Plos ONE: Ureditev RKIP funkcije s Helicobacter pylori v želodcu raku

Povzetek

Helicobacter pylori (H. pylori)
je gram-negativne,-spiralne oblike bakterije, ki okuži več kot polovico svetovnega prebivalstva in je glavni vzrok adenokarcinomom želodca . Mehanizmi, ki se povezujejo H. pylori
okužba želodca kancerogenosti niso dobro razumeli. V tej študiji smo poročajo, da ima protein inhibitor Raf-kinazo (RKIP) vlogo pri indukcijo apoptoze z H. pylori
v epitelijskih celic želodca. Western blot in luciferaza prepis reporter testi kažejo, da je patogenost otok H. pylori
hitro fosforilira RKIP, ki nato lokalizira v jedro, kjer se aktivira svojo transkripcijo in inducira apoptozo. Prisilno čezmernim RKIP spodbuja apoptozo v H. pylori
okuženimi celicami, ker zaviranje RKIP RNK zavira indukcijo apoptoze z H. pylori
okužbe. Medtem ko napeljati fosforilacijo RKIP, H. pylori
hkrati namenjen non-fosforiliran RKIP za-proteazomske posredovano degradacijo. Povečanje RKIP transkripcijo in fosforilacije se razveljavi s mutira RKIP serin 153 do valin, ki dokazuje, da je ureditev RKIP dejavnosti s H. pylori
je odvisna S153 ostanka RKIP je. Poleg tega H. pylori
okužba poveča ekspresijo Polž, transkripcijske represorju od RKIP. Naši rezultati kažejo, da je H. pylori
uporablja tumor dušenje protein, RKIP, spodbujajo apoptozo v želodčnih rakavih celic

Navedba. Moen EL, Wen S, Anwar T, Cross-Knorr S, Brilliant K, Birnbaum F, et al . (2012) Ureditev RKIP funkcije, ki jih Helicobacter pylori
želodčnega raka. PLoS ONE 7 (5): e37819. doi: 10,1371 /journal.pone.0037819

Urednik: Yoshio Yamaoka, veteranov zadeve Medical Center (111D), Združene države Amerike

Prejeto: 30. december 2011; Sprejeto: 24. april, 2012; Objavljeno: 25. maj 2012

Copyright: © 2012 Moen et al. To je odprtega dostopa članek razširja pod pogoji Creative Commons Attribution License, ki omogoča neomejeno uporabo, distribucijo in razmnoževanje v katerem koli mediju, pod pogojem, da prvotni avtor in vir knjižijo

Financiranje:. To delo je bila podprta z nacionalnega inštituta za splošne medicinske vede National Institutes of Health pod Award Število P20GM103421 (DC); prejšnji segment tega projekta je bila podprta z Nacionalnega centra za raziskovalne vire (NCRR) pod P20 RR 017.695 (DC), R01 CA111533 (SFM) in R21 CA133601 (JMS). Med financerji imel nobene vloge pri oblikovanju študije, zbiranje in analizo podatkov, sklep, da se objavi, ali pripravi rokopisa

nasprotujočimi si interesi.. Avtorji so izjavili, da ne obstajajo konkurenčni interesi

Uvod

rak želodca je četrti najpogosteje diagnosticiran malignosti na svetu. Leta 2007 je približno milijon novih primerov raka želodca vodi po vsem svetu zabeležili približno 800.000 smrtnih žrtev, kar je drugi najpogostejši vzrok smrti zaradi raka [1]. Rak želodca je trenutno sedmi najpogostejši vzrok smrti zaradi raka v ZDA, s približno 21.500 novih primerov diagnosticiranih v letu 2011 (http://www.cancer.gov/cancertopics/types/stomach). Gram-negativne, spiralne oblike bakterije Helicobacter pylori (H. pylori)
okuži več kot polovico svetovnega prebivalstva in so bile opredeljene kot pomemben dejavnik tveganja pri rakotvornosti želodca [2]. Svetovna zdravstvena organizacija in Mednarodna agencija za raziskovanje raka je določena kot razred I rakotvorne snovi leta 1994 [3]. Naše sedanje razumevanje H. pylori
inducirano nastanek raka je, da je bakterija in povezana kronični vnetni odziv spodbuja želodčne epitelijskih celic smrt apoptoze [4], z naknadnim hiper orožja [5], in prostih radikalov proizvodnjo [6], kar vse prispeva k počasno in postopno zaporedje sprememb v želodčne sluznice, ki na koncu podpirajo napredovanje proti raku. Ta model je v skladu s poročili, da so pro-vnetnih citokinov genskih polimorfizmov, ki povečujejo intenzivnost vnetnega odziva, povezanih s povečanim tveganjem za raka želodca [7].

