PLOS ONE: règlement de RKIP Fonction par Helicobacter pylori dans l'estomac Cancer

Résumé

Helicobacter pylori (H. pylori)
est une bactérie en forme de spirale Gram négatif qui infecte plus de la moitié de la population mondiale et est une cause majeure de l'adénocarcinome gastrique. Les mécanismes qui lient H. pylori de l'infection à la cancérogenèse gastrique ne sont pas bien compris. Dans la présente étude, nous annoncer que la protéine inhibitrice Raf-kinase (RKIP) a un rôle dans l'induction de l'apoptose par H. pylori
dans les cellules épithéliales gastriques. Western blot tests et la luciférase transcription rapporteurs démontrent que l'îlot de pathogénicité de H. pylori
phosphoryle rapidement RKIP, qui localise ensuite vers le noyau où il active son propre transcription et induit l'apoptose. surexpression forcée de RKIP améliore l'apoptose dans H. pylori
cellules infectées par, alors que l'inhibition de l'ARN RKIP supprime l'induction de l'apoptose par H. pylori
infection. Bien que l'induction de la phosphorylation de RKIP, H. pylori
cibles simultanément RKIP non phosphorylée de la dégradation par le protéasome. L'augmentation de la transcription et de RKIP phosphorylation est abrogée par mutation RKIP sérine 153 à la valine, ce qui démontre que la réglementation de l'activité RKIP par H. pylori
dépend du résidu S153 de RKIP. En outre, H. pylori de l'infection augmente l'expression de Snail, un répresseur transcriptionnel de RKIP. Nos résultats suggèrent que H. pylori
utilise une protéine suppresseur de tumeur, RKIP, afin de promouvoir l'apoptose dans les cellules cancéreuses gastriques

Citation:. Moen EL, Wen S, Anwar T, Cross-Knorr S, K Brilliant, Birnbaum F, et al . (2012) Règlement de RKIP Fonction par Helicobacter pylori
dans le cancer gastrique. PLoS ONE 7 (5): e37819. doi: 10.1371 /journal.pone.0037819

Editeur: Yoshio Yamaoka, Veterans Affairs Medical Center (111D), États-Unis d'Amérique

Reçu 30 Décembre 2011; Accepté: Avril 24 2012; Publié: 25 mai 2012 |

Droit d'auteur: © 2012 Moen et al. Ceci est un article en accès libre distribué sous les termes de la licence Creative Commons Attribution, qui permet une utilisation sans restriction, la distribution et la reproduction sur tout support, à condition que l'auteur et la source originelle sont crédités

Financement:. Ce travail a été soutenue par l'Institut national de sciences médicales générales du national Institutes of Health sous Award Nombre P20GM103421 (DC); le segment précédent de ce projet a été soutenu par le National Center for Research Resources (NCRR) sous P20 RR 017695 (DC), R01 CA111533 (SFM) et R21 CA133601 (JMS). Les bailleurs de fonds ont joué aucun rôle dans la conception de l'étude, la collecte et l'analyse des données, la décision de publier, ou de la préparation du manuscrit

Intérêts concurrents:.. Les auteurs ont déclaré aucun conflit d'intérêts existent

Introduction

le cancer gastrique est le quatrième cancer le plus fréquemment diagnostiqué dans le monde. En 2007, environ un million de nouveaux cas de cancer gastrique conduisant à environ 800 000 décès dans le monde ont été enregistrés, ce qui en fait la deuxième cause la plus fréquente de décès par cancer [1]. Le cancer gastrique est actuellement la septième cause de décès par cancer aux États-Unis, avec environ 21.500 nouveaux cas diagnostiqués en 2011 (http://www.cancer.gov/cancertopics/types/stomach). La, en forme de spirale bactérie gram-négative Helicobacter pylori (H. pylori)
infecte plus de la moitié de la population mondiale et a été identifié comme un facteur de risque majeur dans la carcinogenèse gastrique [2]. L'Organisation mondiale de la Santé et l'Agence internationale pour la recherche sur le cancer désignés comme une classe I carcinogène en 1994 [3]. Notre compréhension actuelle de H. carcinogenèse induite par des pylori est que la bactérie et la réponse inflammatoire chronique associée à favoriser la mort des cellules épithéliales gastriques par apoptose [4], avec la suite hyperprolifération [5], et la production de radicaux libres [6], qui toutes contribuent à une séquence lente et progressive des changements de la muqueuse gastrique qui favorisent finalement la progression vers un cancer. Ce modèle est compatible avec les rapports que les polymorphismes de gènes de cytokines pro-inflammatoires qui augmentent l'intensité de la réponse inflammatoire sont liés à un risque accru de cancer gastrique [7].

