PLoS ONE: reglamentavimas RKIP funkciją Helicobacter pylori skrandžio vėžio

Anotacija

Helicobacter pylori (H. pylori)
yra Gram-neigiamas, spiralės formos bakterija, kuri užkrečia daugiau kaip pusė pasaulio gyventojų ir yra pagrindinė priežastis, skrandžio adenokarcinoma , Mechanizmai, kurie nurodo H. pylori
infekcijos skrandžio kancerogenezėje nėra gerai suprantama. Šiame tyrime mes pranešti, kad Raf-kinazės inhibitorius baltymų (RKIP) turi vaidmenį apoptozės indukcija H. pylori
skrandžio epitelinių ląstelių. Vakarų dėmė ir liuciferazės transkripcija Reporter tyrimai rodo, kad patogeniškumo sala H. pylori
greitai fosforilina RKIP, kuris vėliau localizes į branduolį, kur jis aktyvuoja savo transkripciją ir indukuoja apoptozę. Priverstinis padidėjusią RKIP pagerina apoptozę H. pylori
-infected ląsteles, o RKIP RNR slopinimas slopina apoptozę indukcijos H. pylori
infekcija. Nors paskatinti iš RKIP fosforilinimo H. pylori
vienu metu skirta ne fosforilinto RKIP už proteasomos tarpininkaujant degradacija. Į RKIP transkripcijos ir fosforilinimo padidėjimas panaikina mutavo RKIP serino 153 Valinas, parodant, kad RKIP veiklos reglamentavimą H. pylori
priklauso nuo RKIP anketa S153 likučių. Be to, H. pylori
infekcija padidina sraigė, transkripcijos slopinančioje iš RKIP išraiška. Mūsų rezultatai rodo, kad H. pylori
naudoja auglio slopinamojo baltymų, RKIP, skatinti apoptozę skrandžio vėžio ląstelių

nurodomoji dalis:. Moen EL Wen S Anwar T Kryžminis Knorr S Briliantas K Birnbaumas F ir kt , (2012) reguliavimas RKIP funkciją Helicobacter pylori pervežimas skrandžio vėžio. PLoS vieną iš 7 (5): e37819. Doi: 10,1371 /journal.pone.0037819

redaktorius: Yoshio Yamaoka, Veteranų reikalų medicinos centras (111D), Jungtinės Amerikos Valstijos

Įstojo: Gruodžio 30, 2011 m Priėmė: Balandžio 24, 2012 m Paskelbta: Gegužės 25, 2012

Visos teisės saugomos: © 2012 Moen ir kt. Tai atviros prieigos straipsnis platinama pagal Creative Commons Attribution licencija, kuri leidžia nevaržomai naudotis, paskirstymo ir dauginimąsi bet kokioje laikmenoje sąlygomis, su sąlyga, kad pirmasis autorius ir šaltinis įskaitomos

Finansavimas:. Šis darbas parėmė nacionalinio instituto bendrosios medicinos mokslų National Institutes of Health pagal Award skaičius P20GM103421 (DC); ankstesnis segmentas šį projektą parėmė Nacionalinės tyrimų centras išteklių (NCRR) pagal P20 RR 017.695 (DC), R01 CA111533 (SFM) ir R21 CA133601 (JMS). Į finansuotojai neturėjo vaidmenį studijų dizainas, duomenų rinkimo ir analizės, sprendimų skelbti, ar ruošiant rankraštį

konkuruojančių interesų.. Autoriai pareiškė, kad nėra konkuruojantys interesai egzistuoja

Įvadas

Skrandžio vėžys yra ketvirtas dažniausiai diagnozuojama piktybinis navikas pasaulyje. 2007, maždaug vienas milijonas naujų skrandžio vėžio atvejų lemia maždaug 800.000 mirčių visame pasaulyje buvo įrašyti, todėl antra dažniausia mirties nuo [1] vėžiu. Skrandžio vėžys šiuo metu yra septintas pagrindinė priežastis, dėl mirčių nuo vėžio JAV, su maždaug 21.500 naujų atvejų diagnozuota 2011 (http://www.cancer.gov/cancertopics/types/stomach). Gramo-neigiamas, spiralės formos bakterija, Helicobacter pylori (H. pylori)
užkrečia daugiau kaip pusė pasaulio gyventojų, ir buvo nustatyta, kad pagrindinis rizikos veiksnys skrandžio [2] kancerogenezėje. Pasaulio sveikatos organizacija ir Tarptautinė tyrimų agentūra vėžio paskirta jį kaip I klasės kancerogenams 1994 [3]. Mūsų dabartinis supratimas H. pylori
indukuotų karcinogeneze yra tai, kad bakterija ir su ja susijusi lėtinė uždegiminė reakcija skatinti skrandžio epitelio ląstelių žūtį apoptozės [4], su vėlesnio hiper-platinimo [5], ir laisvųjų radikalų gamybos [6] visi veiksniai, kurie didina lėtas ir laipsniškas seka pokyčius skrandžio gleivinės, kad galiausiai pirmenybė teikiama progresavimą į vėžį. Šis modelis yra suderinamas su pranešimais, kad PRO-uždegiminių citokinų genų polimorfizmas, kurie didina uždegiminio atsako intensyvumą yra susijusios su padidėjusiu skrandžio vėžio rizika [7].