H. pylori
natančno upošteva epitelijskih celic želodca in lahko povzroči apoptozo neposredno [8]. OAS (gen-citotoksična povezano) patogenost otok (OAS PAI) za H. pylori
je 40 kB segment DNA, ki vsebuje gene, ki kodira za sestavne dele tipa IV bakterijske sistemu izločanja [9]. Znotraj te regije je cagA
gen, ki kodira CagA, je imunodominantnih protein 121-145 kDa [9]. H. pylori
sevi, ki imajo in izražajo OAS Pai pogosteje povezana z peptičnega in raka želodca v zahodnih populacijah kot sevi, ki ne [9]. Po vbrizgavanje preko IV sistemu izločanja tipa v želodcu epitelijskih celic gostiteljic, lahko CagA kasneje postane fosforilirajo Src-družine tirozin kinaz na njenem C-terminalnem [10], kar CagA za vezavo in aktiviranje SHP2 in signal preko ERK [11]. Pomembno je, da CagA je odgovoren tudi za aktiviranje pretvornik signala in aktivator transkripcije 3 (stat3) in vitro
in in vivo
[12], čeprav to ni nujno odvisno od CagA fosforilacijo [11]

STAT beljakovine konstitutivno izražen v različnih novotvorb, vključno želodca, dojke, glave in vratu, in prostati [13] -. [16]. Ob fosforilacijo tirozina 705 ostanka in acetilacije na lizin 685, stat3 dimerizes in vstopi v jedro, kjer njegovega delovanja, da transkripcijsko urediti široko paleto genov [17], [18]. Konstitutivna aktivacija stat3 proteina Dokazano je, da se prepreči apoptozo in poveča celično proliferacijo in metastaz v številnih raka, vključno z rakom želodca [19], [20].

Ena od značilnosti želodca napredovanja tumorja je pridobitev agresivnejše in selitvenih fenotipov med epitelijske-mezenhimskih prehoda (EMT). Med EMT, želodčni epitelne celice podvržene fenotipske spremembe, označen z izgubo celičnih adhezijskih molekul, zlasti epitelnih kadherina (E-kadherina) [21]. transkripcijski faktor Polž, cink-prst protein, je bila prej označena kot pomemben regulator EMT zaradi aktiviranja preko jedrsko faktorja kappa Beta (NF-kB) [22] in naknadno represijo E-kadherina v epitelnih tumorskih celicah [ ,,,0],23], [24]. Poleg tega študije z uporabo dobiček-of-funkcijo in izguba-of-funkcijo pristopi bile ugotovljene Polž kot represorju za RKIP prepisu v metastatskim rakom prostate celic [25].

RKIP je član fosfatidiletanolamina veže beljakovine družina in negativni regulator ERK1 /2 (zunajcelično signala urejenemu Kinase) [26], NF-kB [27] in GRK (G-proteinom sklopljenega receptorja kinaze) [28] poti. RKIP tem igra pomembno vlogo pri uravnavanju preživetja celic in apoptozo, poleg potenciranje učinkovitost kemoterapevtikov [29]. RKIP je bilo tudi opredeljeno kot metastaze supresor proteina [30], in pri bolnikih, ki adenokarcinomom želodca obstaja pozitivna korelacija med RKIP izražanja in preživetje bolnikov in inverzno povezavo med izražanjem RKIP in stat3 [19]. RKIP izražanje in funkcijo lahko ureja post-translacijskih modifikacij. Na primer, fosforilacije RKIP ga protein-kinaze C pri serin-153 preprečuje možnost RKIP, da se veže na njegovo tarčno molekulo, s čimer inaktivaciji funkcijo RKIP [31]. Poleg tega lahko RKIP represija preko promotorja metilacije je treba premagati metilacije in histonskih zaviralcev deacetilaze [25].

Zaradi pomembnih vlog RKIP, stat3 in H. pylori
v patogenezi raka želodca, smo raziskovali, ali H. pylori
signale skozi RKIP. Naše raziskave kažejo, da kompleksno interakcijo med H. pylori je cagPAI
, RKIP, stat3 in polž deluje na dysregulate želodčne epitelijskih celic, apoptozo s spreminjanjem funkcije RKIP, mehanizem, ki določa osrednjo vlogo RKIP v H. pylori
-associated želodca nastanek raka.

