PLoS One: Regulation of RKIP Funkció Helicobacter pylori által gyomorrákban

absztrakt

Helicobacter pylori (H. pylori)
egy Gram-negatív, spirál alakú baktérium, amely megfertőzi több mint a fele a világ népességének és az egyik fő oka a gyomor adenokarcinóma . A kapcsoló mechanizmushoz H. pylori fertőzés katalógusa gyomor karcinogenezis nem ismertek. A jelen tanulmányban azt jelenti, hogy a Raf-kináz inhibitor fehérje (RKIP) van szerepe az apoptotikus H. pylori
a gyomornyálkahártya-sejtek. Western blot és luciferáz transzkripciós riporter vizsgálatok bizonyítják, hogy a kórokozó képesség sziget H. pylori
gyorsan foszforilálja RKIP, ami aztán lokalizálja a sejtmagba, ahol aktiválja a saját transzkripciós és apoptózist indukál. Erőltetett túltermelése RKIP elősegíti az apoptózist H. pylori
-fertőzött sejtekben, míg a RKIP RNS gátlás szuppresszálja az apoptózis indukcióját által H. pylori fertőzés
. Míg indukáló foszforilációja RKIP, H. pylori katalógusa egyszerre célozza meg nem foszforilált RKIP proteaszóma által közvetített lebomlási. A növekedés a RKIP transzkripció és foszforiláció törlik mutációjával RKIP szerin 153 valin, amely bizonyítja, hogy szabályozása RKIP aktivitás H. pylori
függ RKIP azon S153 maradék. Ezen túlmenően, H. pylori
fertőzés növeli a kifejezés csiga, egy transzkripciós represszor a RKIP. Eredményeink arra utalnak, hogy H. pylori katalógusa használ egy tumor szupresszor protein, RKIP, hogy támogassák az apoptózis gyomorrák sejtek. katalógusa

Citation: Moen EL, Wen S, Anwar T Cross-Knorr S, Brilliant K, Birnbaum F, et al . (2012) rendelete RKIP Funkció szerint Helicobacter pylori katalógusa gyomorrákban. PLoS ONE 7 (5): e37819. doi: 10,1371 /journal.pone.0037819 katalógusa

Szerkesztő: Yoshio Jamaoka, Veterans Affairs Medical Center (111D), az Amerikai Egyesült Államok katalógusa

Beérkezett: December 30, 2011; Elfogadva: 24. április 2012; Megjelent: 2012. május 25. katalógusa

Copyright: © 2012 Moen et al. Ez egy nyílt hozzáférésű cikk feltételei szerint terjeszthető a Creative Commons Nevezd meg! Licenc, amely engedélyezi a korlátlan használatát, a forgalmazás és a reprodukció bármilyen adathordozón, feltéve, hogy az eredeti szerző és a forrás jóváírásra. Katalógusa

Forrás: Ez a munka támogatta a National Institute of General Medical Sciences a National Institutes of Health alapján Award száma P20GM103421 (DC); Az előző szakasz a projekt támogatta a National Center for Research Resources (NCRR) alatt P20 RR 017695 (DC), R01 CA111533 (SFM) és R21 CA133601 (JMS). A finanszírozók nem volt szerepe a tanulmány tervezés, adatgyűjtés és elemzés, döntés, hogy közzéteszi, vagy a készítmény a kézirat. Katalógusa

Érdekütközés: A szerzők kijelentették, hogy nem ellentétes érdekek léteznek. Katalógusa

Bevezető

gyomorrák a negyedik leggyakrabban diagnosztizált malignitás a világon. 2007-ben körülbelül egymillió új gyomorrákos esetek vezető mintegy 800.000 haláleset világszerte jegyeztek, ezzel a második leggyakoribb halálok a rák [1]. Gyomorrák jelenleg a hetedik vezető oka a rákos halálesetek az Egyesült Államokban, mintegy 21.500 új esetet diagnosztizálnak 2011 (http://www.cancer.gov/cancertopics/types/stomach). A Gram-negatív spirál alakú baktérium Helicobacter pylori (H. pylori) hotelben fertőz több mint a fele a világ népességének és azonosították a fő kockázati tényező a gyomorrák karcinogenezissel [2]. Az Egészségügyi Világszervezet és a Nemzetközi Ügynökség Rákkutató kijelölt, mint egy I. osztályú rákkeltő 1994 [3]. A tudomány jelenlegi állása H. pylori
-indukált karcinogenezis az, hogy a baktérium és a kapcsolódó krónikus gyulladásos válasz elősegítése gyomornyálkahártya apoptózis által indukált sejtpusztulást [4], és az azt követő hiper-proliferációt [5], és szabadgyök termelés [6] amelyek mind hozzájárulnak a lassú és fokozatos szekvenciáját változások a gyomor nyálkahártya, hogy végül előnyben progresszió felé rák. Ez a modell összhangban van jelentéseket, hogy a pro-gyulladásos citokin gén polimorfizmusok, amelyek növelik az intenzitást a gyulladásos válasz kapcsolódó fokozott gyomorrák kockázatát [7].