H. pylori
adhère étroitement aux cellules épithéliales gastriques et peut induire directement l'apoptose [8]. Le cag (gène cytotoxique associé) îlot de pathogénicité (cag PAI) de H. pylori
kB est un segment d'ADN 40 qui contient les gènes codant pour des composants d'un système de sécrétion bactérienne de type IV [9]. Dans cette région est le gène
cagA qui code CagA, une protéine immunodominante de 121-145 kDa [9]. H. Les souches pylori de possédant et exprimant le cag PAI sont plus souvent associés à la maladie de l'ulcère gastro-duodénal et le cancer gastrique dans les populations occidentales que les souches qui ne sont pas [9]. Lors de son injection par l'intermédiaire du système de sécrétion de type IV dans les cellules épithéliales gastriques hôtes, CagA peut ensuite devenir phosphorylée par les tyrosine kinases de la famille Src à son extrémité C-terminale [10], ce qui conduit CagA pour lier et activer SHP2 et signal via ERK [11]. Surtout, CagA est également responsable de l'activation du transducteur de signal et activateur de la transcription 3 (STAT3) in vitro
et in vivo
[12], bien que cela ne soit pas nécessairement dépendre de CagA phosphorylation [11]

protéines STAT sont constitutivement exprimées dans plusieurs néoplasmes, y compris l'estomac, du sein, la tête et le cou, et les cancers de la prostate [13] - [16].. Lors de la phosphorylation de la tyrosine 705 au résidu et acétylation de la lysine 685, dimérise STAT3 et pénètre dans le noyau où il fonctionne pour réguler la transcription d'un large éventail de gènes [17], [18]. l'activation constitutive de la protéine STAT3 a été montré pour prévenir l'apoptose et à augmenter la prolifération cellulaire et la métastase dans de nombreux cancers, notamment le cancer gastrique [19], [20].

L'une des caractéristiques de la progression tumorale gastrique est le acquisition de phénotypes plus invasives et migratoires au cours de la transition épithéliale-mésenchymateuse (EMT). Au cours de l'EMT, les cellules epitheliales gastriques subissent des changements phénotypiques, caractérisé par la perte de molécules d'adhésion cellulaire, en particulier la Cadherine epitheliale (E-cadhérine) [21]. L'escargot facteur de transcription, une protéine à doigt de zinc a été précédemment caractérisée comme un régulateur important de l'EMT en raison de son activation par le facteur nucléaire kappa bêta (NF-kB) [22] et la répression subséquente de la E-cadhérine dans les cellules tumorales épithéliales [ ,,,0],23], [24]. En outre, les études en utilisant un gain de fonction et de la perte de fonction des approches ont identifié Snail comme répresseur de RKIP transcription dans les cellules cancéreuses de la prostate métastatique [25].

RKIP est un membre de la protéine phosphatidyléthanolamine liaison famille et un régulateur négatif de la (Kinase extracellulaires signal-Regulated) ERK1 /2 [26], NF-kB [27] et GRK (G Protein-Coupled Receptor Kinase) [28] voies. RKIP joue donc un rôle important dans la régulation de la survie cellulaire et l'apoptose, ainsi que la potentialisation de l'efficacité des agents chimiothérapeutiques [29]. RKIP a également été identifiée comme une protéine suppresseur des métastases [30] et chez des patients atteints d'adénocarcinomes gastriques, il existe une corrélation positive entre l'expression de RKIP et la survie du patient et une corrélation inverse entre l'expression de RKIP et STAT3 [19]. l'expression et la fonction RKIP peuvent être réglées par des modifications post-traductionnelles. Par exemple, la phosphorylation de RKIP par la protéine kinase C, à la sérine-153 empêche la capacité RKIP à se lier à sa molécule cible, inactivant ainsi la fonction RKIP [31]. En outre, la répression RKIP via la méthylation du promoteur peut être surmonté par les inhibiteurs de désacétylases méthylation et histones [25].

En raison des rôles importants de RKIP, STAT3 et H. pylori
dans la pathogenèse du cancer gastrique, nous avons examiné si H. pylori
signaux à travers RKIP. Nos études suggèrent que l'interaction complexe entre les H. cagPAI de
pylori, RKIP, STAT3 et Snail agit pour dysréguler gastrique apoptose des cellules épithéliales par modulation de la fonction de RKIP, un mécanisme qui définit un rôle central pour RKIP dans H. pylori de carcinogenèse gastrique -Associated.

