 20 per 100000 [1]. Kehittyneen mahasyöpä, sen ennuste on edelleen huono, oli arviolta yleisen 5 vuoden pysyvyys 25% tai vähemmän [2], [3]. Imusolmuke etäpesäke on tehokkain ennustetekijöiden indikaattori seuraavat parantava resektio [4] - [7]. Noin 75% kehittyneiden potilaista on paikallisiin imusolmukkeisiin mahasyöpä, joiden ennuste oli merkittävästi huonompi kuin niille, joilla on imusolmukkeisiin negatiivinen tauti [4].

Aiemmissa tutkimuksissa olemme löytäneet positiivinen imusolmuke suhde on riippumaton ennustetekijöiden osoitin potilaille, joilla paikallisiin imusolmukkeisiin mahasyövän ja vatsaonteloon kemoterapiaa voi olla hyödyllistä [8], [9]. Kuitenkin olennainen askel kohti parantaa eloonjäämistä potilailla, joilla imusolmuke-positiivisen mahasyövän piilee lisääntynyt ymmärrys kasvaimen biologista käyttäytymistä ja etsivät mahdollisia tavoitteita yksittäisille hoito [10], [11]. Esimerkiksi ihmisen epidermaalisen kasvutekijän reseptori 2 (HER2) on tullut nyt uusi merkkiaine mahasyövän seuraavista näyttöön perustuvien periaatteiden [12] .Adding trastutsumabi standardin kemoterapiaa voisi muuttaa huono eloonjäämistä HER2-positiivinen metastasoitunut mahasyöpä [13] - [15].

Äskettäin rooli autophagy syövän kehittymisessä ja syövän hoito on annettu suuri huolenaihe [16] - [18]. Beclin 1, keskeinen säätelijä autophagy muodostumista, havaittiin yli-ilmentyminen erilaisissa ihmisen syövissä [19] - [22].

on kuitenkin edelleen suhteellisen vähän tutkimuksia, jotka ovat tutkineet yhdistyksen välillä Beclin 1 ja mahasyöpä. Erityisesti ole tietoja niiden vaikutukset ennusteen mahasyövän, ei ole vielä raportoitu.

Tässä tutkimuksessa tutkittiin Beclin 1 ilmentymisen mahasyövässä solujen, kudosten ja sen ennusteeseen viittaavia merkitys potilaille, joilla imusolmuke-positiivisen mahalaukun syöpä. Lisäksi olemme analysoineet väliset suhteet Beclin 1 lausekkeen ennusteeseen onko Beclin 1 voi ennustaa kliinisen tuloksen.

Materiaalit ja menetelmät

Solulinjat ja viljelyolosuhteet

ihmisen mahasyövän solulinjat HGC-27, MKN803, MGC-803, SGC-7901, MKN-28, BGC-823 olivat lahjoja Pekingin yliopiston School of Oncology (Peking, PR China.) [23], [24]. Normaali mahan limakalvon solulinja, GES-1, joka on johdettu ihmisen sikiön mahalaukun limakalvon epiteelin, saatiin ensimmäisen Affiliated sairaala Sun Yat-Sen University [25]. Nämä solulinjat pidettiin RPMI 1640-alustassa (Invitrogen), jota oli täydennetty 10% naudan sikiön seerumia (Hyclone), penisilliiniä (100 yksikköä /ml) ja streptomysiiniä (100 yksikköä /ml) 37 ° C: ssa ja 5% CO 2: ssa kosteutetussa inkubaattorissa .

Käänteinen transkriptio-PCR

Kokonais-RNA uutettiin käyttäen TRIzol menetelmällä. RNA esikäsiteltiin DNaasia ja käytettiin cDNA-synteesi satunnaisella heksameerejä. Seosta (25 ui yhteensä) PCR koostui 0,5 ul cDNA, 0,5 U Taq DNA-polymeraasia, 2,5 ui 10 x PCR-puskuria, 2,5 mM dNTP seosta, ja 50 pM sense ja antisense-alukkeina kussakin. Beclin 1 analysoitiin seuraavia alukkeita: Beclin 1 5'CGTGGAATGGAATGAGAT3 '

käänteinen aluke 5' GTAAGGAACAAGTCGGTAT3 ';

Actin: 5'AGCCATGTACGTAGCCATCC3 "

ja 5' GTGGTGGTGAAGCTGTAGC 3 ".