Materiali in metode

Reagenti

Vsi reagenti in kemikalije so bili kupljeni od Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO), razen če če ni drugače navedeno. MG-132 smo kupili iz Calbiochem (Gibbstown, NJ), raztopljenega v DMSO in se uporablja pri koncentraciji 10 mM. Interlevkin-6 (IL-6) je bila kupljena iz BD Biosciences (San Diego, CA). Proteinske kvantifikacije reagenti so bili pridobljeni iz Bio-Rad Laboratories, Inc. (Hercules, CA). Izboljšane Kemiluminescenca reagenti in sekundarni miške in zajec hren peroksidazo konjugiranih za Western blot analizo je bilo iz podjetja GE Healthcare (Piscataway, NJ). Aktina-HRP, fosforilirata-RKIP (pRKIP) in stat3 protitelesa so bili kupljeni od Santa Cruz Biothechnology (Santa Cruz, CA). Protitelesa v stat3 pS727 in pY705 in PARP so bili kupljeni od signalizacijo med celicami tehnologijo (Beverly, MA) in protitelesa za RKIP iz Millipore, Billerici mag. Protitelo Polž je bila kupljena od Abcam (Cambridge, MA).

celice in plazmidi

Človeško želodčni rak celične linije AGS (CRL-1739) je bila kupljena od American Type Culture Collection (Manasas , VA). MKN28 celice so prispevali dr Richard Peek, Vanderbilt University, Nashville, TN in so bili kupljeni od Riken Cell banke, Ibaraki, Japonska. Ekspresijski plazmidi za pcDNA3, c-myc stat3, CMV-HA-RKIP (HA-RKIP) in CMV-HA prazno vektor (EV) so bili opisani [18], [26]. RKIP S153V plazmid je zagotovil dr Marsha Rosner, University of Chicago, Chicago, IL.

H. pylori
Sevi in ​​Kultura vpliva

Divji tip H. pylori
sevov ali izogenimi H. pylori
mutanti so co-kultiviramo z AGS ali podjetja MKN želodca celičnih linij, kot je opisano prej [32] na množico okužbe (MNZ) v 100:1 v vseh poskusu, če ni navedeno drugače.

Transfekcija AGS celice
so

AGS celice začasno transfektirane z GenJet plazmida transfekcije reagenta (Signagen Laboratories, Gaithersburg, MD) po protokolu proizvajalca za 6-kanalne format tablice. Skupne količine DNA med 1 in 2 ug smo transfektirali na vzorec. so bili ocenjeni in optimizirana z analizo celic, transfektiranih z zeleni fluorescentni protein (GFP) -izražanje RKIP plazmida transfekciji pogoji. Transfekcijske učinkovitosti so bile dosledno v območju od 75-85%.

Beljakovine Pridobivanje in Western Blot Analiza

Skupaj ekstrakti celic in subceličnih fractionations smo pripravili in immunoblotted [29], [32, kot je predhodno opisano ]. koncentracije proteina smo se izračuna z uporabo BCA beljakovin testom (Thermo Scientific). Denzitometrija zahodnih blot analiz je bila izvedena v skladu s protokolom, navedene na naslednji spletni strani:. Http://lukemiller.org/journal/2007/~~HEAD=pobj

Realtime PCR

Dve ig RNA smo pretvorili v cDNA uporabo RevertAid First-Strand cDNA Synthesis Kit (Thermo Scientific). Kvantitativni PCR v realnem času je bila izvedena z 2 × Qiagen QuantiFast SYBR Green I (Roche). Primerji za Polž so naprej: AGCTCTCTGAGGCCAAGGATCT, vzvratno: TGTGGCTTCGGATGTGCAT in beta-aktin: naprej: CTGGCACCACACCTTCTACAA, vzvratno: CAGCCTGGATAGCAACGTACA. Naslednji tipični časi profilov so bile določene za 40 ciklov: prvi korak pri 95 ° C za 10 minut, čemur sledi 95 ° C 15 sekund in 60 ° C 1 min. Relativni nivo izražanja je bila izračunana po metodi 2-ΔΔCT kot je opisano prej [33].