h. pylori
siejasi su skrandžio epitelio ląsteles ir gali sukelti apoptozę tiesiogiai [8]. PVG (citotoksinis susijęs genas) patogeniškumas sala (CAG PAI) ir H. pylori
yra 40 KB segmentas DNR, kuriame yra genai koduotę komponentų IV tipo bakterijų sekrecijos sistemos [9]. Šiame regione yra CagA
genas, kuris koduoja CagA, baseinas imunodominantiniai baltymo 121-145 kDa [9]. h. pylori
atmainos, turintys ir išreiškiantys CAG Pai dažniau siejama su pepsinė opa ir skrandžio vėžio Vakarų gyventojų nei padermių, kad ne [9]. Po jo injekcijos per IV tipo sekrecijos sistemą į priimančiosios skrandžio epitelinių ląstelių, CagA vėliau gali tapti fosforilinamos Src šeimos tirozino kinazės savo C-galo [10], todėl CagA stringa ir aktyvuoti SHP2 ir signalas per ERK [11]. Svarbu tai, kad CagA taip pat yra atsakingas už aktyvavimo signalo keitiklių ir aktyvatorius transkripcijos 3 (STAT3) in vitro parsisiųsti ir vivo
[12], nors tai nebūtinai turi būti priklausoma nuo CagA fosforilinimo [11]

STAT baltymai constitutively išreikštas keliais navikų, įskaitant skrandžio, krūties, galvos ir kaklo, ir prostatos vėžio [13] - [16].. Upon fosforilinimo iš tirozino 705 likučių ir acetilinimo prie lizino 685, stat3 dimerizuojasi ir patenka į branduolį, kur jis funkcijas transkripciškai reguliuoti platų genų [17], [18]. Sudėtinė aktyvavimo stat3 baltymų buvo įrodyta, kad apsaugo apoptozę ir padidinti ląstelių proliferaciją ir metastazių nuo vėžinių susirgimų, įskaitant skrandžio vėžio [19], [20].

Vienas iš skrandžio naviko progresavimo požymiai yra įsigijimas daugiau invazinių ir migruojančių fenotipų epitelio-mezenchiminių perėjimo (EMT) metu. Per EMT, skrandžio epitelio ląsteles atliekami fenotipo pokyčius charakterizuojamq ląstelių adhezijos molekulių praradimo, ypač epitelio cad (E-cad) [21]. Transkripcijos faktorius sraigė, cinko pirštų baltymai, buvo būdingas anksčiau kaip svarbų reguliatorius EMT dėl savo suaktyvinimo per branduolinio faktoriaus kapa beta (NF-kB) [22] ir vėliau vykusiose E-cad epitelį vėžinių ląstelių [ ,,,0],23], [24]. Be to, tyrimai, naudojant pelnas-ir-funkcijos ir nuostolio-of-funkcija požiūriai išryškinantį sraigė kaip RKIP transkripcijos slopinančioje išplitusiam prostatos vėžinių ląstelių [25].

RKIP yra iš fosfatidiletanolamino surišančio baltymo narys šeima ir neigiamas reguliatorius iš ERK1 /2 (Ekstraceliulinis signalo reguliuojamas kinazės) [26], NF-KB [27] ir GRK (G baltymu sujungto receptoriaus kinazės) [28] keliai. tokiu būdu RKIP vaidina svarbų vaidmenį reguliuojant ląstelių išgyvenimą ir apoptozę, be to, veiksmingumą stiprinančiu į chemoterapinių agentų [29] efektyvumą. RKIP taip pat buvo identifikuota kaip metastazės slopinamojo baltymų [30], ir skrandžio adenokarcinoma sirgusių pacientų egzistuoja teigiamas ryšys tarp RKIP saviraiškos ir pacientų išgyvenimui ir atvirkštinė koreliacija tarp išraiškos RKIP ir STAT3 [19]. RKIP išraiška ir funkcija gali būti reguliuojamas potransliacinis modifikacijų. Pavyzdžiui, fosforilinimas RKIP baltymai kinazės C, serino-153 apsaugo RKIP gebėjimą surišti į savo tikslinę molekulės, taip neutralizuojant RKIP funkciją [31]. Be to, RKIP represijos per promotoriaus metilinimo galima įveikti metilinimas ir Histonas deacetilazės inhibitorių [25].