Matériel et méthodes

Réactifs

Tous les réactifs et les produits chimiques ont été achetés auprès de Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO), à moins indication contraire. MG-132 a été achetée chez Calbiochem (Gibbstown, NJ) dissous dans du DMSO et utilisé à une concentration de 10 mM. Interleukine-6 ​​(IL-6) a été acheté auprès de BD Biosciences (San Diego, CA). des réactifs de quantification de protéines ont été obtenus auprès de Bio-Rad Laboratories, Inc. (Hercules, CA). des réactifs de chimioluminescence améliorés et de souris et de lapin secondaires de raifort conjugués à la peroxydase pour une analyse par transfert de Western ont été de GE Healthcare (Piscataway, NJ). L'actine-HRP, phosphorylée-RKIP (pRKIP) et les anticorps STAT3 ont été achetés à Santa Cruz Biothechnology (Santa Cruz, CA). Les anticorps à STAT3 pS727 et pY705 et PARP ont été achetés auprès de Cell Signaling Technology (Beverly, MA) et l'anticorps à RKIP de Millipore, Billerica, MA. L'anticorps à Snail a été acheté chez Abcam (Cambridge, MA).

Cellules et Plasmides

La gastrique lignée cellulaire de carcinome humain AGS (CRL-1739) a été acheté chez American Type Culture Collection (Manasas , VA). cellules MKN28 ont été donnés par le Dr Richard Peek, Université Vanderbilt, Nashville, TN et ont été initialement achetés à Riken banque de cellules, Ibaraki, Japon. Les plasmides d'expression pour pcDNA3, c-myc STAT3, CMV-HA-RKIP (HA-RKIP) et CMV-HA vecteur vide (EV) ont été décrits [18], [26]. Le plasmide RKIP S153V a été fourni par le Dr Marsha Rosner, Université de Chicago, Chicago, IL.

H. pylori
Souches et

de type sauvage H de la culture Conditions. Les souches pylori ou de isogénique H. Les mutants de pylori ont été co-cultivées avec l'AGS ou MKN lignées de cellules gastriques comme décrit précédemment [32] à une multiplicité d'infection (MOI) de 100:1 dans toute expérience, sauf indication contraire.

Transfection les cellules AGS

cellules AGS ont été transitoirement transfectées en utilisant le réactif GenJet plasmide de transfection (Signagen Laboratories, Gaithersburg, MD) selon le protocole du fabricant pour un format de plaque à 6 puits. les quantités totales d'ADN comprises entre 1 et 2 ug ont été transfectées par échantillon. les conditions de transfection ont été évaluées et optimisées par l'analyse des cellules transfectées avec une protéine fluorescente verte (GFP) exprimant RKIP plasmide. efficacités de transfection étaient toujours dans la gamme 75-85%.

Extraction des protéines et analyse par Western Blot

Les extraits cellulaires totaux et des fractionnements subcellulaires ont été préparés et immunotransférés comme décrit précédemment [29], [32 ]. Les concentrations en protéines ont été déterminées en utilisant le BCA Protein Assay (Thermo Scientific). Densitométrie de Western blots a été effectuée selon le protocole figurant sur le site suivant:. Http://lukemiller.org/journal/2007/

PCR en temps réel

Deux pg d'ARN a été converti en ADNc en utilisant First Strand-Kit RevertAid de synthèse d'ADNc (Thermo Scientific). PCR quantitative en temps réel a été réalisée en utilisant 2 x Qiagen QuantiFast SYBR Green I (Roche). Les amorces pour Snail étaient avant: AGCTCTCTGAGGCCAAGGATCT, inverse: TGTGGCTTCGGATGTGCAT et bêta-actine: avant: CTGGCACCACACCTTCTACAA, inverse: CAGCCTGGATAGCAACGTACA. Les temps de profils typiques suivantes ont été utilisées pour 40 cycles: une étape initiale à 95 ° C pendant 10 min, puis 95 ° C pendant 15 s et 60 ° C pendant 1 min. Le niveau d'expression relative a été calculé selon la méthode 2-ΔΔCT comme décrit précédemment [33].