H. pylori
tapad szorosan gyomor hámsejtek, és közvetlenül apoptózist indukál [8]. A CAG (citotoxikus asszociált gén) patogenitási sziget (CAG PAI) a H. pylori
egy 40 kB DNS-szegmens, amely tartalmazza kódoló gének alkatrészek egy IV típusú bakteriális szekréciós rendszer [9]. A régión belül a cagA
kódoló gén CagA, egy immundomináns fehérje 121-145 kDa [9]. H. pylori katalógusa rendelkező törzsek és kifejező CAG PAI gyakrabban társul peptikus fekélybetegség és gyomorrák nyugati populációk mint törzsek, amelyek nem. [9] Upon való injektálása útján a IV-es típusú szekréciós rendszer gazdasejtekbe gyomor epiteliális sejtek, CagA lehet utóbb által foszforilált Src-család tirozin-kinázok annak a C-terminálisán [10], ami CagA kötődni és aktiválni SHP2 és a jel keresztül ERK [11]. Fontos, hogy CagA is felelős aktiválja a jelátvivő és transzkripciós aktivátor 3 (STAT3) in vitro katalógusa és in vivo katalógusa [12], bár ez nem feltétlenül függ CagA foszforiláció [11].

STAT fehérjék konstitutívan expresszálódik számos neoplazmák, beleértve a gyomor-, mell-, fej- és nyak-, és prosztatarák [13] - [16]. Upon foszforilációja a tirozin 705 maradékot, és acetilezéssel lizin 685, STAT3 dimerizálódik és belép a sejtmagba, ahol úgy működik, hogy transzkripciós szabályozása széles skáláját gének [17], [18]. Konstitutív aktiválása STAT3 fehérje kimutatták, hogy megakadályozza az apoptózist, és növeli a sejtek szaporodását és metasztázis számos rákos megbetegedések, beleértve a gyomorrák [19], [20].

Az egyik fémjelzi a gyomor tumor progressziójának a megszerzése több invazív és migrációs fenotípus során epithelialis-mesenchymalis tranzíció (EMT). Alatt EMT, gasztrikus epiteliális sejtek mennek fenotípusos változásokat jellemzi a veszteség a sejtadhéziós molekulák, különösen a epithelialis cadherin (E-cadherin) [21]. A transzkripciós faktor csiga, egy cink-ujj fehérjét, jellemezte korábban, mint fontos szabályozója a EMT miatt aktiválás keresztül a nukleáris faktor kappa Beta (NF-kB) [22] és az azt követő elnyomás az E-cadherin in epiteliális tumorsejtek [ ,,,0],23], [24]. Továbbá, a vizsgálatokban, erősítés-of-function és a veszteség-of-function megközelítések azonosítottak csiga, mint egy represszor a RKIP transzkripció áttétes prosztatarák-sejtek [25].

RKIP tagja a foszfatidil-etanol-kötő fehérje család és egy negatív szabályozója ERK1 /2 (extracelluláris szignál által szabályozott kináz) [26], az NF-kB [27] és GRK (G-fehérjéhez kapcsolt receptor kináz) [28] utak. RKIP így fontos szerepet játszik szabályozásában a sejtek túlélését és az apoptózis, továbbá a potenciáló hatékonyságának kemoterápiás szerek [29]. RKIP is azonosították metasztázisszuppresszor- fehérje [30], valamint a gyomor adenokarcinóma betegek létezik egy pozitív korreláció RKIP véleménynyilvánítás és a betegek túlélését és fordított korrelációt kifejezése RKIP és STAT3 [19]. RKIP expresszió és funkció lehet szabályozni poszt-transzlációs módosítások. Például foszforilezése RKIP protein kináz C a szerin-153 megakadályozza RKIP azon képességét, hogy kötődik a célmolekulához, így inaktiválja RKIP funkció [31]. Továbbá, RKIP elnyomás keresztül promoter metiláció lehet leküzdeni a metiláció és a hiszton-dezacetiláz-inhibitorok [25].

