PLoS ONE: Regulation der RKIP Funktion von Helicobacter pylori in Magenkrebs

Abstrakt

Helicobacter pylori (H. pylori)
ist ein gram-negatives, spiralförmiges Bakterium, das mehr als die Hälfte der Weltbevölkerung infiziert und ist eine der Hauptursachen für Adenokarzinom des Magens . Die Mechanismen, die Link H. pylori
Infektion zu Magen-Krebsentstehung sind nicht gut verstanden. In der vorliegenden Studie berichten wir, dass die Raf-Kinase-Inhibitor-Protein (RKIP) eine Rolle bei der Induktion von Apoptose durch H hat. pylori
in Magenepithelzellen. Western-Blot und Luciferase-Transkription Reporter-Assays zeigen, dass die Pathogenität Insel H. pylori
phosphoryliert schnell RKIP, die in den Zellkern lokalisiert dann, wenn es seine eigene Transkription aktiviert und induziert Apoptose. Erzwungene Überexpression von RKIP verbessert Apoptose in H. pylori
infiziertem Zellen, während RKIP RNA Hemmung der Induktion von Apoptose durch H unterdrückt. pylori
Infektion. Während die Induktion der Phosphorylierung von RKIP, H. pylori
gleichzeitig zielt nicht phosphorylierten RKIP für Proteasom-vermittelten Abbau. Der Anstieg der RKIP Transkription und die Phosphorylierung wird durch Mutieren RKIP Serin 153 außer Kraft zu Valin, dass die Regulierung der RKIP Aktivität demonstriert durch H. pylori
ist abhängig von RKIP des S153 Rückstand. Darüber hinaus H. pylori
Infektion erhöht die Expression von Snail, einem Repressor von RKIP. Unsere Ergebnisse legen nahe, dass H. pylori
ein Tumor-Suppressor-Protein verwendet, RKIP, Apoptose bei Magenkrebszellen zu fördern

Citation:. Moen EL, Wen S, Anwar T, Kreuz-Knorr-S, Brilliant K, Birnbaum F, et al . (2012) Regulation der RKIP Funktion von Helicobacter pylori
in Magenkrebs. PLoS ONE 7 (5): e37819. doi: 10.1371 /journal.pone.0037819

Editor: Yoshio Yamaoka, Veterans Affairs Medical Center (111D), Vereinigte Staaten von Amerika

Empfangen: 30. Dezember 2011; Akzeptiert: 24. April 2012 um; Veröffentlicht am: 25. Mai 2012

Copyright: © 2012 Moen et al. Dies ist eine Open-Access-Artikel unter den Bedingungen der Lizenz Creative Commons, die uneingeschränkte Nutzung erlaubt, die Verteilung und Vervielfältigung in jedem Medium, vorausgesetzt, der ursprüngliche Autor und Quelle genannt werden

Finanzierung:. Diese Arbeit wurde vom National Institute of General Medical Sciences der National Institutes of Health unter Verleihungsnummer P20GM103421 (DC) unterstützt; das vorherige Segment dieses Projekt wurde von der National Center for Research Resources (NCRR) unter P20 RR 017.695 (DC), R01 CA111533 (SFM) und R21 CA133601 (JMS) unterstützt. Die Geldgeber hatten keine Rolle in Studiendesign, Datenerfassung und Analyse, Entscheidung oder Vorbereitung des Manuskripts zur Veröffentlichung

Konkurrierende Interessen:.. Die Autoren haben erklärt, dass keine Interessenkonflikte bestehen