STAT3 et

Cellules RKIP rapporteur luciférase Essais de (2 x 10 ^{5 cellules /puits dans des plaques de 6 puits) ont été transitoirement transfectées avec 0,1 pg (STAT3 RKIP) ou 0,05 ug (NF-kB) d'un plasmide rapporteur contenant soit la liaison STAT3 SIE-fragment de la région promotrice du gène de IRF1 de souris (p2xSIE-Luc) ou la région promotrice de RKIP ainsi que les plasmides indiqués tels que décrits précédemment [18]. Environ 24 h après la transfection, les cellules ont été traitées avec le médicament indiqué ou infectés par H. pylori
nuit ou non traitée. L'activité de la luciférase dans le surnageant cytosolique a été évaluée en utilisant le dosage de rapporteur de luciférase (Promega) et mesurée en utilisant un luminomètre pour estimer l'activité de transcription [18].}

Dosages
Apoptose

L'apoptose a été quantifiée dans des essais séparés par cytométrie en flux et la fragmentation de l'ADN ELISA. Pour cytométrie en flux, le pourcentage de cellules apoptotiques (sub-G _{O) a été déterminée par analyse cytométrique en flux de iodure de propidium colorées des cellules [29]. Cytoplasmique fragmentation de l'ADN histone-associé a été mesurée avec la cellule kit mort Détection ELISA Plus (Roche, Indianapolis, IN) selon les instructions du fabricant.}

cytoplasmique fragmentation de l'ADN histone associé a été mesurée avec la mort cellulaire de détection ELISA plus kit (Roche, Indianapolis, IN) selon les instructions du fabricant. Les expériences ont été répétées 3 fois et réalisés en double.

Knockdown Lentivirus médiée de RKIP Lentivirus construit.

pLKO.1 puro résistance lentiviral construire RHS3979-97070798 et RHS3979-98492779 ont été achetés de l'Open Biosystems (Huntsville, AL). Les produits d'assemblage contiennent un marqueur de sélection et la puromycine ont été cultivées dans du bouillon de Luria contenant de l'ampicilline à 37 ° C. Le bouillon a été centrifugé à 10.000 x g
pendant 10 min. et le surnageant mis au rebut. L'ADN à partir des pastilles a été purifié en utilisant le kit QIAGEN Plasmid plus Maxi.

Production Lentivirus.

cellules d'emballage 293T ont été ensemencées dans des milieux à faible croissance antibiotique (DMEM, 10% inactivé par la chaleur FBS, 0,1 × pénicilline /Strepomycin /Glutamine). Les cellules ont été incubées pendant 24 h (37 ° C, 5% CO _{2) ou jusqu'à ce qu'ils soient environ ~ 70% de confluence. Les médias sur les cellules d'emballage 293T a été remplacé par les médias de croissance contenant DMEM. Un mélange des plasmides de transfection ont été préparés comme suit: le plasmide d'emballage (ΔVpr.89), l'enveloppe plasmide (VSV-G), en épingle à cheveux et pLKO.1 vecteur vide}

FUGENE réactif de transfection a été préparé dans un milieu DMEM en fonction. aux instructions du fabricant. En bref, les 3 plasmides ont été ajoutés goutte à goutte au FUGENE et DMEM et mélangés. Le mélange est ensuite laissé à incuber pendant 20 à 30 min. à température ambiante. Le mélange de transfection a été ensuite ajouté avec précaution les cellules d'encapsidation. Les cellules ont été incubées pendant environ 18 h. Le milieu de transfection a ensuite été jeté le lendemain matin et remplacé par un milieu à forte croissance. Les cellules ont été incubées pendant 24 h. containingand lentivirus contenant des médias a été récolté des médias à forte croissance supplémentaire ajouté. Les cellules ont été incubées pendant 24 h et les milieux récoltés. la collecte était typique pour 2-3 points de temps. Toutes les récoltes virales ont été regroupées.

infection lentivirus des cellules AGS.

cellules AGS ont été cultivées à environ 50% de confluence. Les surnageants viraux ont été ajoutés avec le polybrène. Douze heures après l'infection, les médias virale a été jetés et remplacés par les médias viraux et incubées pendant encore 12 h. Le milieu a été jeté et remplacé par un milieu F12 de Ham. Les cellules ont été incubées pendant 24 h. Les cellules ont été divisées dans des milieux de sélection contenant de la puromycine et on les laisse incuber pendant 24 h.

Méthodes statistiques

Toutes les expériences de culture cellulaire ont été répétées au moins 3 fois, sauf indication contraire, et appairés T- des tests ont été utilisés pour déterminer la signification statistique.