Kadangi iš svarbiausių vaidmenų RKIP, STAT3 ir H. pylori
į skrandžio vėžio patogenezės, mes tyrė, ar H. pylori
signalus per RKIP. Mūsų tyrimai rodo, kad sudėtingos sąveikos tarp H. pylori anketa cagPAI
, RKIP, STAT3 ir sraigė veikia su dysregulate skrandžio epitelio ląstelių apoptozę, keičiant RKIP funkciją, mechanizmą, kuris apibrėžia pagrindinį vaidmenį RKIP į H. pylori
-associated skrandžio Kancerogeninis.

Medžiagos ir metodai

Reagentai

Visi reagentai ir cheminės medžiagos buvo perkamos iš Sigma Chemical Co (St Louis, MO), nebent kitaip pažymėti,. "MG-132 buvo įsigytas iš CalBiochem (Gibbstown, NJ), ištirpinto DMSO ir naudotos koncentracijos 10 mm. Interleukino-6 (IL-6), buvo įsigytas iš BD biomokslų (San Diego, CA). Baltymų kiekybinio reagentai buvo gauti iš Bio-Rad Laboratories, Inc. "(" Hercules, CA). Patobulintos cheminės liuminescencijos reagentai ir vidurinio pelės ir triušio krienai peroksidazės konjuguoto Vakarų blot analizė buvo GE Healthcare (Piscataway, NJ). Aktino-HRP, fosforilinarai-RKIP (pRKIP) ir stat3 antikūnai buvo įsigytas iš Santa Cruz Biothechnology (Santa Cruz, CA). Antikūnai į stat3 pS727 ir pY705 ir PARP buvo įsigytas iš ląstelių Signalizacijos technologijos (Beverly, MA) ir antikūnų RKIP iš Millipore, Billerica, MA. Antikūnų į sraigė buvo įsigytas iš Abcam (Cambridge, MA).

elementų ir plazmidės

žmogaus skrandžio karcinoma ląstelių linija "AGS (BEL-1739), buvo įsigytas iš Amerikos tipas kultūros kolekcija (Manasas VA). MKN28 ląstelės buvo paaukoti Dr Richard Peek, Vanderbilt universiteto, Nashville, TN ir iš pradžių buvo įsigytas iš Riken Mobilusis bankas, Ibaraki, Japonija. Sąvoka plazmidės už pcDNA3, C-MYC STAT3 CMV-HA-RKIP (HA-RKIP) ir CMV-HA tuščias vektorius (EV) buvo aprašytas [18], [26]. RKIP S153V plazmidės buvo pateikta dr Marsha Rosner universiteto Čikagoje, Čikagoje, IL.

h. pylori
padermės ir kultūra sąlygos

laukinio tipo h. pylori
kamienai ar izogeninių h. pylori
mutantai buvo bendrai kultivuojamos su AGS arba MKN skrandžio ląstelių linijų, kaip buvo aprašyta anksčiau [32] esant infekcijos darinys (MOI) iš 100:1 visose eksperimento, jei nenurodyta kitaip.

transfekavimas AGS ląstelės

AGS ląstelės buvo laikinai Transfekuoti naudojant GenJet plazmidės transfekcijq reagento (Signagen laboratorijos, Gaithersburg, MD) pagal gamintojo protokolą dėl 6 šulinėlių plokštelės formatu. Iš viso DNR kiekiai tarp 1 ir 2 mikrogramai buvo transfekuota už mėginio. buvo įvertinti ir optimizuoti analizuojant ląsteles perkeltų su žaliu Liuminescencinės baltymo (GFP) -expressing RKIP plazmidės transfekcijq sąlygos. Transfekcijq našumas nuolat buvo intervale nuo 75-85%.

Baltymai gavyba ir Vakarų dėmė analizė

Iš viso ląstelių ekstraktai ir pavienių ląstelių tyri- mas fractionations buvo parengta ir immunoblotted kaip anksčiau [29], [32 aprašyta ]. Baltymų koncentracija buvo nustatoma naudojant BCA baltymų tyrimas (Thermo Scientific). Densitometry Vakarų dėmės buvo atlikta pagal išvardytų šios svetainės protokolas:. Http://lukemiller.org/journal/2007/~~HEAD=pobj

Realaus laiko PGR

Du mikrogramų RNR buvo konvertuojami į kDNR naudojant RevertAid Pirmosios kryptis kDNR sintezės komplektas (Thermo Scientific). Kiekybinis realaus laiko PGR buvo atliekama naudojant 2 x QIAGEN QuantiFast SYBR Green I (Roche). Už sraigė pradmenys buvo pirmyn: AGCTCTCTGAGGCCAAGGATCT, atvirkštinės: TGTGGCTTCGGATGTGCAT ir beta-aktino: pirmyn: CTGGCACCACACCTTCTACAA, atvirkštinės: CAGCCTGGATAGCAACGTACA. Šie tipiniai profilis kartus buvo naudojamos 40 ciklų: Pradinis žingsnis ne mažesnis nei 95 ° C temperatūroje 10 min, po to 95 ° C temperatūroje 15 s ir 60 ° C temperatūroje 1 min. Santykinis išraiška lygis apskaičiuotas naudojant 2-ΔΔCT metodu, kaip aprašyta anksčiau [33].