Mivel a fontos szerepét RKIP, STAT3 és H. pylori
patogenezisében gyomorrák, megvizsgáltuk, hogy H. pylori
jeleket RKIP. A vizsgálatok arra utalnak, hogy egy komplex kölcsönhatása H. pylori által cagPAI katalógusa, RKIP, STAT3, Csiga jár, hogy dysregulate gyomornyálkahártya sejt apoptózis befolyásolása révén RKIP funkció, egy olyan mechanizmust, amely meghatározza a központi szerepet RKIP H. pylori katalógusa -asszociált gyomor kialakulásában. katalógusa

Anyagok és módszerek katalógusa

Reagensek katalógusa

Az összes reagens és vegyszerek a Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO), hacsak másként nem jelezzük. MG-132-től vásároltuk Calbiochem (Gibbstown, NJ) DMSO-ban feloldott és használt 10 mM koncentrációban. Az interleukin-6 (IL-6) vásároltunk a BD Biosciences (San Diego, CA). A fehérje mennyiségi meghatározását reagenst a Bio-Rad Laboratories, Inc. (Hercules, CA). Fokozott kemilumineszcencia reagensek és másodlagos egér és nyúl torma-peroxidáz-konjugált Western blot analízis voltak a GE Healthcare (Piscataway, NJ). Az aktin-HRP, foszforilált-RKIP (pRKIP), és a STAT3 antitesteket vásárolt Santa Cruz Biothechnology (Santa Cruz, CA). Az antitestek a STAT3 pS727 és pY705 és PARP vásároltuk a Cell Signaling Technology (Beverly, MA), és az antitestet RKIP a Millipore, Billerica, MA. Az antitest csiga vásároltunk a ABCAM (Cambridge, MA).

A sejteket és a plazmidok

Az emberi gyomor karcinóma sejtvonal AGS (CRL-1739) vásároltunk a American Type Culture Collection (Manasas , VA). MKN28 sejteket adományozta Dr. Richard Peek, Vanderbilt Egyetem, Nashville, TN és az eredetileg vásárolt Riken Cell Bank, Ibaraki, Japán. Az expressziós plazmidokat pcDNA3, c-myc STAT3, CMV-HA-RKIP (HA-RKIP) és a CMV-HA üres vektor (EV) leírták [18], [26]. A RKIP S153V plazmidot melyet Dr. Marsha Rosner, University of Chicago, Chicago, IL. Katalógusa

H. pylori katalógusa Törzsek és tenyésztési körülmények katalógusa

A vad típusú H. pylori katalógusa törzsek vagy izogén H. pylori
mutánsok együtt tenyésztettünk a AGS vagy MKN gyomor sejtvonalak a korábban leírt [32] at fertőzési multiplicitással (MOI) 100:1 minden kísérletben, kivéve, ha másként nem jelezzük.

transzfektálása AGS Cells

AGS-sejteket tranziensen transzfektáltunk a GenJet plazmid transzfekciós reagens (Signagen Laboratories, Gaithersburg, MD) alkalmazásával a gyártó protokollja egy 6-lyukú lemez formátumban. Teljes DNS közötti mennyiségben az 1. és 2 ug transzfektáltunk mintánként. Transzfekció feltételek értékelték és optimalizált elemzésével transzfektált sejtek zöld fluoreszcens protein (GFP) expresszáló RKIP plazmidot. Transzfekció hatékonyságot következetesen a tartományban 75-85%.

Protein Extraction és Western blot analízissel

Teljes sejt kivonatok és szubcelluláris frakcionálás állítottunk elő és immunblottoltuk a korábban leírt [29], [32 ]. A protein koncentrációt határoztuk meg BCA Protein Assay (Thermo Scientific). Denzitometrálásával Western blot végeztük protokoll szerint szerepel a következő honlapon: http://lukemiller.org/journal/2007/. Katalógusa

Valós idejű PCR katalógusa

Két ug RNS-t alakítjuk cDNS RevertAid First-Strand cDNA Synthesis Kit (Thermo Scientific). Kvantitatív valós idejű PCR alkalmazásával végeztük 2 × QIAGEN QuantiFast SYBR Green I (Roche). A primerek csiga forward: AGCTCTCTGAGGCCAAGGATCT, fordított: TGTGGCTTCGGATGTGCAT és béta-aktin: előre: CTGGCACCACACCTTCTACAA, fordított: CAGCCTGGATAGCAACGTACA. A következő tipikus profilját alkalommal használt volt 40 cikluson: egy kezdeti lépést 95 ° C-on 10 percen keresztül, majd 95 ° C-on 15 s és 60 ° C-on 1 percig. A relatív expressziós szint segítségével számoltuk ki a 2-es ΔΔCT eljárás a korábban ismertetett módon [33].