Résultats

H. pylori de l'infection augmente Phosphorylation de

Le RKIP de RKIP inhibe plusieurs voies de survie cellulaire, y compris ceux médiés par NF-kB et Jak /STAT [22]. Pour élucider l'effet de H. pylori de l'infection sur RKIP dans les cellules gastriques, les cellules AGS ont été infectés par H. pylori
et récolté 2 h et 6 h plus tard. Comme on le voit sur la Fig. 1A, les niveaux de RKIP phosphorylée (pRKIP) étaient élevées après 2 h (3.126 fois) et 6 h (2,9 fois) après H. pylori de l'infection alors que l'expression de la protéine RKIP totale a augmenté de 1,4 fois après 2 h et 1,75 fois après 6 h de H. pylori
infection. Des résultats similaires ont également été obtenus avec des cellules de cancer gastrique MKN (voir Figure S1).

H. pylori
induite par phosphorylation de PKC RKIP est dépendante

La phosphorylation de la serine 153 sur RKIP par la protéine kinase C (PKC) abolit son aptitude à se lier Raf et d'inhiber la signalisation MAP-kinase en aval [31]. Nous avons examiné si la phosphorylation de RKIP par H. pylori
était PKC-dépendante. les cellules AGS ont été infectées avec H. pylori
pendant 6 h, en présence ou en l'absence de 40 uM bisindolylmaléimide (Bis, un inhibiteur de PKC). Nos résultats indiquent que les niveaux de RKIP phosphorylée a été inhibée 3,9 fois et RKIP 1,36 fois après H.
pylori infection en présence de l'inhibiteur de la PKC, suggérant que la phosphorylation par RKIP H. pylori
implique, mais peut-être pas entièrement dépendant, la voie de la PKC-régulée (Fig. 1B).

IL-6 Induit Phosphorylation de RKIP et H. pylori
Active STAT3

Comme il existe une relation inverse entre RKIP et d'expression de STAT3 dans les échantillons de cancer gastrique [19], nous avons évalué si STAT3 et son régulateur clé de l'IL-6 [17] affecte l'expression pRKIP. IL-6 de traitement à une dose de 25 ou 50 ng /ml augmente les niveaux de protéine pRKIP 1,8 et 1,35 fois, respectivement totale et expression de la protéine a diminué de 0,8 RKIP et une augmentation de 1,05 fois, respectivement (fig. 2A). La phosphorylation de RKIP en réponse à l'IL-6 était dépendante de la PKC (données non présentées). Ces données indiquent que l'IL-6 peut également induire la phosphorylation de RKIP dans les cellules gastriques qui peuvent se produire, en partie, à une voie de la PKC-dépendante.

macrophages de cytokines de libération, y compris l'IL-6 pendant H. pylori de l'infection [34] conduisant à l'activation de STAT3 [17]. Pour étudier les effets de H. pylori de l'infection par l'activation de STAT3, les cellules AGS ont été transitoirement transfectée avec une construction rapporteur IRF-1 [18] et co-cultivées avec H. pylori
à la gamme de multiplicité d'infection (MOI) indiquée pendant 24 h. Nos résultats ont montré que lors d'une MOI entre 10-200:1, H.
pylori était capable d'induire la transcription STAT3 (Fig. 2C), et la phosphorylation de STAT3 pY705 (fig. 2B) dans les 6 heures de l'infection. Nous avons ensuite déterminé si l'IL-6 pourrait également stimuler la STAT3 transcription dans les cellules AGS. les cellules AGS ont été transitoirement transfectées avec l'IRF-1 et EV et c-myc-étiquetés STAT3, puis au bout de 24 h, les cellules traitées avec de l'IL-6 (50 ng /ml) ou en co-culture avec H. pylori
à MOI de 100:1. Les résultats, représentés sur la Fig. 2D démontrent que l'IL-6 (p < 0,0003) et H. pylori
(p < 0,0005) ont chacun été capables de stimuler de manière significative la transcription STAT3, un effet qui a été renforcée lorsque les cellules AGS ont été transfectées avec STAT3 et infectées avec H. pylori
(p < 0,0000023). L'amélioration de l'activation de STAT3 a été significativement augmentée lorsque les cellules AGS sont co-traitées avec de l'IL-6 et H. pylori
par rapport au traitement par l'IL-6 (p < 0,000028) ou H. pylori
(p < 0,0003). seul