stat3 in RKIP luciferazni Reporter testi

Cells (2 x 10 ^{5 celic /dobro 6-jamicami) smo prehodno transfektirali z 0,1 mikrogramov (stat3, RKIP) ali 0,05 mikrogramov (NF-kB) reporterskega plazmida, ki vsebuje bodisi stat3 vezavo prikaže-fragment promotorski regiji gena pri miših IRF1 (p2xSIE Luc) ali RKIP promotorska regija plus indicirano plazmidov kot je opisano predhodno [18]. Približno 24 ur po transfekciji smo celice obdelali z navedeno zdravilo ali okužene z H. pylori
čez noč ali ne zdravimo. Aktivnost luciferaze v citosolnega supernatanta smo ovrednotili s luciferazni Reporter testom (Promega) in merjen z luminometer za ocenjevanje transkripcijski dejavnost [18].}

apoptoze Testi

Apoptoza je količinsko v ločenem testih s citometrija tok in razdrobljenost DNA ELISA. Za pretočno citometrijo, odstotek apoptotskih celic (sub-G _{O) smo določili z analizo s pretočno citometrijo propidium jodidom obarvane celic [29]. Citoplazme-histon povezana razdrobljenost DNA smo merili z Cell Death Detection ELISA Plus kit (Roche, Indianapolis, IN) v skladu z navodili proizvajalca.}

citoplazme-histon povezana razdrobljenost DNA smo merili z Cell Death Detection ELISA Plus komplet (Roche, Indianapolis, IN) v skladu z navodili proizvajalca. Poskuse smo ponovili 3-krat in izvaja v dveh izvodih.

lentivirusom posredovano rasklapanje od RKIP

lentivirusom konstrukti.

pLKO.1 puro odpornost lentivirusni konstrukt RHS3979-97070798 in RHS3979-98492779 so bile kupljene od odprte Biosystems (Huntsville, AL). Konstrukti vsebovali puromicin selekcijski marker in gojimo v Luria brozge, ki vsebuje ampicilin pri 37 ° C. Brozgo smo centrifugirali pri 10.000-kratni povečavi g
10 minut. in supernatant zavrgli. DNA iz pelet smo očistili z QIAGEN plazmida Plus Maxi Kit.

lentivirusom proizvodnje.

293T pakiranje celice smo posejali v nizko antibiotika rastni medij (DMEM, 10% toplote, inaktivirano FBS, 0,1 x Penicilin /Strepomycin /glutamin). Celice inkubiramo 24 ur (37 ° C, 5% CO _{2), oziroma dokler niso približno ~70% konfluentnih. Mediji za pakiranje celic 293T je bil nadomeščen z mediji visoka rast vsebuje DMEM. Zmes transfekcijskih plazmidov smo pripravili takole:. Embalaža plazmida (ΔVpr.89), ovojnica plazmid (VSV-G), Ostra-pLKO.1 in prazni vektor}

FUGENE transfekciji reagent smo pripravili v DMEM skladu z navodili proizvajalca. Na kratko, so 3 plazmidov po kapljicah dodali k FUGENE in DMEM in zmešamo. Zmes nato pustimo, da inkubiramo 20-30 min. pri sobni temperaturi. Mešanica transfekciji smo nato previdno dodali pakiranje celice. Celice inkubiramo približno 18 ur. Transfekcijski mediji smo nato zavržemo naslednje jutro in jo nadomestiti z visoko rastnih medijev. Celice inkubiramo 24 ur. Lentivirusom vsebuje mediji so pospravili containingand dodatno medijsko visoko rast dodane. Celice inkubiramo 24 ur in mediji pridelani. Tipična zbirka je za 2-3 časovnih točkah. Vse virusne žetve smo združili.

okužba lentivirusom od AGS celic.

AGS celice zrasla na približno 50% sotočju. Virusni Supernatante smo dodali polybrene. Dvanajst ur po infekciji smo virusno mediji zavreči in jo nadomestiti z virusnimi medijem in inkubirali dodatnih 12 ur. Mediji smo zavrgli in nadomestili z Ham je F12 medij. Celice inkubiramo 24 ur. Celice smo razdelili v izbirnih medijev, ki vsebujejo od puromicin in pustimo inkubirati 24 ur.

Statistične metode

Vse celične kulture poskuse smo ponovili vsaj 3-krat, razen če ni drugače navedeno, in paru t- testi so bili uporabljeni za ugotavljanje statistične značilnosti.

