PLoS ONE: Регулирование RKIP функции по Helicobacter Pylori в желудочном раке

Абстрактный

Helicobacter Pylori (H.)
является грамотрицательная, спиралевидный бактерия, которая инфицирует более половины населения земного шара и является одной из основных причин аденокарциномы желудка , Механизмы, ссылающиеся H. Pylori
инфекции рака желудка не вполне понятны. В настоящем исследовании мы сообщаем, что белок ингибитор Raf-киназы (RKIP) играет определенную роль в индукции апоптоза H. пилори
в эпителиальных клеток желудка. Вестерн-блот и люциферазы транскрипции репортер анализы показывают, что патогенность остров H. пилори
быстро фосфорилирует RKIP, которая затем локализуется в ядро, где он активирует свою собственную транскрипцию и индуцирует апоптоз. Принудительный избыточная экспрессия RKIP усиливает апоптоз в H. пилори
-infected клетки, в то время как ингибирование RKIP РНК происходит подавление индукции апоптоза с помощью H. пилори
инфекции. В то время как индукции фосфорилирования RKIP, H. пилори
одновременно нацелен на нефосфорилированный RKIP деградации протеасом опосредованной. Увеличение RKIP транскрипции и фосфорилирования аннулирована мутирует RKIP серин 153 на валин, демонстрируя, что регулирование активности RKIP по H. пилори
зависит от S153 остатка RKIP в. Кроме того, H. Pylori
инфекция увеличивает экспрессию Snail, транскрипционный репрессор RKIP. Наши результаты свидетельствуют о том, что H. пилори
использует белок подавителя опухоли, RKIP, содействовать апоптоз в раковых клетках желудка
<р> Цитирование:. Моен EL, Вэнь S, T Анвар, кросс-Knorr S, Brilliant K, Бирнбаум F, и др , (2012) Регулирование RKIP функции от хеликобактерной
в желудочном раке. PLoS ONE 7 (5): e37819. DOI: 10.1371 /journal.pone.0037819
<р> Редактор: Yoshio Ямаока, делам ветеранов медицинский центр (111D), Соединенные Штаты Америки
<р> Поступило: 30 декабря 2011 года; Принято 24 апреля 2012 года; Опубликовано: 25 мая 2012
<р> Copyright: © 2012 Моэн и др. Это статья с открытым доступом распространяется в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution, которая позволяет неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе, при условии, что оригинальный автор и источник кредитуются

Финансирование:. Эта работа при поддержке Национального института общих медицинских наук Национального института здоровья в рамках премии номер P20GM103421 (DC); предыдущий сегмент этого проекта был поддержан Национальным центром исследовательских ресурсов (NCRR) под P20 RR 017695 (DC), R01 CA111533 (SFM) и R21 CA133601 (JMS). Доноры не играет никакой роли в дизайн исследования, сбора и анализа данных, решение о публикации или подготовки рукописи
<р> Конкурирующие интересы:.. Авторы заявили, что не существует никаких конкурирующих интересов

Введение
<р> рак желудка является четвертым наиболее часто диагностируется злокачественная опухоль в мире. В 2007 году около одного миллиона новых случаев рака желудка приводит к приблизительно 800 000 случаев смерти во всем мире было зафиксировано, что делает его второй наиболее распространенной причиной смерти от рака [1]. Рак желудка в настоящее время является седьмым по значимости причиной смерти от рака в США с примерно 21500 новых случаев, выявленных в 2011 году (http://www.cancer.gov/cancertopics/types/stomach). Грамотрицательные, в форме спиральной бактерией <ЕМ> Helicobacter Pylori (H.)
заражает более половины населения земного шара и была определена в качестве одного из основных факторов риска в желудочном канцерогенезе [2]. Всемирная организация здравоохранения и Международное агентство по изучению рака обозначив его как класс I канцерогена в 1994 году [3]. Наше нынешнее понимание H. Pylori
индуцированная канцерогенез является то, что бактерии и связанное с хроническим воспалительным ответом способствуют эпители желудка гибель клеток путем апоптоза [4], с последующим гипер-пролиферации [5], а также свободных радикалов [6], все из которых внести свой вклад в медленно и прогрессивная последовательность изменений в слизистой оболочке желудка, что в конечном счете, благоприятствующих прогрессии по отношению к раку. Эта модель согласуется с сообщениями, что полиморфизм провоспалительных генов цитокинов, которые увеличивают интенсивность воспалительной реакции связаны с повышенным риском развития рака желудка [7].