STAT3 és RKIP luciferáz riportert Assay

A sejteket (2 × 10 ^{5 sejt /lyuk 6 mérőhelyes lemezeken) tranziensen transzfektáltuk 0,1 ug (STAT3, RKIP), vagy 0,05 ug (NF-kB) egy riporter plazmiddal, amely vagy a STAT3 kötő SIE-fragmensét a promoter régió az egér IRF1 gén (p2xSIE-Luc) vagy a RKIP promoter régió, valamint a jelzett plazmidokat a korábban leírtak [18]. Körülbelül 24 órával a transzfekció után a sejteket kezeltük a jelzett gyógyszer vagy fertőzött H. pylori
egynapos vagy kezeletlen marad. A luciferáz aktivitást a citoszolikus felülúszót értékeltük a luciferáz riportergén Assay (Promega), és mértük luminométer becslésére transzkripciós aktivitását [18].}

Az apoptózis assay

apoptózist mennyiségileg külön vizsgálatokban áramlási citometriával és a DNS-fragmentáció ELISA-val. Áramlási citometriás az aránya, az apoptotikus sejtek (al-G _{O) határoztuk meg áramlási citometriával propidium-jodid festett sejtek [29]. A citoplazmatikus hiszton-asszociált DNS-fragmentációt mértük a sejthalált detektáló ELISA-Plus kit (Roche, Indianapolis, IN) alkalmazásával a gyártó utasításai szerint.}

A citoplazmatikus hiszton-asszociált DNS-fragmentációt mértük a sejthalált detektáló ELISA-Plus reagenskészlet (Roche, Indianapolis, IN) alkalmazásával a gyártó utasításai szerint. A kísérleteket 3-szor, és még egyszer megismételjük. Katalógusa

lentivírus közvetített kiütése RKIP katalógusa

lentivírus konstruál. Katalógusa

pLKO.1 Puro-rezisztencia lentivirális konstrukció RHS3979-97070798 és RHS3979-98492779 cégtől vásároltuk Nyitott Biosystems (Huntsville, Alabama). A konstrukciókat tartalmazott egy puromicin szelekciós markert és Luria Broth ampicillint tartalmazó 37 ° C-on. A fermentlevet centrifugáljuk, 10000 G katalógusa 10 percig. és a felülúszót eldobjuk. DNS-t a pelletek alkalmazásával tisztítottuk a QIAGEN Plasmid Plus Maxi Kit.

lentivírus termelést.

293T csomagolás sejteket szélesztettünk alacsony antibiotikum növekedési közegben (DMEM, 10% hővel inaktivált FBS-sel, 0,1 × penicillin /Strepomycin /glutamin). A sejteket 24 órán át inkubáltuk (37 ° C-on, 5% CO _{2), vagy addig, amíg megközelítőleg ~70% egybefolyó. A média a 293T csomagoló sejtekben váltotta nagy növekedési média DMEM. Előállítása a transzfekciós plazmidokat a következőképpen állítjuk elő: a csomagolás plazmiddal (ΔVpr.89), boríték plazmidot (VSV-G), hajtű-pLKO.1 és az üres vektor.}

Fugene transzfekciós reagenst készítünk DMEM szerint a gyártó utasításait. Röviden, a 3 plazmidokat cseppenként hozzáadjuk a Fugene és DMEM és összekeverjük. Az elegyet ezután hagytuk inkubálódni 20-30 perc. szobahőmérsékleten. A transzfekciós keveréket ezután óvatosan hozzáadjuk a csomagolás sejteket. A sejteket körülbelül 18 órán át. A transzfekciós közegeket majd eldobjuk a következő reggel, és helyébe magas növekedési médiában. A sejteket 24 órán át inkubáltuk. Lentivírus tartalmazó táptalajon betakarították containingand további nagy növekedés média hozzá. A sejteket 24 órán át inkubáltuk, és a média betakarított. Tipikus gyűjtemény 2-3 időpontokban. Minden vírus aratások egyesítjük.

lentivírus fertőzés AGS sejteket.

AGS sejteket körülbelül 50% -os összefolyásig. A virális felülúszókat adunk polibrén. Tizenkét órával a fertőzést követően, a virális tápközeget elöntöttük, és helyére vírusos média és inkubáljuk további 12 órán át. A tápközeget elöntöttük, és helyére Ham-féle F12 tápközegben. A sejteket 24 órán át inkubáltuk. A sejteket szét szelekciós táptalajon tartalmazó puromicin, és hagytuk inkubálódni 24 órán át.