Rezultati

H. pylori
Okužba Poveča fosforilacije RKIP

RKIP zavira več poti preživetja celic, vključno s tistimi, posredovano preko NF-kB in Jak /STAT [22]. Za pojasnitev učinek H. pylori
okužbe na RKIP v želodčnih celic, so AGS celice okužene z H. pylori
in pospravljajo 2 h in 6 ur kasneje. Kot je prikazano na sliki. 1A, so nivoji fosforiliranega RKIP (pRKIP) povišana po 2 urah (3,126-krat) in 6 ur (2,9-kratnik) po H. pylori
okužba ker izražanja skupno RKIP beljakovin povečala za 1,4-krat po 2 uri in 1,75-krat po 6 h H. pylori
okužbe. Podobne rezultate smo dobili tudi podjetja MKN raka želodca celic (glej sliko S1).

H. pylori
povzročena Fosforilacija RKIP je PKC odvisna od

fosforilacijo RKIP na serin 153, ki ga protein kinaze C (PKC) razveljavi svojo sposobnost, da se veže na Raf in zavira nadaljnjega MAP kinaze signalizacije [31]. Preverili smo, ali fosforilacijo RKIP s H. pylori
je PKC-odvisna. AGS celice so bile okužene z H. pylori
6 ur, v prisotnosti ali odsotnosti 40 uM bisindolylmaleimide (Bis, inhibitor PKC). Naši rezultati kažejo, da je bila raven fosforiliranega RKIP zaviral 3,9-krat in RKIP 1,36-krat po H. pylori
okužbo v prisotnosti inhibitorja PKC, kar kaže, da RKIP fosforilacijo s H. pylori
vključuje, vendar ne sme biti popolnoma odvisna, the-PKC urejena pot (sl. 1B).

IL-6 inducira Fosforilacija RKIP in H. pylori-
aktivira stat3

Ker je v obratnem sorazmerju RKIP in stat3 izražanja v želodcu raka vzorcev [19], smo ocenili, ali stat3 in njegov glavni regulator IL-6 [17] vpliva pRKIP izraz. IL-6 zdravljenje z odmerkom 25 ali 50 ng /ml zviša raven pRKIP proteina 1,8 in 1,35 krat, v tem zaporedju in skupnega izražanja RKIP proteina zmanjšal 0,8 in povečano 1,05 krat, oziroma (sl. 2A). Fosforilacijo RKIP v odzivu na IL-6 je PKC odvisna od (podatki niso prikazani). Ti podatki kažejo, da se lahko IL-6 povzroči tudi fosforilacije RKIP v želodčnih celic, ki se lahko pojavijo, v delu, v PKC odvisna od poti.

citokini izpustih makrofagov, vključno z IL-6 med H. pylori
okužba [34], ki vodi do aktivacije stat3 [17]. Da bi raziskali učinke H. pylori
okužbe o aktiviranju stat3 so AGS celice začasno transfekciji s IRF-1 reporter konstrukt z [18] in co-kultivirani s H. pylori
na navedenem območju multipliciteto infekcij (MOI) za 24 h. Naši rezultati so pokazali, da pri MOI med 10-200:1, H. pylori
bil sposoben izzvati stat3 transkripcijo (sl. 2C) in stat3 pY705 fosforilacijo (sl. 2B) v 6 urah okužbe. Mi poleg ugotoviti, ali bi lahko IL-6 spodbudila tudi stat3 prepisu v AGS celicah. AGS celice so bile prehodno transficirane z IRF-1 in EV in ali c-myc, označeni stat3 in nato po 24 h celic tretiranih bodisi IL-6 (50 ng /ml) ali co-kultivirane z H. pylori
na MOI 100:1. Rezultati, je prikazano na sliki. 2D, kažejo, da IL-6 (p < 0,0003) in H. pylori
(p < 0,0005) sta vsak lahko znatno stimulira stat3 transkripcije, učinek, ki je okrepljen, ko so AGS celice transficirane z stat3 okužene z H. pylori
(p < 0,0000023). Okrepitev aktivacije stat3 se je bistveno povečala, ko so bili AGS celice sočasno zdraviti z IL-6 in H. pylori
v primerjavi z zdravljenjem z IL-6 (p < 0,000028) ali H. pylori
(p < 0,0003). sam