phosphorylée RKIP Induit sa propre transcription

Nous avons utilisé un test rapporteur de la luciférase de RKIP pour étudier les effets de H. pylori infection
sur RKIP activité transcriptionnelle. H. augmenté de manière significative la transcription RKIP (p le lt; 0,002) du pylori avec une augmentation supérieure à 10 fois RKIP se produisant avec une surexpression et une augmentation supérieure à 16 fois avec la combinaison de H. pylori
et RKIP (p < 0,0003) (figure 3A.) par rapport aux cellules non traitées AGS transfectées avec le vecteur vide. Il y avait une augmentation significative (p < 0,0001) dans RKIP transcription avec H. l'infection et la surexpression de RKIP pylori par rapport aux cellules transfectées avec RKIP sans infection (Fig. 3A). Nous avons répété ces expériences en présence de bis pour inhiber l'activité de la PKC pour déterminer l'augmentation de la transcription RKIP était due à la phosphorylation. En présence de l'inhibiteur de la PKC, H. pylori
augmenté RKIP transcription et RKIP surexpression a également donné lieu à l'amélioration de l'activité du promoteur de RKIP. Bis diminuée RKIP transcription induite par RKIP surexpression et H. L'infection par pylori de plus de 4 fois, par rapport aux cellules dans RKIP avec surexpression et suggère que ces effets étaient dépendant RKIP phosphorylation (Fig. 3A). Nous avons examiné la localisation de RKIP après H. pylori
infection. Immunotransfert des fractions subcellulaires de cellules AGS ont démontré que pRKIP est localisée dans le noyau tandis que RKIP reste principalement dans le cytosol après l'infection (Fig. 3B). Ensemble, ces données impliquent que H. pylori
peut favoriser la translocation de pRKIP dans le noyau où il peut activer la transcription RKIP.

H. induite par RKIP Phosphorylation de pylori Dépend H. CAG de pylori
Île pathogénicité et RKIP sérine 153

Afin d'évaluer le rôle de spécifique H. Les facteurs pylori de dans la phosphorylation de RKIP, de type sauvage H. pylori
et mutants isogéniques manquant l'ensemble cag PAI ou
OIPA
gène ont été co-cultivées avec des cellules AGS pendant 6 h. Le H. pylori de mutant dépourvu du cag PAI
était incapable d'induire RKIP phosphorylation, alors que le type tache sauvage et le OIPA
mutant phosphorylation RKIP fortement induite (Fig. 4A). La même tendance a été observée sur STAT3 pY705. Ces résultats suggèrent que les gènes dans H.
les cagPAI de pylori sont nécessaires pour l'induction de RKIP et STAT3 phosphorylation.

Pour vérifier si la mutation de la sérine 153 affecte H. pylori
médié par phosphorylation et activation de la transcription RKIP, les cellules AGS ont été transitoirement transfectées avec une construction RKIP dans laquelle la sérine a été substitué par la valine en position 153 (S153V), puis co-cultivées avec H. pylori
. Encore une fois, nous avons observé une plus grande puis 16 fois augmentation de l'activité de promoteur RKIP dans les cellules avec RKIP surexpression et H. infection (p <la; 0,0005) de pylori. Cependant, dans les cellules transfectées avec RKIP S153V avant H. pylori de l'infection, il y avait une réduction de 2,5 fois de l'activité transcriptionnelle (p < 0,0003) par rapport à la H. cellules pylori de l'infection dans les type sauvage RKIP surexprimant (Fig. 4C). En outre, la surexpression de S153V RKIP inhibée H. médié RKIP phosphorylation de pylori (Fig. 4B). Pris ensemble, ces résultats indiquent que l'activation de la phosphorylation et de la transcription dépend RKIP H. Le
cagPAI et aussi sur la phosphorylation de RKIP au S153.

H de pylori. Infection Résultats de pylori dans RKIP Dégradation et l'induction de Snail

Parce que la transcription accrue de RKIP induite par H. pylori de l'infection n'a pas été associée à une augmentation l'état d'équilibre de la protéine RKIP totale expression, nous avons examiné si H. pylori
pourrait augmenter simultanément la vitesse de dégradation de la protéine RKIP par la dégradation par le protéasome, comme suggéré précédemment [35]. MG132 taux de protéine RKIP augmentée en présence ou en l'absence de H. pylori
infection, compatible avec H. pylori
dégradation croissante de protéasome RKIP (Fig. 5A).