Western blot-analyysi

Solut hajotettiin hajotuspuskuriin ja proteiinipitoisuus määritettiin Bradfordin väriaineen menetelmällä (Bio-Rad Laboratories). Yhtä suuret määrät solu-uutteen altistettiin SDS-PAGE: lla ja siirrettiin PVDF-kalvolle (Bio-Rad). Expression of Beclin 1 määritettiin kaniinin monoklonaalisella vasta-aineella (1:1000, Novus Biologicals, NB500-249) mukaan valmistajan ehdotti protokollia.

Potilaat tutkittiin

Tutkimus koostui 271 mahalaukun syöpäpotilailla, joille tehtiin radikaali resektio varten histologisesti varmennettu mahakarsinoo- Cancer Center of Sun Yat-sen yliopiston välillä tammikuun 1998 ja joulukuun 2006 Saimme tietoisen suostumuksen kaikilta osanottajat mukana tässä tutkimuksessa. Eettinen hyväksyntä saatiin Sun Yat-sen University Cancer Centerin tutkimuksen eettinen komitea. Kelpoisuusvaatimuksia sisältyi histologisesti varmennettu R0 resektio, joka määriteltiin ei makroskooppiset ja mikroskooppiset jäljellä kasvain ja postoperatiivisesti elinaika ≥6 kuukautta. Potilaat, joilla on etäispesäkkeitä tai ennen leikkausta hoitoa tai imusolmuke-negatiivinen jätettiin pois tutkimuksesta. 7thTNM luokitus American sekakomitean Cancer and International Union syöpää vastaan ​​kriteereitä käytettiin patologinen lavastus [26].

Kaikilla potilailla oli seurannan leikkauksen jälkeen klo 6-12 kuukautta välein; Mediaani seuranta-aika oli 38 (vaihteluväli 10-145) kuukautta kaikille potilaille. Kokonaiselossaoloaika määriteltiin määriteltiin välisenä aikana leikkauksen aikana ja kuoleman tai sensuroitiin viimeisessä seurannassa.

immunohistokemia

Beclin 1 havaittiin kaniinin monoklonaalisella vasta-aineella ( 1:100, Novus Biologicals, NB500-249). Kaikki kasvain näytteet saatiin kirurgisesti resektoitiin mahasyövistä ennen adjuvanttihoito. Formaliini-, parafiiniin upotettujen kudosten lohkojen säilytettiin huoneenlämpötilassa tunnistetaan tunnistenumero. Menettelyt tehtiin samalla menetelmällä edellä kuvatulla tavalla [23]. Immunovärjättiin osat arvioitiin ja kudoksia ihmisen eturauhasen adenokarsinooman toimi positiivisena kontrollina. Kaikki objektilasit arvioitiin kaksi riippumatonta tarkkailijaa perustuu osuus positiivisesti värjättyä kasvainsolujen ja värjäyksen voimakkuuden. Mukaan äskettäin kuvattu kriteerit luokitus Beclin 1 ilme, intensiteetti solukalvojen värjäytymistä vaihteli heikosta voimakkaaseen: 0 (ei värjäystä), 1 (heikko värjäytyminen), 2 (kohtalainen värjäytyminen) ja ja 3 (voimakas värjäytyminen) [27]. Niiden positiivisten kasvainsolujen pisteytettiin 0 (alle 5%), 1 (6%: sta 25%), 2 (26%: sta 50%), 3 (51%: sta 70%) ja 4 (> 70% ). Värjäys indeksi laskettiin yhteensä värjäytymisintensiteettiä pisteet ja positiivisten solujen prosenttiosuuden pisteet. Immunoreaktiiviset pisteet yhtä suuri tai suurempi kuin 4 käytettiin luokitella kasvainten korkea Beclin 1 ilme ja värjäys pisteet alle 4 käytettiin ilmaisemaan alhainen Beclin 1 ilme.

Tilastolliset analyysit

Kaikki tilastolliset analyysit suoritettiin käyttäen SPSS (versio 18 Windows, SPSS, Chicago, IL). Erot P < 0,05 katsottiin olevan tilastollisesti merkitsevä. Yhdistys Beclin-1 ilmentymisen eri clinicalopathologic ominaisuuksia analysoitiin käyttäen chi-neliö testi. Survival käyrät piirrettiin Kaplan-Meier menetelmällä ja verrattiin log-rank-testi. Coxin suhteellisen riskin malliin (taaksepäin, vaiheittainen) ja monimuuttuja analyysiä haettiin tekijöitä, jotka saavutettiin merkitys univariable analyysiin.