fosforilirata RKIP inducira lastno Transcription

smo uporabili RKIP luciferaza novinar test za raziskavo učinkov H. pylori
okužbe na RKIP transkripcijske aktivnosti. H. pylori
znatno povečal RKIP transkripcije (p < 0,002) z več kot 10-kratno povečanje nastal z RKIP prekomerno in več kot 16-kratno povečanje s kombinacijo H. pylori
in RKIP (p < 0,0003) (slika 3A.) v primerjavi z nezdravljenimi AGS celice transficirane s praznim vektor. Prišlo je do znatnega povečanja (p < 0,0001) v RKIP prepisu s H. pylori
okužba in RKIP prekomerno primerjavi s celic, transfektiranih s RKIP brez okužbe (sl. 3A). ponovili smo te eksperimente v prisotnosti bis da inhibira PKC aktivnosti za določitev povečanja RKIP transkripcije je posledica fosforilacije. V prisotnosti inhibitorja PKC, H. pylori PODJETJA
povečala RKIP prepis in RKIP prekomerno vplivale tudi na izboljšanje RKIP promotorja dejavnosti. Bis zmanjšala RKIP transkripcijo s RKIP prekomerno in H inducirano. pylori
okužbe večja kot 4-krat, v primerjavi s celicami iz z RKIP prekomerno in kaže, da so ti učinki odvisni RKIP fosfatnem (sl. 3A). Proučili smo lokalizacijo RKIP po H. pylori
okužbe. Imuno subceličnih AGS celic frakcije so pokazale, da je pRKIP lokalizirana v jedro medtem RKIP ostaja pretežno v citosolu po okužbi (sl. 3B). Skupaj, ti podatki kažejo, da je H. pylori
lahko spodbujajo translokacijo pRKIP v jedro, kjer se lahko aktivira RKIP transkripcijo.

H. pylori
inducirano RKIP fosforilacije Odvisno H. pylori je OAS
Patogenost Island in RKIP Serinske 153

Da bi ocenili vlogo specifične H. pylori
dejavniki v fosforilacijo RKIP, divje vrste H. pylori
in izogenimi mutanti brez celotno CAG PAI ali
oipA
gen so co-gojili z AGS celic za 6 ur. H. pylori
mutant brez OAS PAI
mogla izzvati RKIP fosforilacijo, ker je tip madež divji in oipA
mutant močno povzroča RKIP fosforilacije (sl. 4A). Enak trend je opaziti na stat3 pY705. Ti rezultati kažejo, da geni v H.
cagPAI pylori so potrebni za indukcijo RKIP in stat3 fosforilacije.

Da bi raziskali, če mutacija serin 153 vpliva na H. pylori
pogojenega RKIP fosforilacije in transkripcijskim aktivacijskim, AGS celice smo prehodno transfektirali z RKIP gradnjo, v kateri je serinski nadomeščen z valinom na mestu 153 (S153V) in nato co-kultivirane z H. pylori
. Še enkrat smo opazili večji od 16-kratno povečanje aktivnosti RKIP promotorja v celicah z RKIP prekomerno in H. pylori
okužba (p < 0,0005). Vendar pa v celicah transfektirana z RKIP S153V pred H. v primerjavi z H; pylori
okužba, je bil 2,5-kratno zmanjšanje transkripcijske aktivnosti (0,0003 p <). pylori
okužba v divjega tipa RKIP prekomerno ekspresijo celic (sl. 4C). Poleg tega čezmernim S153V RKIP zaviral H. pylori
pogojenega RKIP fosforilacija (sl. 4B). Vzeta skupaj, ti rezultati kažejo, da je fosforilacije in transkripcijske aktivacije RKIP odvisna H. pylori je
cagPAI in tudi od fosforilacije RKIP na S153.

H. pylori
Infection Rezultati v RKIP degradacije in Indukcija Polž

Ker je povečala RKIP prepis jih povzroča H. pylori
okužba ni bila povezana s povečanim stanju dinamičnega ravnovesja izražanja skupno RKIP beljakovin, smo pregledali, ali H. pylori
lahko hkrati poveča hitrost razgradnje RKIP proteina skozi proteazomske posredovano degradacijo, kot je bilo že predlagano [35]. MG132 povišane ravni RKIP beljakovin v prisotnosti ali odsotnosti H. pylori
okužbe, v skladu s H. pylori
večjo degradacijo proteasomal RKIP (sl. 5A).