STAT3 ir RKIP liuciferazės Reportažai tyrimai

Ląstelės (2 × 10 ^{5 ląstelių /gerai 6-duobučių lėkšteles) buvo laikinai perkeltų 0,1 mikrogramų (STAT3, RKIP) arba 0,05 mikrogramų (NF-kB) reporterio plazmidžių, kurioje yra arba į STAT3 privalomą SIE-fragmentą promotoriaus regione pelės IRF1 geno (p2xSIE-Luc) arba RKIP promotorius regionas plius nurodyti plazmidės kaip buvo aprašyta anksčiau [18]. Maždaug 24 val po transfekciją, ląstelės buvo gydomi nurodytu narkotikų arba užsikrėtę H. pylori
naktį ar negydoma. Liuciferazės veikla citozoliniame virš nuosėdų buvo įvertintas naudojant liuciferazės reporterio testą (PROMEGA) ir matuojamas luminometer įvertinti transkripcijos veiklą [18].}

apoptozę Bandymai

Apoptozę buvo įvertintas atskiroje tyrimų tėkmės citometrijos ir DNR fragmentacijos ELISA. Dėl tėkmės citometrijos, kad apoptozinių ląstelių procentas (pa-G _{O) nulėmė tekmės citometrijos analizės propidiumo jodido tamsintas ląstelių [29]. Citoplazmos iuose susijęs DNR fragmentacija buvo matuojamas ląstelių mirtis aptikimas ELISA Plus Kit (Roche, Indianapolis, IN) pagal gamintojo instrukcijas.}

citoplazmos iuose susijęs DNR fragmentacija buvo matuojamas ląstelių mirtis aptikimas ELISA plius komplektas (Roche, Indianapolis, IN) pagal gamintojo instrukcijas. Eksperimentai buvo kartojamas 3 kartus ir atliko du kartus.

lentivirus tarpininkaujant triuškinantis iš RKIP

lentivirus konstruoja.

pLKO.1 Puro atsparumas lentiviruso statyti RHS3979-97070798 ir RHS3979-98492779 buvo įsigytas iš "Open Biosystems (Huntsville, AL). Konstruktai buvo numatyta puromicino atrankos žymenį ir buvo auginamos Luria sultinys, kurių sudėtyje yra ampicilino 37 ° C temperatūroje. Sultinys buvo centrifuguojamas 10000 × G
10 min. ir paviršinis išmesti. DNR iš granulių buvo išgrynintas naudojant QIAGEN plazmidžių Plius Maxi Kit.

lentivirus gamyba.

293T pakavimo ląstelės buvo pasėjamos mažas antibiotikų augimo žiniasklaida (DMEM, 10% šilumos inaktyvuota FBS, 0,1 × penicilinui /Strepomycin /Glutaminas). Ląstelės buvo inkubuojami 24 h (37 ° C, 5% CO _{2), arba tol, kol jie buvo maždaug ~70% susiliejimo. Žiniasklaida apie 293T pakavimo ląstelių buvo pakeistas spartaus augimo terpės sudėtyje yra DMEM. Iš transfekcija plazmidžių mišinys buvo ruošiamas taip:. Pakuotės plazmidės (ΔVpr.89), vokų plazmidės (VSV-G), segtukas-pLKO.1 ir tuščias vektorius}

FUGENE transfekcija reagentas buvo parengta DMEM pagal į gamintojo nurodymus. Trumpai tariant, 3 plazmidės buvo įlašinta į FUGENE ir DMEM ir sumaišyti. Po to mišinys buvo leista inkubuojama 20-30 min. kambario temperatūroje. Transfekcija mišinys buvo tada atidžiai įtraukta į pakavimo ląstelių. Ląstelės buvo inkubuojamos maždaug 18 h. Tada transfekcija žiniasklaida buvo atmesta kitą rytą ir pakeisti aukšto augimo žiniasklaida. Ląstelės buvo inkubuojamos 24 h. Lentivirus, kurių sudėtyje yra žiniasklaida buvo paruošta containingand papildomas spartaus augimo žiniasklaidos pridėta. Ląstelės buvo inkubuojami 24 h ir žiniasklaida nuimta. Tipinis kolekcija buvo 2-3 laiko momentais. Visi virusinės derlius buvo sujungtos.

lentivirus infekcija AGS ląsteles.

AGS ląstelės buvo auginamos maždaug 50% santakoje. Virusinės supernatantai buvo pridėta su polibrenui. Dvylika valandų nuo infekcijos, virusinės laikmenos buvo sunaikinti arba pakeisti su virusinių laikmenų ir inkubuojami už papildomą 12 h. Žiniasklaida buvo išmesti ir pakeisti Ham F12 terpėje. Ląstelės buvo inkubuojamos 24 h. Ląstelės buvo padalyta į atrankos žiniasklaidos, kurių sudėtyje yra iš puromicino ir leido inkubuojama 24 h.