H. пилори
тесно прилипает к эпителиальных клеток желудка и может вызывать апоптоз непосредственно [8]. CAG (цитотоксический ассоциированный ген) острова патогенности (CAG PAI) из H. пилори
представляет собой 40 кБ сегмент ДНК, который содержит гены, кодирующие компоненты системы бактериальной секреции типа IV [9]. В пределах этой области является CaGa
ген, который кодирует CagA, иммунодоминантный белок 121-145 кДа [9]. H. Pylori
штаммы, обладающие и выражающие CAG PAI чаще связаны с язвенной болезнью и раком желудка в западных популяциях, чем штаммы, которые не [9]. После его введения через систему секреции IV типа в принимающих эпителиальных клеток желудка, CagA может впоследствии стать фосфорилируется Src-семейства тирозинкиназ на С-конце [10], что приводит CagA связывать и активировать SHP2 и сигнал через ERK [11]. Важно отметить, что CagA также отвечает за активацию преобразователя сигнала и активатор транскрипции 3 (STAT3) в пробирке
и В естественных условиях
[12], хотя это может быть не обязательно зависит от CagA фосфорилирования [11]
<р> STAT белки конститутивно выражены в нескольких новообразований, в том числе желудка, молочной железы, головы и шеи, а также рака предстательной железы [13] - [16].. Upon фосфорилирования тирозина 705 остатка и ацетилирования лизина 685, STAT3 димеризуется и проникает в ядро, где он функционирует в транскрипционно регулируют широкий спектр генов [17], [18]. Конститутивной активации белка STAT3 было показано, чтобы предотвратить апоптоз и увеличить клеточную пролиферацию и метастазирование в ряде видов рака, в том числе рака желудка [19], [20].
<Р> Одним из признаков прогрессирования опухоли желудка является приобретение более инвазивных и мигрирующих фенотипов в течение эпителиально-мезенхимальных перехода (EMT). Во время EMT, эпителиальных клеток желудка претерпевают фенотипические изменения, характеризуемые потерей молекул клеточной адгезии, в частности, эпителиальный кадгерин (Е-кадгерина) [21]. Фактор транскрипции Улитка, цинк-палец белок, был охарактеризован ранее в качестве важного регулятора EMT из-за его активации через ядерный фактор каппа бета (NF-кБ) [22] и последующей репрессии Е-кадгерина в эпителиальных опухолевых клеток [ ,,,0],23], [24]. Кроме того, исследования с использованием коэффициента усиления из-функции и с потерей функции подходы выявили улитка как репрессор транскрипции RKIP в метастатических клетках рака простаты [25].
<Р> RKIP является членом фосфатидилэтаноламина-связывающего белка семья и негативным регулятором ERK1 /2 (внеклеточной регулируемой киназы) [26], NF-кБ [27] и ГРК (G-белком рецептор киназы) [28] путей. RKIP, таким образом, играет важную роль в регуляции выживаемости клеток и апоптоз, в дополнение к усиливать эффективность химиотерапевтических агентов [29]. RKIP также был идентифицирован как метастазирование белка-супрессора [30], и в желудочных больных аденокарциномы существует положительная корреляция между экспрессией RKIP и выживаемости пациентов и обратной корреляции между выражением RKIP и STAT3 [19]. RKIP экспрессия и функция может регулироваться посттрансляционных модификаций. Например, фосфорилирование RKIP протеинкиназы C по серину-153 предотвращает способность RKIP к связыванию с его молекулой-мишенью, таким образом дезактивирующих функцию RKIP [31]. Кроме того, RKIP репрессии с помощью метилирования промотора можно преодолеть путем метилирования гистонов и ингибиторов деацетилаз [25].
<Р> Из важных ролей RKIP, STAT3 и H. пилори
в патогенезе рака желудка, мы исследовали, может ли H. пилори
сигналы через RKIP. Наши исследования показывают, что сложное взаимодействие между H. Pylori в cagPAI
, RKIP, STAT3 и Snail действует на dysregulate эпители желудка апоптоз клеток путем модулирования функции RKIP, механизм, который определяет центральную роль в RKIP H. Pylori
-associated желудка канцерогенез.