Še en mehanizem, ki lahko predstavljajo za pomanjkanje sprememb v RKIP beljakovin ali ekspresijo mRNA bi transkripcijski zatiranje RKIP po H. pylori
okužbe. Polž je transkripcijski faktor, ki igra pomembno vlogo pri EMT [23], pa tudi kot je znano transkripcijski represorju za RKIP pri rakavih celic prostate [25]. Da bi raziskali učinke H. pylori
okužbe na izražanje Polž in RKIP so AGS celice co-gojili z H. pylori
je bila močno inducirano po 2-4 urah okužbe (sl. 5D) Western analiza blot je navedeno, da je H na MOI 100. Polž mRNA izražanja. pylori
okužba povzročila čas in odmerka odvisnega povečanja ravni polž beljakovin (sl. 5B /C). Ta rezultat ni v skladu z našimi podatki o RKIP transkripcijo po H. pylori
okužbe (sl. 3) in predlaga, da se H. pylori
okužba lahko v indukcijo beljakovin (-e), ki bi se odpravi učinek Polž na RKIP prepisu. Mi smo trenutno preučuje možnost, da z analizo, masno spektrometrijo z uporabo starševski in RKIP rasklapanje celice (sl. 6).

RKIP Izboljša H. pylori
pogojenega Apoptoza

H. pylori
povzroča želodčne epitelne apoptozo celic [8]. Ker lahko RKIP spodbuja apoptozo [29], smo pregledali, če je indukcija pRKIP po H. pylori
okužba, bi lahko bil odgovoren za H. pylori
inducirano apoptozo. AGS celice so bile prehodno transfekciji s RKIP ali praznim vektorjem, okuženih s H. pylori
16 ur in apoptozo, ovrednotenih po PARP cepitvijo pretočno citometrijo in razdrobljenost DNA. V nekaterih poskusih RKIP je inhibira lentivirusom posredovano RKIP rasklapanje. Kot je prikazano na sliki. 6A, H
. pylori
povzroča cepljenje PARP, učinek, ki se je povečala za zunajmaternične izražanje RKIP. Citometrija analiza je pokazala, da H. pylori
infekcija povzročila približno 4-kratno povečanje apoptoze (p < 0,0008), RKIP prekomerno, s 3-kratno povečanje (p < 0,003) in kombinacija 6-kratno povečanje (p lt; 0,0005) v primerjavi s neobdelane AGS celice (sl. 6B). V osnovi ELISA DNK razdrobljenost testu apoptotske aktivnosti povečala: 2,5 krat (p < 0.000063) v celicah, okuženih z H. pylori
; 1,8-krat (p < 0,006) v celicah prehodno transfektiranih s RKIP; in 3,5-kratno (p < 0,0007) s kombinacijo (slika 6C).. Da bi ugotovili, ali je bil RKIP odgovoren za H. pylori
pogojenega apoptoza, smo zatreti RKIP izraza z lentivirusom zavrtje RNA in opazili zmanjšanje ravni RKIP beljakovin z Western blot analizo dokazuje zmanjšanje RKIP v neobdelane in H. pylori okuženih AGS celice (sl. 6d). V naši analizi razdrobljenost DNA, pri starševskih AGS celic H. pylori
okužba povzročila 2-kratno povečanje (p < 0,0007) v apoptozo (slika 6E.). V RKIP rasklapanje AGS celic, H. pylori
okužbe povzročilo 1,5-kratno povečanje apoptozo (p < 0,003) (. Fig 6E). Zmanjšanje apoptozo med starševskih in RKIP rasklapanje AGS celicami je bila statistično značilna (p < 0,0006). Ti rezultati kažejo, da je RKIP potrebno za H. pylori
pogojenega apoptozo.