Einführung

Magenkrebs ist die vierthäufigsten diagnostizierte Krebserkrankung in der Welt. Im Jahr 2007 etwa eine Million neue Magenkrebsfälle weltweit führende auf etwa 800.000 Todesfälle wurden aufgezeichnet und ist damit die zweithäufigste Todesursache durch Krebs zu machen [1]. Magenkrebs ist derzeit der siebthäufigste Todesursache bei Krebserkrankungen in den USA, mit rund 21.500 neue Fälle im Jahre 2011 diagnostiziert (http://www.cancer.gov/cancertopics/types/stomach). Die gramnegative, spiralförmige Bakterium Helicobacter pylori (H. pylori)
mehr als die Hälfte der Weltbevölkerung infiziert und hat als Hauptrisikofaktor für Magen-Krebsentstehung identifiziert worden [2]. Die Weltgesundheitsorganisation und die Internationale Agentur für Krebsforschung es als Klasse I der 1994 Karzinogen [3]. Unser gegenwärtiges Verständnis von H. pylori
-induzierten Karzinogenese ist, dass das Bakterium und die damit verbundene chronische Entzündungsreaktion durch Apoptose Magenepithelzellen Zelltod fördern [4], mit anschließender Hyperproliferation [5] und die Produktion freier Radikale [6] alle auf ein beitragen langsame und fortschreitende Folge von Veränderungen in der Magenschleimhaut, die letztlich Progression zu Krebs begünstigen. Dieses Modell steht im Einklang mit Berichten, dass pro-inflammatorische Zytokin-Gen-Polymorphismen, die die Intensität der Entzündungsreaktion erhöhen, werden zu einem erhöhten Magenkrebsrisiko im Zusammenhang mit [7].

H. pylori
haftet eng an Magenepithelzellen und direkt die Apoptose induzieren können, [8]. Die cag (zytotoxische-assoziierten Gens) Pathogenitätsinsel (cag PAI) von H. pylori
ist ein 40 kB Segment der DNA, die Gene, die für für Komponenten eines Typ-IV-Sekretionssystem Bakterien [9] enthält. In dieser Region ist die cagA
Gen, das CagA, eine immuno-Protein von 121-145 kDa [9] kodiert. H. pylori
Stämme besitzen und Expression des cag PAI sind häufiger im Zusammenhang mit Magengeschwüren und Magenkrebs in der westlichen Bevölkerung als Stämme, die nicht [9]. Nach seiner Injektion durch die Typ IV-Sekretionssystem in Wirts Magenepithelzellen, CagA anschließend phosphoryliert durch Src-Familie-Tyrosinkinasen an seinem C-Terminus [10], was CagA SHP2 und Signal über ERK zu binden und zu aktivieren [11]. Wichtig ist, dass CagA auch verantwortlich für die Aktivierung des Signalgebers und Aktivator der Transkription 3 (STAT3) In-vitro-
und in vivo
[12], obwohl dies nicht unbedingt auf CagA Phosphorylierung abhängig sein [11]

STAT-Proteine ​​werden in verschiedenen Neoplasien konstitutiv exprimiert, einschließlich Magen-, Brust-, Kopf- und Hals-und Prostatakrebs [13] - [16].. Nach Phosphorylierung des Tyrosin-705-Rest und Acetylierung bei Lysin 685, dimerisiert STAT3 und tritt in den Zellkern, wo es wirkt, um transkriptionell eine Vielzahl von Genen regulieren [17], [18]. Konstitutive Aktivierung von STAT3-Protein wurde gezeigt, Apoptose zu verhindern und die Zellproliferation und Metastasierung in einer Reihe von Krebserkrankungen, einschließlich Magenkrebs [19], [20] zu erhöhen.

Eines der Kennzeichen von Magentumorprogression ist Erwerb von mehr invasive und wandernde Phänotypen während der epithelial-mesenchymale Transition (EMT). Während EMT, durchlaufen Magenepithelzellen phänotypischen Veränderungen charakterisiert durch den Verlust von Zelladhäsionsmolekülen, insbesondere die epithelialen Cadherin (E-Cadherin) [21]. Der Transkriptionsfaktor Snail, eine Zink-Finger-Protein, wurde über Nuclear Factor kappa Beta (NF-kB) [22] und die anschließende Verdrängung von E-cadherin in epithelialen Tumorzellen aufgrund ihrer Aktivierung zuvor als ein wichtiger Regulator der EMT gekennzeichnet [ ,,,0],23], [24]. Darüber hinaus Studien mit gain-of-function und loss-of-function Ansätze Schnecke als Repressor von RKIP Transkription in metastatischen Prostatakrebszellen identifiziert [25].