Материалы и методы

Реактивы
<р> Все реагенты и химикаты были приобретены у компании Sigma Chemical Co. (St. Louis, МО), если не указано иное. MG-132 был приобретен у фирмы Calbiochem (Gibbstown, NJ), растворенный в ДМСО и использовали при концентрации 10 мМ. Интерлейкин-6 (ИЛ-6) был приобретен у фирмы BD Biosciences (San Diego, CA). Количественную оценку белка реагенты получали из Bio-Rad Laboratories, Inc. (Hercules, CA). Усиленной хемилюминесценции реагентов и вторичные мыши и кролика с пероксидазой хрена, конъюгированным для Вестерн-блот-анализа были от компании GE Healthcare (Piscataway, NJ). Актин-HRP, фосфорилируется-RKIP (pRKIP) и STAT3 антитела были приобретены у Santa Cruz Biothechnology (Santa Cruz, CA). Антитела к STAT3 pS727 и pY705 и ППА были приобретены у Cell Signaling Technology (Beverly, MA) и антитела к RKIP из Millipore, Billerica, MA. Антитела к Snail был приобретен у Abcam (Cambridge, MA).

Клетки и Плазмиды
<р> желудка человека линию клеток карциномы АГС (CRL-1739) был приобретен у American Type Culture Collection (Manasas В.А.). MKN28 клетки были пожертвованы доктором Ричардом Пиком, Университет Вандербильта, Нэшвилл, штат Теннесси, и первоначально были приобретены у компании Riken Cell Bank, Ибараки, Япония. Плазмиды экспрессии для pcDNA3, с-Мус STAT3, ЦМВ-HA-RKIP (HA-RKIP) и ЦМВ-HA пустой вектор (EV) были описаны [18], [26]. Плазмиду RKIP S153V была предоставлена ​​доктором Марша Рознера, Университет Чикаго, Чикаго, штат Иллинойс.

H. пилори
Штаммы и условия культивирования
<р> дикого типа H. Pylori
штаммы или изогенная H. пилори
мутанты культивировали совместно с АГС или линий клеток желудка MKN, как описано ранее [32] при множественности инфекции (MOI) от 100:1 во всем эксперименте, если не указано иное.

Трансфекция AGS клетки
<р> AGS клетки трансфицированы с использованием реагента плазмидной трансфекции GenJet (Signagen Laboratories, Gaithersburg, MD) в соответствии с протоколом производителя для 6-луночного формата пластины. Общие количества ДНК между 1 и 2 мкг трансфицировали на пробу. условия Трансфекция были оценены и оптимизированы с помощью анализа клеток, трансфецированных с белком зеленого флуоресцентного (GFP) -expressing RKIP плазмиды. Трансфекция были КПД последовательно в диапазоне от 75-85%.