Statisztikai módszerek

Minden sejttenyészet kísérleteket megismételtük legalább 3-szor, hacsak másképpen nem jelezzük, és párosítva t- tesztet alkalmaztunk a statisztikai szignifikancia meghatározására. katalógusa

Eredmények katalógusa

H. pylori
Fertőzés Növeli foszforilációja RKIP

RKIP gátolja számos sejt túlélését utat, beleértve azokat keresztül közvetített NF-kB és Jak /STAT [22]. Hogy világosabb hatásának H. pylori fertőzés katalógusa RKIP a gyomor-sejtek, AGS sejteket fertőzött H. pylori
és a betakarított 2 óra és 6 óra múlva. Ábrán látható. 1A, szintek foszforilált RKIP (pRKIP) emelkedett volt 2 óra elteltével (3,126-szeres) és 6 óra (2,9-szeres) után H. pylori fertőzés katalógusa mivel teljes RKIP fehérje expresszió emelkedett 1,4-szeres után 2 óra és 1,75-szeres 6 óra után a H. pylori fertőzés
. Hasonló eredményeket kaptak a MKN gyomorrák sejtek (lásd S1). Katalógusa

H. pylori
indukált foszforilációja a RKIP van PKC-függő

A foszforilációja RKIP a szerin 153 protein kináz C (PKC) megszünteti azt a képességét, hogy kötődik a Raf és gátolják a downstream MAP kináz jelátviteli [31]. Megvizsgáltuk, hogy foszforilációja RKIP által H. pylori katalógusa volt PKC-függő. AGS sejteket fertőztünk H. pylori
6 órán jelenlétében vagy távollétében 40 jim bisindolylmaleimide (Bis, a PKC-inhibitor). Eredményeink azt mutatják, hogy a szintek a foszforilált RKIP gátolta 3,9-szeresére és RKIP 1,36-szeres után H. pylori
fertőzés jelenlétében a PKC-inhibitor, ami arra utal, hogy a RKIP foszforiláció által H. pylori katalógusa jár, de nem lehet teljesen függ a PKC szabályozott útvonal (ábra. 1B). katalógusa

IL-6 indukálja foszforilációja RKIP és H. pylori katalógusa aktiválja STAT3 katalógusa

Mivel inverz kapcsolata RKIP és STAT3 kifejezés gyomorrákban példányok [19], értékeltük, hogy STAT3 és annak fő szabályozója az IL-6 [17] érinti pRKIP kifejezést. IL-6 kezelés dózisban 25 vagy 50 ng /ml megnövekedett szintű pRKIP fehérje 1,8 és 1,35-szeres, illetve és a teljes RKIP fehérje expressziója csökkent 0,8 és fokozott 1,05-szeres volt (2A.). A foszforilációja RKIP válaszul IL-6 volt a PKC-függő (az adatokat nem mutatjuk be). Ezek az adatok azt jelzik, hogy az IL-6, szintén indukálhatnak foszforilációját RKIP gyomor sejtekben, hogy előfordulhat, részben, egy PKC-függő útvonalon.

A makrofágok Release citokin, beleértve az IL-6 alatt H. pylori fertőzés katalógusa [34], ami STAT3 aktiváló [17]. Hatásának vizsgálata az H. pylori
fertőzés aktiválását STAT3, AGS-sejteket tranziensen transzfektáltunk egy IRF-1 riporter konstrukcióval [18] és együtt tenyésztett H. pylori
a jelzett tartományban fertőzési multiplicitás (MOI) 24 órán át. Eredményeink azt mutatták, hogy a MOI között 10-200:1, H. pylori
volt képes indukálni a STAT3 transzkripciós (ábra. 2C) és a STAT3 pY705 foszforiláció (ábra. 2B) 6 órán belül a fertőzés. A következőkben határozza meg, hogy az IL-6 is serkentik STAT3 transzkripciós AGS sejtekben. AGS sejteket tranziensen transzfektáltunk IRF-1 és az EV és vagy c-myc-címkézett STAT3, majd 24 óra elteltével a sejteket kezeltük vagy IL-6 (50 ng /ml) vagy együtt tenyésztett H. pylori
MOI 100:1. Az eredmények, ábrán mutatjuk be. 2D, azt mutatják, hogy az IL-6 (p < 0,0003) és a H. pylori katalógusa (p < 0,0005) volt mindegyik képes jelentősen serkentik STAT3 transzkripciós, amely hatás fokozódott, amikor AGS sejteket a STAT3 és fertőzött H. pylori katalógusa (p < 0,0000023). A fokozása STAT3-aktiválást jelentősen nőtt, amikor AGS sejteket együtt kezelt IL-6 és a H. pylori
ha összehasonlítjuk a kezelést az IL-6 (p < 0,000028), vagy H. pylori katalógusa (p < 0,0003) egyedül. katalógusa