Pogovor

Kronični gastritis in spremenjen celični promet, ki jih povzroča H. pylori
okužba spodbujanje razvoja distalnega adenokarcinomom želodca [36]. H. pylori
regulira želodčne epitelne apoptozo skozi več mehanizmov. Na primer, po okužbi in upoštevanje epitelijskih celic želodca, sistem izločanje CAG namenjen za spreminjanje transdukciji znotrajceličnih signalov, ki izhaja iz aktivacije NF-kB. NF-kB lahko premikanjem v jedro za aktivacijo transkripcije pro-apoptotskih genov [37]. H. pylori
lahko inducira apoptozo s povečanjem ekspresije FAS in njegovega liganda (FasL), ki vodi do aktivacije zunajbesedilno apoptozo poti [38]. Paradoksalno je, H. pylori
lahko aktivira tudi poti, ki upocasnjujejo apoptozo [39], zlasti pozno v poteku kronične okužbe [40]. Ta prilagodljiva odziv epitelnih celic, da se uprejo apoptozo v kronično H. pylori
okužba lahko prispeva k H. pylori
inducirano želodca nastanek raka [41]. Apoptoze odziv epitelnih celic želodca do H. pylori
je prav tako odvisna od posamezne seve, virulentnih dejavnikov. Na primer, okužba z CAG PAI-pozitivnih sevov inducira apoptozo hitreje kot CAG PAI-negativna sevov [42]. H. pylori Vaca
genski produkt spodbuja notranjo apoptotske poti, ki vodi do mitohondrijev sprostitev citokroma c, in kaspaze-3 aktivacijo [43]. Vaca-inducirano apoptozo je povezan z zmanjšanjem stat3 vodi k downregulation od Bcl-2 in Bcl-X _{L [43]. V drugi raziskavi se je pokazalo, da je H. pylori
inducira apoptozo s poti, ki vključuje zaporedno indukcijo apical kaspaze-8 dejavnosti, so pro-apoptotske proteini Bad in ponudb, kaspaze-9 dejavnost, in efektor kaspaze-3 dejavnosti [44].}

Naša raziskava opisuje drug mehanizem, s katerim H. pylori
okužba lahko spodbuja apoptozo v želodčnih rakavih celic, še posebej s spodbujanjem RKIP fosforilacije. Sposobnost RKIP da inhibira Raf /MAPK signalizacijo [26], [27] in spodbuja apoptozo je dobro dokumentiran [29]. Interakcija tez poti in ravni RKIP izražanja je bil vpleten v več fazah nastanka tumorjev in /ali napredovanja [30]. Poleg tega čezmernim rezultatov RKIP pri inhibiranju metastaz in invazivnosti v različnih tumorskih modelih [45] - [48]. Osnovna mehanizem diferencialne izražanja pRKIP in RKIP ni znan. Imeli smo pričakovali, da bi relativno višje stopnje pRKIP po okužbi v korelaciji z nižjimi stopnjami RKIP. Vendar pa smo ugotovili, da je H. pylori
okužba povzročila degradacijo RKIP beljakovin, ki bi omogočil MAPK signalizacije in apoptozo indukcijo na raka želodca po H. pylori
okužbe. -PKC posredovana RKIP fosforilacija lahko ogrozi sposobnost RKIP da se veže na Raf in zavira MAPK signalizacije [31], vendar pa niso bile predhodno vsa poročila o vlogi pRKIP pri uravnavanju apoptoze. Prejšnje študije iz našega laboratorija so pokazali, da so rezultati RKIP overexpression v neposrednem aktiviranju pro-kaspaze 8 [29]. Čeprav rezultati phosphoryation v jedrski relocalization, sledi aktiviranje RKIP lastne transkripcije ravni RKIP beljakovin ne povečujejo. To kaže na drugačen mehanizem regulacije RKIP od tistega, kar je bilo že poročali. Mi smo trenutno preučuje mehanizem, s katerim pRKIP sproži apoptozo v želodčnih rakavih celic po H. pylori
okužba.

CAG-pozitivni H. pylori
bistveno upregulate na-EMT povezana gene polž, polž in vimentina v povezavi z indukcijo MMP-7, kar kaže na vlogo teh proteinov v razvoj želodčnega raka [49]. V naši raziskavi smo ugotovili hitro indukcijo pRKIP beljakovin po H. pylori
okužba, in povečanje RKIP transkripciji in Povecanje iz Polž mRNA in izražanja proteinov. Čeprav je bil polž opredeljena kot transkripcijske represorju za RKIP [25], je naša raziskava kaže, da je to verjetno ne vpliva na fosforiliranega obliki RKIP, saj po okužbi nismo upoštevali za zatiranje RKIP transkripcijo.

Infekcijske z cagPAI-ima seve H. pylori
so povezani z močnejšim vnetnim odzivom v želodcu in predstavlja večje tveganje za nastanek razjed ali raka na želodcu kot sevi, ki nimajo otok OAS [36]. H. pylori
sproži intenzivno vnetni odziv in lokalno visokih ravni več citokinov, vključno interlevkin 6 (IL-6) [34].

• Plos ONE: Programirana kemoterapijo bolnikov z metastatskim neizrezljivih Rak želodca
• Plos ONE: Kvantitativno merjenje organskih kislin v tkivih od Rak želodca bolnikov kažejo povečano Glukoza je presnova v želodca Cancer