Протеин Экстракция и вестерн-блот анализ
<р> Всего клеточные экстракты и субклеточных фракционирование были подготовлены и иммуноблоттинг, как описано ранее [29], [32 ]. Концентрации белка определяли с помощью ВСА Protein Assay (Thermo Scientific). Денситометрия Вестерн-блоттинга была выполнена в соответствии с протоколом, перечисленных на следующем сайте:. Http://lukemiller.org/journal/2007/~~HEAD=pobj

В реальном времени PCR
<р> Два мкг РНК превращают в кДНК с использованием первой цепи кДНК Синтез Kit RevertAid (Thermo Scientific). Количественная ПЦР в реальном времени проводили с использованием 2 × QIAgen QuantiFast SYBR Green I (Roche). Праймеры для Snail были вперед: AGCTCTCTGAGGCCAAGGATCT, обратный: TGTGGCTTCGGATGTGCAT и бета-актина: вперед: CTGGCACCACACCTTCTACAA, обратный: CAGCCTGGATAGCAACGTACA. Следующие характерные времена профиля были использованы в течение 40 циклов: начальной стадии при 95 ° С в течение 10 мин, а затем 95 ° С в течение 15 с и 60 ° С в течение 1 мин. Относительный уровень экспрессии был рассчитан с использованием метода 2-ΔΔCT, как описано ранее [33].

STAT3 и RKIP люциферазы АНАЛИЗЫ
<р> Клетки (2 × 10 5 клеток /лунку в 6-луночные планшеты) были трансфицированы с помощью 0,1 мкг (STAT3, RKIP) или 0,05 мкг (NF-кВ) репортерного плазмиды, содержащей либо STAT3 связывания СИЭ-фрагмента промоторной области гена мыши irf1 (p2xSIE-Люк) или промоторной области RKIP плюс указанные плазмиды, как описано ранее [18]. Примерно через 24 ч после трансфекции клетки обрабатывали указанным препаратом или заражены H. пилори
ночь или не лечить. Активность люциферазы в цитозоле надосадочной жидкости оценивали с использованием люциферазы анализа (Promega) и измеряли с помощью фотометра для оценки транскрипционной активности [18].

Апоптоз Assays
<р> Апоптоз количественно оценивали в отдельных анализах с помощью проточной цитометрии и фрагментации ДНК ELISA. Для проточной цитометрии, процент апоптотических клеток (суб-G <суб> О) определяли с помощью проточной цитометрии анализа Пропидиум йодида окрашенных клеток [29]. Цитоплазма фрагментации ДНК гистонов-ассоциированных измеряли с Cell Death Detection ELISA Plus комплект (Roche, Indianapolis, IN) в соответствии с инструкциями изготовителя.
<Р> цитоплазмы фрагментации ДНК гистонов-ассоциированных измеряли с Cell Death Detection ELISA Plus комплект (Roche, Indianapolis, IN) в соответствии с инструкциями изготовителя. Эксперименты повторяли 3 раза и выполняется в двух экземплярах.

Лентивирус-опосредованного Нокдаун RKIP

Лентивирус конструирует.
<Р> pLKO.1 Пуро-сопротивление лентивирусов построить RHS3979-97070798 и RHS3979-98492779 были приобретены у открытого Biosystems (Хантсвилл, Алабама). Конструкции содержали пуромицин маркер селекции и выращивали в Лурии бульоне, содержащем ампициллин при 37 ° С. Бульон центрифугировали при 10000 • <ЕМ> г
в течение 10 мин. и надосадочную жидкость выбрасывали. ДНК из гранул очищали с использованием набора QIAGEN плазмидной Plus Maxi.

Лентивирус производства.