A foszforilált RKIP indukálja saját átíró katalógusa

Régebben egy RKIP luciferáz riporter vizsgálat hatásának vizsgálata az H. pylori fertőzés
RKIP transzkripciós aktivitását. H. pylori
szignifikánsan növelte RKIP transzkripció (p < 0,002), a nagyobb, mint 10-szeres növekedést történnek RKIP overexpresszió, és nagyobb, mint 16-szeres növekedést a kombinált H. pylori
és RKIP (p < 0,0003) (ábra. 3A), ha összehasonlítjuk a kezeletlen AGS transzfektált sejtek üres vektorral. Szignifikáns növekedés (p < 0,0001) RKIP transzkripció a H. pylori
fertőzés és RKIP overexpressziója képest transzfektált sejtek RKIP fertőzés nélkül (ábra. 3A). Megismételtük ezeket a kísérleteket jelenlétében Bis, hogy gátolják a PKC-aktivitás meghatározásához a megnövekedett RKIP transzkripció volt köszönhető, hogy foszforiláció. A jelenléte a PKC inhibitor, H. pylori
fokozott RKIP transzkripció és RKIP túltermelése is eredményezte javítására RKIP promoter aktivitását. Bis csökkent RKIP által indukált átírás RKIP túltermelése és H. pylori
fertőzés nagyobb, mint 4-szeres, ha összehasonlítjuk a sejtek a RKIP overexpresszió, és javasolja, hogy ezeknek a hatásoknak függ RKIP foszforiláció (ábra. 3A). Megvizsgáltuk a lokalizáció RKIP után H. pylori fertőzés
. Immunoblotting szubcelluláris AGS sejtek frakciói kimutatták, hogy pRKIP lokalizálódik a sejtmagba, míg RKIP marad elsősorban a citoszolban a fertőzés után, (ábra. 3B). Ezek az adatok arra utalnak, hogy H. pylori katalógusa elősegítheti a áttelepítésének pRKIP a sejtmagba, ahol meg lehet aktiválni RKIP átírás. katalógusa

H. pylori katalógusa indukált RKIP foszforilációja függ H. pylori által CAG katalógusa Pathogenitási sziget és RKIP szerin 153 katalógusa

értékelték a sajátos H. pylori
tényezők a foszforilációját RKIP, vad típusú H. pylori katalógusa és izogénes rendelkező mutánsok a teljes CAG PAI vagy
a oipA katalógusa gén voltak együtt tenyésztett sejtek AGS 6 órán át. A H. pylori katalógusa mutáns hiányzik a CAG PAI katalógusa tudta indukálni RKIP foszforiláció, míg a vad típusú foltot, és a oipA katalógusa mutáns erősen indukálta RKIP foszforiláció (4A.). Ugyanez a tendencia volt megfigyelhető a STAT3 pY705. Ezek az eredmények arra utalnak, hogy a gének a H. pylori által
cagPAI szükségesek az indukció RKIP és STAT3 foszforiláció.

Annak vizsgálatára, ha mutáció szerin 153 érinti H. pylori
közvetített RKIP foszforiláció és transzkripciós aktiválás, AGS-sejteket tranziensen transzfektáltunk egy RKIP konstrukció, amelyben a szerin-ben szubsztituált valin 153. pozíciójában (S153V), majd együtt tenyésztett H. pylori
. Ismét azt tapasztaltuk, egy nagyobb, majd 16-szeres RKIP promotor aktivitást sejtek RKIP overexpresszió és H. pylori fertőzés katalógusa (p < 0,0005). Azonban transzfektált sejtekben RKIP S153V előtt H. pylori
fertőzés volt egy 2,5-szeres csökkenést transzkripciós aktivitását (p < 0,0003), amikor összehasonlítjuk a H. pylori fertőzés katalógusa vad típusú RKIP overexpresszáló sejtek (ábra. 4C). Emellett túltermelése S153V RKIP gátolta H. pylori katalógusa -mediált RKIP foszforiláció (ábra. 4B). Összefoglalva, ezek az eredmények azt jelzik, hogy a foszforiláció és transzkripciós aktiválását RKIP függ H. pylori által katalógusa cagPAI és után foszforilációja RKIP at S153. katalógusa

H. pylori fertőzés katalógusa eredményei RKIP lebomlás és az indukció Csiga katalógusa

Mivel megnövekedett RKIP által indukált átírás H. pylori fertőzés katalógusa nem járt együtt a megnövelt steady state teljes RKIP fehérje expresszió, megvizsgáltuk, hogy H. pylori
esetleg egyidejűleg növeli a lebomlási sebességét RKIP fehérje keresztül proteaszóma által közvetített lebomlási, ahogy ezt korábban javasolták [35]. MG132 megnövekedett RKIP fehérje szintje jelenlétében vagy távollétében H. pylori fertőzés
összhangban H. pylori
növekvő proteaszómális RKIP lebomlás (ábra. 5A). katalógusa