Tulokset

Beclin 1 ilmentymistä mahasyövässä solulinjoissa

yli-ilmentyminen Beclin 1 on raportoitu monissa syövissä. Sen ilmentymistilanne mahasyövän solulinjoissa on kuitenkin edelleen epäselvä. Ekspression määrittämiseksi tasot beclin-1-transkriptien ja proteiinin, semikvantitatiivinen käänteistranskriptio-PCR-analyysi ja western blotting-analyysi suoritettiin erikseen normaaleissa ihmisen mahalaukun epiteelisolujen (GES-1) ja kuusi mahasyövän solulinjoissa (HGC-27, MKN803, MGC-803, SGC-7901, MKN-28, BGC-823). Huomasimme, että Beclin 1 mRNA ja ekspressiotaso säädellään ylöspäin kaikki kuusi mahasyövässä solulinjoissa verrattuna normaaliin mahalaukun epiteelisolujen GES-1. (Fig. 1 A ja B) B

Beclin 1 ilmentymisen mahasyövän kudoksissa

määrittämiseksi beclin-1-mRNA: n ja proteiinin ekspression mahasyövän kudoksissa, 4 pariksi mahasyövän kudosten ja noncancerous kudosten viereisen syövän vaurioita havaittiin käänteistranskriptio-PCR-analyysi ja western blotting-analyysi, erikseen. Todettiin, että Beclin-1 kaikki neljä kasvain kudosnäytteitä oli huomattavasti suurempi ekspressio sekä mRNA: ta ja proteiinia tasoilla kuin normaalissa kudoksessa vieressä kasvaimia samasta potilaasta (Fig. 1 C ja D).

Beclin 1 ilmentymisen mahasyövässä

sen tutkimiseksi, beclin-1 voisi kliinisesti korreloi mahalaukun syövän etenemiseen, ilmaisun ja solunosasijaintia Beclin 1-proteiinin havaittiin immunohistokemia 271 parafinoidut mahasyövän kudoksiin. Erityiset Beclin 1 värjäytyminen oli enimmäkseen löydetty kalvon-plasma ja sytoplasmassa syöpäsoluissa, joskus tumaan. Kuvio 2 esittää edustavia esimerkkejä Beclin 1 immunovärjäyksen. Niistä 271 potilasta, 229 (84,5%) oli Beclin 1 voimakkaaseen ilmentymiseen kasvaimia.

Survival analyysi

Potilaat, joilla Beclin 1 heikkoa ilmentymistä mahasyövän osoittivat huomattavasti lyhyempi 5-vuoden yleinen eloonjäämisluvut (OS , p = 0,011; Kuva. 3) ja taudista vapaan eloonjäämisen (DFS, p = 0,010; Kuva. 4) kuin ne, joilla Beclin 1 korkea ilmaisun niistä. Ilmaisu on Beclin 1 on tiiviisti mukana intravaskulaarisen veritulpan (P = 0,017). Kuitenkin, ei ollut merkittävää korrelaatiota ilmentymisen tason Beclin 1 ja ikä, sukupuoli, päällä, kasvaimen koko, T luokittelu, N luokittelu, tai patologisen vaiheessa mahasyöpäpotilaista (taulukko 1). Beclin 1 ilme, sivusto, suonensisäinen veritulpan, patologisen T luokittelu, patologisen N luokittelu ja patologinen vaiheessa olivat riippumattomia ennustettaessa yhden muuttujan analyysiin, (tuloksia ei esitetty) .Vuonna monimuuttuja-analyysi, Beclin 1 ilme, suonensisäinen veritulpan, sivuston ja patologinen vaiheessa olivat merkittäviä itsenäisiä ennustetekijä for elinaika (taulukko 2).

keskustelu

Autophagy on itsestään hajoaminen mekanismi ja liittyy syövän etenemiseen. Beclin 1, nisäkkään ortologin hiiva Atg6, on ratkaiseva merkitys vesikkelin nukleaatioprosessista of autophagy [28]. Se on geeni välttämätön ensimmäiset vaiheet autophagy [29] - [30].