упаковывающие клетки 293Т высевали в условиях низкой антибактериальной ростовой среде (DMEM, 10% прогретой инактивированной FBS, 0,1 × пенициллин /Strepomycin /глютамин). не Клетки инкубировали в течение 24 ч (37 ° С, 5% СО <суб> 2), или до тех пор, они были примерно ~ 70% сплошности. Средства массовой информации на упаковке клеток 293Т был заменен на носитель высокого роста, содержащий DMEM. Смесь трансфекцией плазмид, были получены следующим образом:. Упаковка плазмида (ΔVpr.89), конверт плазмиду (VSV-G), шпилька-pLKO.1 и пустой вектор
<р> Fugene трансфекция реагент готовили в среде DMEM, в соответствии инструкциям производителя. Вкратце, 3 Плазмиды добавляли по каплям к Fugene и DMEM и перемешивают. Затем смесь инкубировали в течение 20-30 мин. при комнатной температуре. Трансфекция Затем смесь осторожно добавляют к упаковочному клеток. Клетки инкубировали в течение приблизительно 18 ч. Трансфекция среду затем отбрасывают на следующее утро и заменены на средства массовой информации с высокими темпами роста. Клетки инкубировали в течение 24 ч. Лентивирус содержащий среду собирали containingand добавили дополнительные носители с высокими темпами роста. Клетки инкубировали в течение 24 ч и средства массовой информации собирают. Типичная коллекция была 2-3 временных точках. Все вирусные урожаи были объединены.

Лентивирус инфекция клеток AGS.
<Р> AGS клетки выращивали до приблизительно 50% слияния. Вирусные супернатанты были добавлены полибреном. Через двенадцать часов после инфицирования, вирусный носитель отбрасывали и замен ли вирусные медиа и инкубировали еще в течение 12 ч. СМИ была отброшена и заменена среде F12 Хама. Клетки инкубировали в течение 24 ч. Клетки были разделены на селективных средах, содержащих пуромицина и инкубировали в течение 24 ч.

Статистические методы
<р> Все эксперименты для культивирования клеток были повторены по крайней мере, 3 раза, если не указано иное, и в паре T- Тесты были использованы для определения статистической значимости.

Результаты

H. Pylori
Заражение Увеличивает фосфорилирования RKIP

RKIP ингибирует несколько путей выживания клеток, в том числе опосредовано через NF-кБ и Jak /STAT [22]. Для выяснения влияния H. Pylori
инфекции на RKIP в клетках желудка, AGS клетки инфицировали H. пилори
и собирают 2 ч и 6 ч позже. Как показано на рис. 1A, уровни фосфорилированного RKIP (pRKIP) были повышены через 2 ч (3,126 раза) и 6 ч (2,9 раза) после H. Pylori
инфекции, тогда как выражение общего белка RKIP увеличился в 1,4 раза через 2 ч и 1,75 раза через 6 ч Н. пилори
инфекции. Аналогичные результаты были получены также с MKN рака желудка клетки (рис S1).

H. пилори
Индуцированные Фосфорилирование RKIP является PKC-зависимой
<р> Фосфорилирование RKIP на серин 153 протеинкиназы С (ПКС) аннулирует свою способность связываться с Raf и ингибировать вниз по течению МАР-киназы сигнализации [31]. Мы исследовали, является ли фосфорилирование RKIP по H. пилори
был PKC-зависимым. клетки AGS были заражены H. пилори
в течение 6 часов, в присутствии или в отсутствие 40 мкМ бисиндолилмалеимида (Bis, ингибитор ПКС). Наши результаты указывают на то, что уровни фосфорилированного RKIP ингибируется в 3,9 раза и RKIP 1,36 раза после H. пилори
инфекции в присутствии ингибитора ПКС, предполагая, что RKIP фосфорилирования H. пилори
включает в себя, но не может быть полностью зависит от того, ПКС-регулируемого пути (рис. 1В).