Egy másik mechanizmus megmagyarázhatja a hiányzó változást RKIP fehérje vagy mRNS expressziója lenne transzkripciós elnyomása RKIP után H. pylori fertőzés
. Csiga egy transzkripciós faktor, amely fontos szerepet játszik az EMT [23], valamint, hogy egy ismert transzkripciós represszor a RKIP a prosztatarák-sejtek [25]. Hatásának vizsgálata az H. pylori fertőzés katalógusa a kifejezés Csiga és RKIP, AGS sejteket együtt tenyésztettük H. pylori
MOI 100. Csiga mRNS expressziója erősen indukálta után 2-4 órán fertőzés (ábra. 5D) Western-blot analízis azt jelezte, hogy H. pylori
fertőzés eredményezte idő- és dózisfüggő növekedése a csiga fehérje szint (ábra. 5B /C). Ez az eredmény nem egyezik meg adatainkat RKIP átírás után H. pylori fertőzés
(3.), és azt sugallja, hogy H. pylori
fertőzés indukálását protein (ek), amely megszünteti a hatás csiga RKIP transzkripciót. Jelenleg vizsgáljuk ezt a lehetőséget tömegspektrométer analízissel szülői és RKIP knockdown sejtek (6.). Katalógusa

RKIP Javítja H. pylori katalógusa közvetített apoptózis katalógusa

H. pylori
indukál gyomornyálkahártya-sejt-apoptózist [8]. Mivel RKIP elősegítheti az apoptózist [29], azt vizsgáltuk, hogy az indukciós pRKIP után H. pylori fertőzés katalógusa, felelős lehet H. pylori
indukált apoptózist. AGS sejteket tranziensen transzfektáltunk RKIP vagy üres vektorral, fertőzött H. pylori
16 órán és az apoptózis értékeltük keresztül PARP hasítás áramlási citometriával és a DNS-fragmentáció. Néhány kísérletben RKIP gátolta a lentivírus-mediált RKIP knockdown. Ábrán látható. 6A, H katalógusa. pylori
indukált a PARP-hasítást indukálni, amely hatás a növelték ektópiás expressziója RKIP. Áramlási citometriás analízis azt mutatta, hogy H. pylori
fertőzés eredményezett mintegy 4-szeres növekedését apoptózis (p < 0,0008), RKIP overexpresszió, egy 3-szoros növekedést (p < 0,003), és a kombinált egy 6-szoros növekedést (p < 0,0005) képest kezeletlen AGS sejtek (6B.). Az ELISA-alapú DNS fragmentáció assay, apoptotikus aktivitás megnövekedett: 2,5-szeres (p < 0,000063) fertőzött sejtekben H. pylori
; 1,8-szeres (p < 0,006) sejtekben tranziensen transzfektált RKIP; és 3,5-szeres (p < 0,0007) a kombinált (ábra. 6C). Annak megállapítására, hogy RKIP megbízott H. pylori
közvetített apoptózisra, mi elfojtott RKIP expresszió lentivírus-mediált RNS gátlás és a megfigyelt csökkenése RKIP fehérje szinten Western-blot-analízis igazolja a csökkentés RKIP a kezeletlen és a H. pylori fertőzött AGS sejtek (ábra. 6D). A mi DNS fragmentáció elemzés, szülői AGS sejtek H. pylori
fertőzés eredményezte 2-szeres növekedést (p < 0,0007) az apoptózisban (ábra. 6E). A RKIP knockdown AGS sejtek, H. pylori
fertőzés eredményezte 1,5-szeres növekedést apoptózis (p < 0,003) (ábra. 6E). A csökkentés az apoptózis közötti szülői és RKIP knockdown AGS sejtek statisztikailag szignifikáns volt (p < 0,0006). Ezek az eredmények azt jelzik, hogy RKIP szükséges H. pylori
közvetített apoptózist. katalógusa