Un autre mécanisme qui pourrait rendre compte de l'absence de changement dans la protéine RKIP ou l'expression de l'ARNm serait répression de la transcription de RKIP après H. pylori
infection. Escargot est un facteur de transcription qui joue un rôle important dans EMT [23], ainsi que d'être un répresseur de transcription connus de RKIP dans les cellules cancéreuses de la prostate [25]. Pour étudier les effets de H. pylori de l'infection sur l'expression de Snail et RKIP, les cellules AGS ont été co-cultivées avec H. pylori
à une MOI de 100. Snail expression de l'ARNm a été fortement induite après 2-4 h d'infection (Fig. 5D) analyse Western blot a indiqué que H. pylori de l'infection a entraîné une augmentation dépendant du temps et de la dose des niveaux de protéine d'escargot (Fig. 5B /C). Ce résultat ne correspond pas à nos données sur RKIP transcription après H. pylori infection
(Fig. 3) et suggère que H. pylori de l'infection peut dans l'induction de la protéine (s) qui abroge l'effet de Escargot sur RKIP transcription. Nous étudions actuellement cette possibilité par une analyse spectrométrie de masse en utilisant des cellules parentales et RKIP knockdown (Fig. 6).

RKIP améliore H. pylori
médiée Apoptose

H. pylori
induit gastrique apoptose des cellules épithéliales [8]. Depuis RKIP peut favoriser l'apoptose [29], nous avons examiné si l'induction de pRKIP après H. pylori de l'infection, pourrait être responsable de H. pylori
l'apoptose induite. les cellules AGS ont été transitoirement transfectées avec RKIP ou un vecteur vide, infecté par H. pylori
pendant 16 h et l'apoptose évalués via PARP clivage par cytométrie de flux et de fragmentation de l'ADN. Dans certaines expériences RKIP a été inhibée par lentivirus médiée RKIP knockdown. Comme on le voit sur la Fig. 6A, H
. pylori
induit le clivage de PARP, un effet qui a été augmentée par l'expression ectopique de RKIP. Cytométrie de flux a indiqué que H. pylori de l'infection a entraîné une augmentation d'environ 4 fois dans l'apoptose (p < 0,0008), RKIP surexpression, une augmentation de 3 fois (p < 0,003) et la combinaison d'une augmentation de 6 fois (p < 0,0005) par rapport à les cellules AGS non traitées (Fig. 6B). Dans le test de fragmentation de l'ADN à base d'ELISA, l'activité apoptotique accrue: 2,5 fois (p < 0,000063) dans les cellules infectées par H. pylori
; 1,8 fois (p < 0,006) dans les cellules transfectées transitoirement avec RKIP; et 3,5 fois (p < 0,0007) avec la combinaison (figure 6C.). Pour déterminer si RKIP était responsable de H. l'apoptose médiée par pylori, on a supprimé l'expression RKIP en utilisant l'ARN d'inhibition de lentivirus médiée et a observé une diminution des taux de protéine RKIP par analyse par transfert de Western démontrant la réduction de RKIP dans brute et H.pylori infectées cellules AGS (Fig. 6D). Dans notre analyse de la fragmentation de l'ADN dans les cellules AGS parentales H. pylori de l'infection a entraîné une augmentation de 2 fois (p < 0,0007) dans l'apoptose (figure 6E.). Dans les RKIP knockdown cellules AGS, H. pylori de l'infection a entraîné une augmentation de 1,5 fois dans l'apoptose (p < 0,003) (Fig. 6E). La réduction de l'apoptose des cellules AGS entre les parents et RKIP knockdown était statistiquement significative (p < 0,0006). Ces résultats indiquent que RKIP est nécessaire pour H. pylori
apoptose médiée.