Nykyinen tutkimus on, ensimmäistä kertaa, osoitti Beclin 1 on säädelty sekä mRNA: ta ja proteiinia tasot kuusi mahasyöpä solulinjoja verrattuna normaaleissa mahan epiteelisoluissa GES-1. Olemme myös paljasti Beclin 1 ilmentyminen on kohonnut ensisijaisesti mahan kasvaimissa verrattuna neljän pariksi mahasyöpä näytteitä vieressä kasvaimia samasta potilaiden käänteistranskriptio-PCR: llä ja western-blottauksella. Tulokset eroavat raportoitu maksan syöpäsoluja ja kohdunkaulan syövän soluja, jotka osoittivat Beclin 1 ilme merkittävästi pienempi verrattuna vastaavaan normaaleissa kudoksissa [31], [32]. Mahdollinen explaination on, että beclin-1 ilmentymisen syöpien edistää induktion autophagic solukuoleman, jolloin saadaan selektiivinen paine ohittaa solukuoleman aikana kehityksen syöpä [27], [33].

Esillä olevassa tutkimuksessa havaitsimme, että 229 (84,5%) potilaista oli korkea ekspressio Beclin 1 271 mahasyöpäpotilaista mukaisesti toteamukseen edellisen tutkimuksen Ahn et al.Their tiedot eivät osoittaneet tai erittäin heikkoa ilmentymistä Beclin1 normaaleissa limakalvoilta vatsa immunohistokemiallisesti [27]. Kuitenkin, ne eivät tutkia beclin-1-ilmentymisen mRNA-tasolla solulinjoissa, eikä tutkia sen roolia ennusteeseen.

analysoidaan suhdetta ilmentymisen beclin-1 ja kliiniset ominaisuudet potilaiden . Ei ollut mitään merkittävää korrelaatiota ilmentymisen beclin-1 ja ikä, sukupuoli, T luokittelu, N luokittelu, tai vaiheessa potilailla, joilla on mahalaukun syöpä. Mielenkiintoista, meidän nykyinen tutkimuksessa oli merkittävä suhde ilmentymistä beclin-1 ja suonensisäisen veritulpan. Se viittaa siihen, että beclin-1 voidaan käyttää markkerina suonensisäisen veritulpan potilaiden imusolmukkeisiin mahasyöpä. Nämä havainnot korostavat tärkeää roolia beclin-1 kehittämisessä mahasyövän.

Lisäksi löysimme matala beclin-1 ilmentyminen oli voimakkaasti yhteydessä vähentynyt selviytymisen mahasyöpäpotilaista ( P
= 0,011) ja suonensisäisen veritulpan osajoukko ( P
= 0,017). Monimuuttuja-analyysi, Beclin-1 ilmentymisen säilytti itsenäisyytensä ennustetekijä ( P
= 0,044). Nämä tulokset viittaavat siihen mahdollisesti lupaava hyödyllisyyttä beclin-1 ennustetyövälineenä ja selviytymisen ilmaisin. Mekanismi ei ole vielä selvä. Vaihtoehtona selitys tälle voi olla, että beclin-1 ilmentymisen mahasyövistä rajoja kromosomi epävakautta ja vähentää taajuus lisämutaatio [34].

Tietääksemme tutkimus on ensimmäinen raportti, joka Beclin 1 oli huomattavasti korkeampi ilmentyminen mahasyövässä soluissa ja kudoksissa sekä mRNA ja proteiini tasoilla verrattuna niiden normaaliin kollegansa. Lisäksi löysimme korkeat beclin 1 ilmentyminen liittyi pidempi kokonaiselinaika. Sekä yhden muuttujan analyysiin, ja monimuuttuja-analyysi osoitti Beclin 1 ilme, sivusto, suonensisäinen veritulpan ja patologinen vaiheessa olivat riippumattomia ennustavat tekijät. Tulokset viittaavat vahvasti siihen, että Beclin 1 on mahdollinen rooli kasvainten synnyssä mahasyövän. Se voisi olla lupaava biomarkkereiden ja uusi hoitostrategioita potilaille, joilla imusolmuke-positiivisen mahasyövän. Lisätutkimuksia tarvitaan myös selvittämään mekanismia, jolla autophagy näyttelijä Beclin 1 on mukana kehittämässä ja etenemisen mahasyövän.

• PLoS ONE: vuorovaikutus GSTP1 Val alleeli helikobakteeri-infektion, tupakointi ja alkoholin kulutus ja mahalaukun syövän riski keskuudessa Kiinan Population
• PLoS ONE: luontaisen immuniteetin ja Non-Hodgkinin lymfooma (NHL) Vastaavat Geenit Sisäkkäisistä tapauskontrollitutkimuksessa mahasyövän riski