RKIP ist ein Mitglied der Phosphatidylethanolamin-bindendes Protein Familie und ein negativer Regulator des ERK1 /2 (extracellular signal-Regulated Kinase) [26], NF-kB [27] und GRK (G-Protein-gekoppelten Rezeptor-Kinase) [28] Wegen. RKIP spielt somit eine wichtige Rolle bei der Regulierung der Zell-Überleben und Apoptose, zusätzlich zu der Wirksamkeit von Chemotherapeutika potenzieren [29]. RKIP hat auch als Metastase-Suppressor-Protein [30], und in einem Adenokarzinom des Magens Patienten gibt es eine positive Korrelation zwischen RKIP Ausdruck und das Überleben der Patienten und eine inverse Korrelation zwischen der Expression von RKIP und STAT3 [19] identifiziert. RKIP Expression und Funktion kann durch post-translationale Modifikationen geregelt werden. Beispielsweise die Phosphorylierung von RKIP durch Proteinkinase C an Serin-153 verhindert RKIP Fähigkeit an sein Zielmolekül zu binden, wodurch die Inaktivierung RKIP Funktion [31]. RKIP Repression durch Promotor-Methylierung durch Methylierung und Histon-Deacetylase-Inhibitoren [25] Ferner können überwunden werden.

Aufgrund der wichtigen Rolle von RKIP, STAT3 und H. pylori an der Pathogenese von Magenkrebs
, untersuchten wir, ob H. pylori
Signale durch RKIP. Unsere Studien deuten darauf hin, dass eine komplexe Interaktion zwischen H. pylori ist cagPAI
, RKIP, STAT3 und Schnecke wirkt durch Modulation RKIP Funktion Magen-epithelialen Zell-Apoptose zu dysregulate, einen Mechanismus, der für RKIP in H eine zentrale Rolle definiert. pylori
-assoziierten Magen Karzinogenese.

Materialien und Methoden

Reagenzien

Alle Reagenzien und Chemikalien von Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO) erworben wurden, es sei denn, anders vermerkt. MG-132 wurde von Calbiochem (Gibbstown, NJ), aufgelöst in DMSO gekauft und bei einer Konzentration von 10 mM verwendet. Interleukin-6 (IL-6) wurde von BD Biosciences (San Diego, CA) gekauft. Proteinquantifizierung Reagenzien wurden von Bio-Rad Laboratories, Inc. (Hercules, CA) erhalten. Verbesserte Chemilumineszenz-Reagenzien und sekundäre Maus und Kaninchen Meerrettich-Peroxidase-konjugierten für Western-Blot-Analyse wurden von GE Healthcare (Piscataway, NJ). Das Aktin-HRP, phosphoryliert-RKIP (pRKIP) und STAT3-Antikörper wurden von Santa Cruz Biothechnology (Santa Cruz, CA) erworben. Die Antikörper gegen STAT3 pS727 und pY705 und PARP wurden von Cell Signaling Technology (Beverly, MA) und dem Antikörper zu RKIP von Millipore, Billerica, MA erworben. Der Antikörper gegen Schnecke wurde von Abcam (Cambridge, MA) erworben.

Zellen und Plasmide

Die menschlichen Magenkarzinomzelllinie AGS (CRL-1739) von der American Type Culture Collection erworben wurde (Manasas , VA). MKN28 Zellen wurden von Dr. Richard Peek, Vanderbilt University, Nashville, TN gespendet und wurden ursprünglich von Riken Cell Bank, Ibaraki, Japan erworben. Die Expressionsplasmide für pcDNA3, c-myc STAT3, CMV-HA-RKIP (HA-RKIP) und CMV-HA leeren Vektor (EV) beschrieben worden sind [18], [26]. Das Plasmid RKIP S153V wurde von Dr. Marsha Rosner, University of Chicago, Chicago, IL zur Verfügung gestellt.