Discussion

La gastrite chronique et le renouvellement cellulaire altéré induits par H. pylori de l'infection à promouvoir le développement de l'adénocarcinome gastrique distal [36]. H. pylori
peut réguler gastrique épithéliale l'apoptose par plusieurs mécanismes. Par exemple, après l'infection et l'adhésion aux cellules epitheliales gastriques, le système de sécrétion cag sert à modifier la transduction du signal intracellulaire entraînant l'activation du NF-kB. NF-kB peut translocation vers le noyau pour activer la transcription des gènes pro-apoptotiques [37]. H. pylori
peut également induire l'apoptose par l'expression de FAS et son ligand (FASL) en augmentant conduisant à l'activation de la voie extrinsèque d'apoptose [38]. Paradoxalement, H. pylori
peut également activer des voies qui régulent à la baisse l'apoptose [39], en particulier tard dans l'évolution de l'infection chronique [40]. Cette réponse adaptative des cellules épithéliales de résister à l'apoptose dans les chroniques H. pylori de l'infection peut contribuer à H. pylori de carcinogenèse gastrique induite [41]. La réponse apoptotique des cellules épithéliales gastriques à H. pylori
dépend également de facteurs de virulence spécifiques de la souche. Par exemple, l'infection par des souches de PAI-positif cag peut induire l'apoptose plus rapidement que cag souches de PAI-négatives [42]. Le H. Le produit du gène pylori vacA de stimule la voie apoptotique intrinsèque conduisant à la libération mitochondrial du cytochrome c, et de la caspase-3 activation [43]. l'apoptose induite par VacA est associée à une réduction de STAT3 conduisant à la régulation négative de la protéine Bcl-2 et Bcl-X _{L [43]. Dans une autre étude, il a été démontré que H. pylori
induit l'apoptose par une voie impliquant l'induction séquentielle de l'activité apicale caspase-8, activité caspase-3 les protéines pro-apoptotiques Bad et Bid, l'activité de la caspase-9, et effecteur [44].}

Notre étude décrit un autre mécanisme par lequel H. pylori de l'infection peut favoriser l'apoptose dans des cellules cancéreuses de l'estomac, notamment en favorisant la phosphorylation RKIP. La capacité de RKIP à inhiber la signalisation Raf /MAPK [26], [27] et à favoriser l'apoptose est bien documenté [29]. L'interaction entre les voies et les thèses niveaux d'expression de RKIP a été impliquée dans de nombreuses étapes de formation de tumeurs et /ou de la progression [30]. En outre, la surexpression des résultats RKIP dans l'inhibition des métastases et l'invasivité dans différents modèles de tumeurs [45] - [48]. Le mécanisme sous-jacent de l'expression différentielle de pRKIP et RKIP est inconnue. Nous nous attendions à ce que des niveaux relativement élevés de pRKIP après l'infection pourraient en corrélation avec les niveaux de RKIP inférieurs. Cependant, nous avons constaté que H. pylori de l'infection a entraîné la dégradation de la protéine RKIP, permettant éventuellement MAPK signalisation et induction de l'apoptose dans le cancer gastrique après H. pylori
infection. PKC-médiée RKIP phosphorylation peut perturber la capacité de RKIP de se lier à Raf et inhiber la signalisation MAPK [31], cependant, il n'y a pas eu auparavant aucun rapport sur le rôle de pRKIP dans la régulation de l'apoptose. Des études antérieures de notre laboratoire ont montré que les résultats RKIP surexpression dans l'activation directe de la pro-caspase 8 [29]. Bien que les résultats de phosphoryation à re-localisation nucléaire, suivie par l'activation du RKIP de sa propre transcription, les niveaux de protéine RKIP ne pas augmenter. Cela suggère un mécanisme différent de la réglementation des RKIP que ce qui a été rapporté précédemment. Nous examinons actuellement le mécanisme par lequel pRKIP déclenche l'apoptose dans les cellules cancéreuses gastriques après H. pylori de l'infection.

Cag positif H. pylori
les gènes significativement régulation positive de l'EMT associée Snail, Slug et vimentine en association avec l'induction de MMP-7, ce qui suggère un rôle de ces protéines dans le développement du cancer gastrique [49]. Dans notre étude, nous avons observé l'induction rapide de la protéine pRKIP après H. pylori de l'infection, et une augmentation de la transcription RKIP et une régulation positive de l'ARNm d'escargot et d'expression de la protéine. Bien que Snail a été identifié comme un répresseur transcriptionnel de RKIP [25], notre étude indique qu'il a probablement pas d'effet sur la forme phosphorylée de RKIP, puisque, après l'infection, nous n'avons pas observé une répression de la transcription RKIP.

Infections avec des souches de H cagPAI-possession. pylori
sont associés à une réponse inflammatoire plus forte dans l'estomac et posent un plus grand risque de développer des ulcères gastro-duodénaux ou cancer de l'estomac que les souches dépourvues de l'île de cag [36]. H. pylori
induit une réponse inflammatoire et intense des niveaux localement élevés de plusieurs cytokines, y compris l'interleukine 6 (IL-6) [34].

• PLOS ONE: Programmed chimiothérapie pour les patients atteints de métastases inopérables Cancer gastrique
• PLOS ONE: Mesure quantitative des acides organiques dans les tissus de patients atteints de cancer gastrique indique une augmentation de métabolisme du glucose dans le cancer gastrique