Statistiniai metodai

Visos ląstelių kultūrų eksperimentai buvo kartojami bent 3 kartus, jei nenurodyta kitaip, ir suporuotas T- testai buvo naudojami siekiant nustatyti statistinį reikšmingumą.

rezultatai

h. pylori
Infekcija Padidina fosforilinimas RKIP

RKIP slopina keletą ląstelių išgyvenimo kelius, įskaitant mediēta NF-kB ir Jak /STAT [22]. Išsiaiškinti, kad H poveikį. pylori
infekcijos RKIP skrandžio ląstelėse, AGS ląstelės buvo užsikrėtę H. pylori
ir nuimami 2 val ir 6 val vėliau. Kaip parodyta Fig. 1A, lygiai fosforilinto RKIP (pRKIP) buvo padidėjusi po 2 h (3,126 kartų) ir 6 h (2,9 karto) po H. pylori
infekcija kadangi bendra RKIP baltymų raiškos padidėjo 1,4 karto po 2 h ir 1,75 karto, 6 h H. pylori
infekcija. Panašūs rezultatai taip pat buvo gauti MKN skrandžio vėžio ląstelių (žr S1 pav.)

H. pylori
sukeltas fosforilinimas RKIP yra PKC priklausoma

iš RKIP fosforilinimo ant serino 153 baltymai kinazės C (PKC) panaikina savo gebėjimą surišti į Raf ir slopinti pasroviui MAP kinazės signalizacijos [31]. Mes išnagrinėti, ar fosforilinimo RKIP H. pylori
buvo PKC priklausomas. AGS ląstelės buvo užsikrėtę H. pylori
6 h, esant arba nesant 40 mkm bisindolylmaleimide (Bis A PKC inhibitorius). Mūsų rezultatai rodo, kad fosforilinto RKIP lygiai buvo slopinamas 3,9 karto ir RKIP 1,36 karto, H. pylori
infekciją iš PKC inhibitorių buvimo, o tai rodo, kad RKIP fosforilinimo H. pylori
apima, bet negali būti visiškai priklausomi nuo, The PKC reguliuojama kelias (1B pav.).

IL-6 Skatina fosforilinimas RKIP ir h. pylori-
Aktyvuoja STAT3

Kadangi yra atvirkštinė priklausomybė tarp RKIP ir stat3 raiškos skrandžio vėžio egzempliorių [19], mes įvertinta, ar STAT3 ir jos pagrindinis reguliatorius IL-6 [17] paveikia pRKIP išraiška. IL-6 gydymas esant 25 arba 50 ng /ml dozę padidėjęs pRKIP baltymų 1,8 ir 1,35 karto, atitinkamai ir visos RKIP baltymų raiškos sumažėjo 0,8 padidėjo 1,05 karto (atitinkamai pav 2a.). Iš RKIP fosforilinimo reaguojant į IL-6 buvo PKC-priklauso (duomenys neparodyta). Šie duomenys rodo, kad IL-6 taip pat gali sukelti fosforilinimą RKIP skrandžio ląstelių, kurios gali atsirasti, iš dalies, į PKC-priklauso nuo keliu.

makrofagų atpalaidavimo citokinai, įskaitant IL-6 H metu. pylori
infekcija [34] todėl stat3 aktyvavimo [17]. Ištirti H poveikį. pylori
infekcija nuo STAT3 aktyvavimo, AGS ląstelės buvo laikinai perkeltų su Mafija-1 reporteris statyti [18] ir co-kultūringas su H. pylori
pagal nurodytą diapazone infekcijos gausumas (MOI) 24 h. Mūsų rezultatai parodė, kad ne MOI tarp 10-200:1, H. pylori
buvo gali sukelti stat3 transkripciją (2C pav.) ir STAT3 pY705 fosforilinimą (2B pav.) per 6 valandas nuo infekcijos. Mes Kitas nustatyti, ar IL-6, taip pat galėtų skatinti stat3 rašybą AGS ląsteles. AGS ląstelės buvo laikinai perkeltų su Mafija-1 ir su EV ir ar C-MYC-pažymėtą STAT3 ir po 24 h ląstelių gydant arba IL-6 (50 ng /ml) arba bendrai kultūringas su H. pylori
ne MOI iš 100:1. Rezultatai, pavaizduota Fig. 2D, rodo, kad IL-6 (p < 0.0003) ir H. pylori
(p < 0,0005) buvo kiekvienas galėtų gerokai paskatinti stat3 transkripciją, poveikį, kuris buvo sustiprintas, kai AGS ląstelės buvo pernešta su STAT3 ir užsikrėtę H. pylori
(p < 0,0000023). Iš stat3 aktyvavimo stiprinimas buvo gerokai padidėjo, kai AGS ląstelės buvo bendrai gydomi IL-6 ir h. pylori
, kai, palyginti su gydymu IL-6 (p < 0,000028) arba H. pylori
(p < 0,0003). Vien