Vita katalógusa

A krónikus gyomorhurut és a megváltozott celluláris forgalom okozta H. pylori fertőzés katalógusa fejlődésének elősegítése disztális gyomor adenokarcinóma [36]. H. pylori katalógusa lehet szabályozni gyomornyálkahártya apoptózis számos mechanizmuson keresztül. Például, a fertőzést követően és betartását gyomor hámsejtek, a CAG szekréciós rendszer arra szolgál, hogy megváltoztatják az intracelluláris szignál transzdukciós eredményező NF-kB. Az NF-kB is a sejtmagba, hogy aktiválja a transzkripciót a pro-apoptotikus gének [37]. H. pylori
is indukálhat apoptózist növelésével kifejezése FAS és liganduma (FASL), ami az aktiválás a extrinsic apoptózis útvonal [38]. Paradox módon, H. pylori katalógusa is aktiválhatja a pályákat, amik downregulate apoptózist [39], különösen a késő során a krónikus fertőzés [40]. Ez az adaptív válasz hámsejtek ellenállni apoptózis krónikus H. pylori fertőzés katalógusa hozzájárulhat H. pylori katalógusa indukált gyomor carcinogenesis [41]. Az apoptotikus válasz gyomornyálkahártya sejtek H. pylori katalógusa is függ törzs-specifikus virulencia faktorok. Például fertőzés CAG PAI-pozitív törzsek indukálhat apoptózist gyorsabban CAG PAI-negatív törzsek [42]. A H. pylori vacA
géntermék stimulálja az intrinsic apoptotikus vezető útvonal a mitokondriális felszabadulását a citokróm c, és a kaszpáz-3 aktiválását [43]. VacA-indukált apoptózis társított csökkentésével STAT3 vezető downregulációja a Bcl-2 és Bcl-X _{L [43]. Egy másik vizsgálatban, kimutattuk, hogy a H. pylori katalógusa apoptózist indukál egy utat járó szekvenciális indukció apikális kaszpáz-8-aktivitást, a pro-apoptotikus fehérjék Bad, Bid, kaszpáz-9 aktivitás és effektor kaszpáz-3 aktivitás [44]. katalógusa}

Tanulmányunk másik mechanizmus, amellyel H. pylori fertőzés katalógusa apoptózist elősegítse gyomorrák sejtek specifikusan előmozdításával RKIP foszforiláció. Az a képesség, RKIP gátolni Raf /MAPK jelátvitel [26], [27] és elősegíti az apoptózist már jól dokumentálták [29]. A kölcsönhatás tézisek utak és RKIP expressziós szintek hozták összefüggésbe a sok lépést a tumor kialakulását és /vagy progresszióját [30]. Továbbá túlexpressziója RKIP eredményezi metasztázis gátlására és invazív különböző tumor modellekben [45] - [48]. Az alapul szolgáló mechanizmus a differenciális expresszióját pRKIP és RKIP nem ismert. Mi volt várható, hogy a viszonylag magasabb pRKIP fertőzés után összefüggésben lehet alacsonyabb RKIP szinten. Ugyanakkor azt találtuk, hogy a H. pylori
fertőzés eredményezte lebomlását RKIP fehérje, esetleg lehetővé téve MAPK jelátvitel és az apoptózis indukció gyomorrákban után H. pylori fertőzés
. PKC által közvetített RKIP foszforiláció megzavarhatja a képességét RKIP kötődni Raf és gátolják a MAPK jelátviteli [31], azonban ott még nem jelentek meg semmilyen jelentést a szerepét pRKIP az apoptózis szabályozásában. Korábbi tanulmányok a mi laboratóriumi kimutatták, hogy RKIP túltermelése eredményez a közvetlen aktiválásának pro-kaszpáz-8 [29]. Bár phosphoryation eredmények nukleáris relokalizációját, majd RKIP aktiválás saját transzkripciójának, a szintek RKIP fehérje nem növelik. Ez arra utal, más mechanizmus szerint RKIP szabályozás, mint amit már korábban jeleztük. Jelenleg vizsgálja a mechanizmus, amellyel pRKIP kiváltja apoptózist gyomorrák sejtek után H. pylori fertőzés katalógusa.

Cag-pozitív H. pylori
jelentősen upregulate a EMT-asszociált gének Csiga, csiga és vimentin együttműködve a indukciós MMP-7, ami arra utal szerepe ezeket a fehérjéket a gyomorrák fejlesztés [49]. A tanulmányban megfigyelt gyors indukciója pRKIP protein után H. pylori
fertőzés, és a növekvő RKIP transzkripció és egy upreguláció csiga mRNS és fehérje expressziót. Bár Csiga azonosították transzkripciós represszor RKIP [25], a tanulmány azt jelzi, hogy valószínűleg nincs hatással a foszforilált RKIP, hiszen a fertőzés után nem tapasztaltunk olyan elnyomás RKIP átírás. Katalógusa

Fertőző a cagPAI-rendelkező törzsek H. pylori katalógusa társított erősebb gyulladásos válasz a gyomorban és a nagyobb kockázatot jelentene a fejlődő gyomorfekély vagy gyomorrák, mint törzsek hiányzik a CAG-sziget [36]. H. pylori
indukál intenzív gyulladásos válasz és helyileg magas szintje számos citokin, beleértve az interleukin-6 (IL-6) [34].

• PLoS One: Programozott kemoterápia a metasztatikus reszekálható Gyomor Cancer
• PLoS One: kvantitatív mérési szerves sav származó szöveteket gyomorrákos betegek növekedését jelzi glükózanyagcserét Gyomor Cancer