H. pylori
Stämme und Kulturbedingungen

Wildtyp H. pylori
Stämme oder isogene H. pylori
Mutanten wurden cokultiviert mit den AGS oder MKN Magenzelllinien, wie zuvor beschrieben [32] bei einer Multiplizität der Infektion (MOI) von 100:1 in jedem Experiment wenn nicht anders angegeben.

Transfection von AGS-Zellen

AGS-Zellen transient wurden unter Verwendung des GenJet Plasmid Transfektionsreagenz (Signagen Laboratories, Gaithersburg, MD) gemäß dem Protokoll des Herstellers für eine 6-Well-Plattenformat. Gesamt-DNA-Mengen zwischen 1 und 2 &mgr; g wurden pro Probe transfiziert. Transfektionsbedingungen wurden durch Analyse von Zellen mit einem grün fluoreszierenden Protein (GFP) exprimierenden Plasmid transfiziert RKIP bewertet und optimiert. Die Transfektionseffizienzen waren durchweg im Bereich von 75-85%.

Proteinextraktion und Western-Blot-Analyse

Die Gesamtzellextrakte und subzellulären Fraktionierungen wurden hergestellt und immunoblottiert wie zuvor beschrieben [29], [32 ]. Die Proteinkonzentrationen wurden unter Verwendung des BCA-Protein-Assay (Thermo Scientific) bestimmt. Densitometrie von Western-Blots wurde gemäß dem Protokoll auf der folgenden Website aufgeführt ausgeführt. Http://lukemiller.org/journal/2007/

Realtime PCR

Zwei ug RNA umgewandelt wurde cDNA mit RevertAid Erste-cDNA-Synthese-Kit (Thermo Scientific). Quantitative real-time PCR wurde unter Verwendung von 2 × QIAgen QuantiFast SYBR Green I (Roche) durchgeführt. Die Primer für Schnecke waren nach vorn: AGCTCTCTGAGGCCAAGGATCT, Reverse: TGTGGCTTCGGATGTGCAT und Beta-Actin: vorwärts: CTGGCACCACACCTTCTACAA, Reverse: CAGCCTGGATAGCAACGTACA. Die folgenden typischen Verlauf Zeiten verwendet wurden für 40 Zyklen: einem ersten Schritt bei 95 ° C für 10 min, gefolgt von 95 ° C für 15 s und 60 ° C für 1 min. Die relative Expressionsniveau wurde Verfahren unter Verwendung des 2-ΔΔCT berechnet, wie zuvor beschrieben [33].

STAT3 und RKIP Luziferase-Reporter-Assays

Die Zellen (2 × 10 ^{5 Zellen /Vertiefung in 6-Well-Platten) wurden mit 0,1 ug (STAT3, RKIP) oder 0,05 &mgr; g (NF-kB) eines Reporter-Plasmid, das entweder das STAT3-Bindungs ​​SIE-Fragment der Promotorregion des Maus IRF1 Gens (p2xSIE-Luc) transient transfiziert oder der RKIP Promotorregion plus die angegebenen Plasmide wie zuvor beschrieben [18]. Etwa 24 h nach der Transfektion wurden die Zellen mit den angegebenen Arzneimittel behandelt oder infiziert mit H. pylori
über Nacht oder unbehandelt. Die Luciferase-Aktivität in der cytosolischen Überstand wurde unter Verwendung des Luciferase-Reporter-Assay (Promega) bewertet und gemessen unter Verwendung eines Luminometers Transkriptionsaktivität abzuschätzen [18].}

Apoptosis Assays

Apoptosis in separaten Assays quantifiziert durch Durchflusszytometrie und DNA-Fragmentation ELISA. Für die Durchflusszytometrie, der Anteil der apoptotischen Zellen (sub-G _{O) wurde durch durchflusszytometrische Analyse von Propidiumiodid-gefärbten Zellen [29] bestimmt. Zytoplasmatischen Histon-assoziierten DNA-Fragmentierung wurde mit dem Cell Death Nachweis ELISA Plus-Kit (Roche, Indianapolis, IN), gemessen nach den Anweisungen des Herstellers.}

Zytoplasmatischen Histon-assoziierten DNA-Fragmentierung mit dem Cell Death Nachweis ELISA plus gemessen wurde Kit (Roche, Indianapolis, IN) gemß den Anweisungen des Herstellers. Die Versuche wurden 3-mal wiederholt und doppelt durchgeführt.