fosforilinamos RKIP Skatina savo Transkribavimas

naudojo RKIP liuciferazė reporterio testą ištirti H poveikį. pylori
infekcijos RKIP transkripcijos veikla. h. pylori
gerokai padidėjo RKIP transkripcija (p < 0,002) su daugiau nei 10 kartų padidinti įvykusiu su RKIP raiškos ir daugiau nei 16 kartų padidinti su H derinys. pylori
ir RKIP (p < 0.0003) (3A pav.), lyginant su neapdorotų AGS ląstelių, transfekuotų su tuščiu vektorių. Nebuvo labai padidėjo (p < 0,0001) ir RKIP transkripcijos su H. pylori
infekcija ir RKIP raiškos, kai, palyginti su ląstelių, transfekuotų su RKIP be infekcijos (3A pav.). Mes kartojamas šiuos eksperimentus, kaip ir bis buvimo slopina PKC veiklą, siekiant nustatyti į RKIP transkripcijos augimą, buvo dėl fosforilinimo. Atsižvelgiant į PKC inhibitorių buvimo h. pylori
padidėjo RKIP transkripcija ir RKIP raiška taip pat lėmė RKIP promotoriaus veiklos gerinimo. Bis sumažėjo RKIP transkripciją sukeltas RKIP raiškos ir H. pylori
infekcija didesnis nei 4 kartus, palyginti su ląstelių su RKIP raiškos ir rodo, kad šis poveikis buvo priklausomi nuo RKIP fosforilinimo (Pav. 3A). Mes išnagrinėjo RKIP lokalizacija po H. pylori
infekcija. Imunopernašos pavienių ląstelių tyri- mas AGS ląstelių frakcijos parodė, kad pRKIP yra lokalizuota į branduolį, o RKIP išlieka daugiausia citozolyje po infekcijos, (3B pav.). Kartu, šie duomenys leidžia manyti, kad H. pylori
gali skatinti pRKIP perkėlimas į branduolį, kur jis gali aktyvuoti RKIP transkripciją.

H. pylori
indukuotų RKIP fosforilinimo Priklauso nuo H. pylori anketa CAG
patogeniškumo Island ir RKIP serino 153

Norėdami vertinti konkrečių H vaidmenį. pylori
veiksniai RKIP, laukinio tipo H fosforilinimo. pylori parsisiųsti ir izogeninių mutantai trūksta visą CAG PAI arba
oipA
genas buvo bendrai kultūringas su AGS ląstelių 6 val. h. pylori
mutantas trūksta CAG "PAI
nesugebėjo sukelti RKIP fosforilinimas, o laukinio tipo dėmių ir oipA
mutantas stipriai sukeltas RKIP fosforilinimo (Pav. 4A). Ta pati tendencija pastebima stat3 pY705. Šie rezultatai rodo, kad genai per H. pylori anketa
cagPAI yra būtini RKIP ir stat3 fosforilinimo indukcija.

Jei ištirti, ar mutacija serino 153 paveikia H. pylori
sąlygojamą RKIP fosforilinimas ir transkripcijos aktyvavimo, AGS ląstelės buvo laikinai perkeltų su RKIP statyti, kurioje serino buvo pakeisto valino 153 poziciją (S153V) ir tada su kartu kultūringai su H. pylori
. Dar kartą buvo pastebėtas didesnis tada 16 kartų padidinti RKIP promotoriaus aktyvumą ląstelių su RKIP raiškos ir H. pylori
infekcija (p < 0,0005). Tačiau ląstelėse perkeltų su RKIP S153V prieš H. pylori
infekcija, buvo 2,5 karto sumažinti transkripcijos veiklos (p < 0.0003), kai, palyginti su H. pylori
infekcija į laukinio tipo RKIP ekspresija ląstelės (pav. 4c). Be to, padidėjusią S153V RKIP slopinamas H. pylori
sąlygojamą RKIP fosforilinimas (4B pav.). Kartu paėmus, šie rezultatai rodo, kad fosforilinimas ir transkripcijos aktyvavimo RKIP priklauso nuo H. pylori anketa
cagPAI ir nuo fosforilinimo RKIP ne S153.

h. pylori
Infekcija Rezultatai RKIP nykimo ir sraigė
indukcija

Kadangi padidėjo RKIP transkripcija sukeltas H. pylori
infekcija nebuvo susijęs su padidėjusiu pastovaus viso RKIP baltymų raiškos, mes nagrinėjo, ar H. pylori
gali tuo pat metu padidinti skilimo RKIP baltymų norma per proteasomos tarpininkaujant degradacija, kaip ir anksčiau siūlo [35]. MG132 padidėjo RKIP baltymų lygį buvimą ar nebuvimą H. pylori
infekcija, atitinkantis H. pylori
vis proteasomal RKIP degradacija (pav. 5A).