ИЛ-6 индуцирует фосфорилирование RKIP и Н. pylori-
активирует STAT3
<р> Так как существует обратная связь между RKIP и экспрессии STAT3 в желудочном образцов рака [19], мы оценивали, влияет ли STAT3 и его ключевым регулятором IL-6 [17] выражение pRKIP. IL-6, лечение в дозе 25 или 50 нг /мл повышенные уровни pRKIP белка 1,8 и 1,35 раза, соответственно и общее выражение RKIP белка снизилось на 0,8 и увеличилась на 1,05 раза соответственно (фиг. 2А). Фосфорилирование RKIP в ответ на IL-6 был ПКС-зависимый (данные не показаны). Эти данные указывают на то, что IL-6 также может индуцировать фосфорилирование RKIP в клетках желудка, которые могут возникнуть, в частности, к PKC-зависимого пути.
<Р> Макрофаги освобождение цитокинов, в том числе IL-6 во время H. Pylori
инфекции [34] приводит к активации STAT3 [17]. Для того, чтобы исследовать эффекты H. пилори
инфекция на активации STAT3, AGS клетки трансфицированы с IRF-1 репортерной конструкции [18] и культивировали совместно с H. пилори
в указанном диапазоне множественности инфекции (MOI) в течение 24 ч. Наши результаты показали, что при MOI между 10-200:1, H. пилори
была способна индуцировать транскрипцию STAT3 (рис. 2в) и STAT3 pY705 фосфорилирование (рис. 2, б) в течение 6 ч инфекции. Затем мы определяли ли IL-6 также может стимулировать STAT3 транскрипции в клетках AGS. Клетки AGS были трансфицированы с IRF-1 и с EV и или с-Мус-меченый STAT3, а затем через 24 часов клетки обрабатывали либо IL-6 (50 нг /мл) или совместно культивировали с H. пилори
в МВД 100:1. Результаты, изображенный на рис. 2D, показывают, что ИЛ-6 (р &л; 0,0003) и Н. пилори
(р &л; 0,0005) были каждый из которых способен значительно стимулировать STAT3 транскрипцию, эффект, который был усилен, когда клетки AGS были трансфицированы STAT3 и инфицировали H. пилори
(р &л; 0,0000023). Усиление активации STAT3 была значительно увеличена, когда AGS клетки совместно обрабатывали IL-6 и Н. пилори
по сравнению с лечением IL-6 (р ≪ 0,000028) или H. пилори
(р &л; 0,0003). покое

фосфорилированные RKIP Индуцирует свой собственный Транскрипция
<р> Мы использовали люциферазы репортер анализа RKIP, чтобы исследовать эффекты H. пилори
инфекции на RKIP транскрипционной активности. H. Pylori
значительно увеличилось транскрипции RKIP (р &л; 0,002) с более чем 10-кратное увеличение, произошедшим с RKIP оверэкспрессии и больше, чем 16-кратное увеличение с комбинацией H. пилори
и RKIP (р &л; 0,0003) (рис 3А.) по сравнению с необработанными AGS клеток, трансфицированных пустым вектором. Был значительное увеличение (р &л; 0,0001) в RKIP транскрипции с H. Pylori
инфекции и RKIP избыточная экспрессия по сравнению с клетками, трансфицированных RKIP без инфекции (рис. 3А). Мы повторили эти эксперименты в присутствии бис для ингибирования активности PKC для определения увеличения RKIP транскрипции обусловлено фосфорилированием. В присутствии ингибитора ПКС, Н. пилори
увеличилась RKIP транскрипции и RKIP суперэкспрессия также привело к усилению RKIP активности промотора. Бис уменьшилась транскрипцию RKIP, вызванную RKIP оверэкспрессии и H. пилори
инфекция больше, чем в 4 раза, по сравнению с клетками, с использованием RKIP избыточной экспрессии и позволяет предположить, что эти эффекты зависели от RKIP фосфорилирования (рис. 3, а). Мы исследовали локализацию RKIP после H. пилори
инфекции. Иммуноблотинга субклеточных AGS клетки фракции показали, что pRKIP локализуется в ядре в то время как RKIP остается в основном в цитозоле после инфицирования (фиг. 3B). В совокупности эти данные указывают на то, что H. пилори
может способствовать транслокацию pRKIP в ядро, где она может активировать RKIP транскрипции.

H. Pylori
индуцированная RKIP Фосфорилирование Зависит от H. CAG Pylori профиль

• PLoS ONE: Запрограммированный Химиотерапия для пациентов с метастатическим неоперабельным рака желудка
• PLoS ONE: количественное измерение органических кислот в тканях больных раком желудка указывает на повышенный м…