Lentivirus-vermittelte Knockdown von RKIP

Lentivirus-Konstrukten.

pLKO.1 puro-Widerstand lentiviralen RHS3979-97070798 konstruieren und RHS3979-98492779 wurden vom Open Biosystems (Huntsville, AL) erworben. Die Konstrukte enthalten einen Puromycin-Selektionsmarker und wurden in Luria Broth enthaltend Ampicillin bei 37 ° C gezüchtet. Die Brühe wurde bei 10.000 × g zentrifugiert
für 10 min. und der Überstand verworfen. DNA aus den Pellets wurde unter Verwendung des QIAGEN Plasmid plus Maxi Kit gereinigt.

Lentivirus Produktion.

293T Verpackungszellen in Low-antibiotischen Wachstumsmedium ausgesät (DMEM, 10% hitzeinaktiviertem FBS, 0,1 × Penicillin /Strepomycin /Glutamin). Die Zellen wurden für 24 h inkubiert (37 ° C, 5% CO _{2) oder bis sie etwa ~ 70% konfluent waren. Die Medien auf den 293T Verpackungszellen mit hohen Wachstumsmedium, das DMEM ersetzt. Eine Mischung der Transfektion Plasmide wurden wie folgt hergestellt:. Verpackung Plasmid (ΔVpr.89), Umschlag Plasmid (VSV-G), haarnadel pLKO.1 und leeren Vektor}

FuGene Transfektionsreagenz in DMEM wurde nach den Anweisungen des Herstellers. Kurz gesagt wurden die Plasmide 3 tropfenweise zu der Fugene und DMEM zugegeben und gemischt. Das Gemisch wurde dann für 20-30 min inkubiert. bei Raumtemperatur. Das Transfektionsgemisch wurde dann in den Verpackungszellen vorsichtig zugegeben. Die Zellen wurden für ca. 18 h inkubiert. Die Transfektionsmedien wurde dann verworfen am nächsten Morgen und ersetzt mit hohem Wachstum Medien. Die Zellen wurden für 24 h inkubiert. Lentiviren haltigen Medien wurde geerntet containingand zusätzliche wachstumsstarke Medien hinzugefügt. Zellen wurden 24 h inkubiert und das Medium geerntet. Typische Sammlung war für 2-3 Zeitpunkten. Alle Virusernten wurden gepoolt.

Lentivirus-Infektion von AGS-Zellen.

AGS-Zellen wurden auf etwa 50% Konfluenz gezüchtet. Die viralen Überstände wurden mit Polybren zugesetzt. Zwölf Stunden nach der Infektion wurde die virale Medien entsorgt und ersetzt mit viralen Medien inokuliert und für weitere 12 h. Das Medium wurde verworfen und mit Ham-F12-Medium ersetzt. Die Zellen wurden für 24 h inkubiert. Zellen wurden in Selektionsmedien aufgeteilt Puromycin enthält, und für 24 h inkubiert.

Statistical Methods

Alle Zellkulturexperimenten mindestens 3-mal wiederholt wurden, wenn nicht anders angegeben, und gepaarte t- Tests wurden verwendet, statistische Signifikanz zu bestimmen.

Ergebnisse

• PLoS ONE: Programmierte Chemotherapie bei Patienten mit metastasierenden inoperablem Magen Cancer
• PLoS ONE: Quantitative Messung von organischen Säuren in Gewebe von Patienten mit Magenkrebs Zeigt an, dass Glukose-Stoffwechsel im Magen Cancer