Dar vienas mechanizmas, kurie galėtų atsiskaityti už pasikeitus RKIP baltymų ar mRNR ekspresijos stoka būtų transkripcijos represijos RKIP po H. pylori
infekcija. Sraigė yra transkripcijos faktorius, vaidina svarbų vaidmenį EMT [23], taip pat yra žinomas transkripcijos slopin RKIP prostatos vėžinių ląstelių [25]. Ištirti H poveikį. pylori
infekcija nuo sraigė ir RKIP išraiškos, AGS ląstelės buvo bendrai kultūringas su H. pylori
ne VRM 100. sraigė mRNR ekspresijos buvo stipriai sukeltas po 2-4 h infekcijos (5d pav.) Vakarų dėmė analizė parodė, kad H. pylori
infekcija atsirado laiko ir dozės priklausomas Sraigė baltymų koncentracijos (pav. 5B /C). Šis rezultatas yra nesuderinamas su mūsų duomenų apie RKIP transkripcijos po H. Helicobacter pylori infekcija
(3 pav.) ir teigia, kad H. pylori
infekcija gali į baltymo (-ų), kad būtų panaikinti iš sraigė poveikį RKIP transkripcijos indukcija. Mes šiuo metu tiria šią galimybę masės Spectometry analizė naudojant tėvų ir RKIP triuškinantis ląsteles (6 pav.).

RKIP Pagerina h. pylori
sąlygojamą Apoptozę

h. pylori
skatina skrandžio epitelio ląstelių apoptozę [8]. Nuo RKIP gali skatinti apoptozę [29], mes išnagrinėjo jei pRKIP indukcija po H. pylori
infekcija, galėtų būti atsakinga už H. pylori
indukuotų apoptozę. AGS ląstelės buvo laikinai perkeltų su RKIP ar tuščią vektorių, užsikrėtę H. pylori
16 h ir apoptozės įvertintų per PARP skilimo tėkmės citometrijos ir DNR fragmentaciją. Kai eksperimentams RKIP buvo slopinamas lentivirus tarpininkaujant RKIP triuškinantis. Kaip parodyta Fig. 6A, O
. pylori
paskatino PARP skilimo, poveikį, kuris buvo padidintas negimdinio išraiška RKIP. Tėkmės citometrijos analizė parodė, kad H. pylori
infekcija lėmė maždaug 4 kartus padidėjo apoptozės (p < 0,0008), RKIP raiškos, 3-kartus padidėjo (p < 0,003) ir kartu 6 kartus padidėjimas (p < 0,0005) lyginant su neapdorotas AGS ląstelės (pav. 6B). Į IFA įsikūrusio DNR fragmentacijos tyrimą, aprotoninis veikla išaugo: 2,5 karto (p < 0.000063) užkrėstų su H ląsteles. pylori
; 1,8 karto (p < 0,006) ląstelėse laikinai transfekuotų su RKIP; ir 3,5 karto (p < 0.0007) su jungimo (6C pav.). Norėdami nustatyti, ar RKIP buvo atsakingas už H. pylori
sąlygojamą apoptozė, mes slopino RKIP išraišką naudojant lentivirus tarpininkaujant RNR slopinimas ir pastebėjo į RKIP baltymų koncentracijos sumažėjimą Vakarų blot analizė rodo, kad RKIP sumažinti neapdorotas ir H. pylori užsikrėtę AGS ląsteles (pav. 6d). Mūsų DNR fragmentacijos analize, į tėvų AGS ląstelių H. pylori
infekcija lėmė 2 kartus padidėjo (p < 0,0007) į apoptozės (pav 6E.). Per RKIP triuškinantis AGS ląstelių h. pylori
infekcija lėmė 1,5 karto padidėjo apoptozė (p < 0,003) (. 6E pav). Į apoptozės tarp tėvų ir RKIP triuškinantis AGS ląstelių sumažėjimas buvo statistiškai reikšmingas (p < 0,0006). Šie rezultatai rodo, kad RKIP yra būtinas H. pylori
sąlygojamą apoptozę.

Diskusijos

Lėtinis gastritas ir pakitęs ląstelių apyvarta sukeltas H. pylori
infekcija skatinti distalinės skrandžio adenokarcinoma [36] vystymąsi. h. pylori
gali reguliuoti skrandžio epitelio apoptozę per keletą mechanizmų. Pavyzdžiui, po infekcijos ir atsižvelgti į skrandžio epitelinių ląstelių, PVG sekrecijos sistema siekiama pakeisti ląstelėje perduoti signalo, sudarant NF-kB aktyvacijos. NF-kB gali translocates į branduolį aktyvuoti transkripciją proapoptozinis genų [37]. h. pylori
taip pat gali sukelti apoptozę didinant išraiška FAS ir jos ligando (FasL), po kurių išorinė apoptozės keliu [38] aktyvacijos. Paradoksalu, h. pylori
taip pat gali aktyvuoti kelius, kad downregulate apoptozę [39], ypač vėlai lėtinės infekcijos [40] metu. Tai adaptyvus atsakas epitelio ląstelių atsispirti apoptozę lėtinio H. pylori
infekcija gali prisidėti prie H. pylori
indukuotų skrandžio Kancerogeninis [41]. Apoptozės atsakas skrandžio epitelinių ląstelių H. pylori
taip pat priklauso nuo įtampos konkrečių virulentiškumo veiksnių. Pavyzdžiui, infekcija CAG PAI-teigiamas padermių gali sukelti apoptozę greičiau nei APG PAI-neigiamas padermių [42]. h. pylori Vaca
geno produktas stimuliuoja vidinę Apoptozė kelią, vedantį į mitochondrijų išleidimo citochromo C, o kaspazės-3 aktyvacijos [43]. Vaca sukeltas apoptozę susijęs su daugybe STAT3 mažinimo, vedančią į Bcl-2 ir Bcl-X _{L [43] downregulation. Atliekant kitą tyrimą, buvo įrodyta, kad H. pylori
indukuoja apoptozę pagal keliu, apimančią nuoseklų indukciją viršūninio kaspazės-8 veiklos proapoptotinį baltymai blogas ir pasiūlymą, kaspazės-9 veikla ir efektorinių kaspazės-3 veiklos [44].}

Mūsų tyrimas apibūdina kitą mechanizmą, pagal kurį H. pylori
infekcija gali skatinti apoptozę skrandžio vėžio ląstelių, ypač skatinant RKIP fosforilinimas. Iš RKIP gebėjimas slopinti Raf /MAPK signalizacijos [26], [27] ir skatinti apoptozę buvo gerai dokumentuota [29]. Iš disertacija kelius ir RKIP ekspresijos lygio sąveika buvo susijęs daugelyje žingsnių navikų susidarymo ir /ar progresavimo [30]. Be to, padidėjusią RKIP rezultatus į metastazių ir invaziškumo slopinimas įvairiose navikų modelių [45] - [48]. Šio reiškinio atsiradimo mechanizmas iš diferencinė ekspresija pRKIP ir RKIP nėra žinoma. Mes tikėjomės, kad santykinai aukštesnio lygio pRKIP po užsikrėtimo gali koreliuoja su mažesniu RKIP lygiais. Tačiau mes nustatėme, kad H. pylori
infekcija lėmė RKIP baltymų degradacijos, galbūt todėl MAPK signalizacijos ir apoptozę indukcijos skrandžio vėžio po H. pylori
infekcija. PKC tarpininkaujant RKIP fosforilinimas gali sutrikdyti RKIP gebėjimą surišti į Raf ir slopinti MAPK signalizacijos [31], tačiau, ten anksčiau nebuvo jokių ataskaitas apie pRKIP vaidmenį apoptozės reglamentą. Ankstesni tyrimai iš mūsų laboratorijoje parodė, kad RKIP raiškos rezultatus tiesiogiai aktyvavimo pro-kaspazė 8 [29]. Nors phosphoryation rezultatai branduolinės relocalization, po RKIP aktyvavimo savo transkripcijos, iš RKIP baltymų lygis nedidina. Tai rodo kitą mechanizmą RKIP reguliavimo, nei tai, kas buvo anksčiau pranešta. Mes šiuo metu nagrinėja mechanizmą, pagal kurį pRKIP suaktyvinančią apoptozę skrandžio vėžio ląstelių po H.

Cag teigiamas H.pylori
infekcija.. pylori
žymiai upregulate EMT susijusių genų sraigė, Slug ir vimentin kartu su MMP-7 indukcijos, o tai rodo tam tikrą vaidmenį šių baltymų skrandžio vėžio vystymosi [49]. Mūsų tyrime mes nustatėme greitą indukciją pRKIP baltymų po H. pylori
infekcija, ir per RKIP transkripcijos padidėjimas, taip pat kai sraigė mRNR ir baltymų raiškos ląstelę. Nors sraigė buvo identifikuota kaip transkripcijos slopinančioje iš RKIP [25], mūsų tyrimas rodo, kad tai tikriausiai neturi įtakos fosforilinto forma RKIP poveikį, nes po užsikrėtimo mes nesilaikė iš RKIP transkripcijos represijas.

Infekcijos su cagPAI-turintis kamienus H. pylori
yra susijęs su didesne uždegiminio atsako į skrandį ir kelia didesnę riziką susirgti skrandžio opos ar skrandžio vėžiu nei padermių trūksta CAG salą [36]. h. pylori
skatina intensyvų uždegiminį atsaką ir vietoje aukšto lygio kelių citokinų, įskaitant interleukino 6 (IL-6) [34].

• PLoS ONE: užprogramuotas chemoterapija pacientams, sergantiems metastazavusiu nerezekuojamas Skrandžio Cancer
• PLoS ONE: Kiekybinis matavimas organinės rūgštys audiniuose iš skrandžio vėžio pacientais parodė, Padidėjęs gliukozės metabolizmui skrandžio Cancer