PLOS ONE: regulação da função RKIP por Helicobacter pylori em gástrica Cancer

Abstract

Helicobacter pylori (H. pylori)
é uma bactéria gram-negativa, em forma de espiral que infecta mais de metade da população do mundo e é uma das principais causas de adenocarcinoma gástrico. Os mecanismos que ligam H. pylori
infecção a carcinogénese gástrica não são bem compreendidos. No presente estudo, nós relatam que o inibidor de proteína-quinase Raf (RKIP) tem um papel na indução de apoptose por H. pylori
em células epiteliais gástricas. ensaios blot e transcrição luciferase repórter ocidentais demonstram que a ilha de patogenicidade de H. pylori
fosforila RKIP rapidamente, que, em seguida, localiza para o núcleo onde activa a sua própria transcrição e induz a apoptose. superexpressão forçada de RKIP aumenta a apoptose em H. pylori
células infectados, enquanto que a inibição de ARN RKIP suprime a indução de apoptose por H. pylori
infecção. Enquanto induzir a fosforilação de RKIP, H. pylori
vise, simultaneamente, RKIP não fosforilada para a degradação mediada por proteassoma. O aumento na transcrição RKIP e fosforilação é revogada através da mutação RKIP serina 153 para valina, demonstrando que a regulação da atividade RKIP pelo H. pylori
é dependente de resíduo S153 de RKIP. Além disso, H. pylori
aumenta a expressão de Snail, um repressor de transcrição de RKIP. Nossos resultados sugerem que H. pylori
utiliza uma proteína supressora de tumor, RKIP, para promover a apoptose em células cancerosas gástricas

Citation:. Moen EL, Wen S, Anwar T, Cross-Knorr S, Brilliant K, Birnbaum F, et al . (2012) regulação da função RKIP pelo Helicobacter pylori
no câncer gástrico. PLoS ONE 7 (5): e37819. doi: 10.1371 /journal.pone.0037819

editor: Yoshio Yamaoka, Veterans Affairs Medical Center (111D), Estados Unidos da América

Recebido: 30 de dezembro de 2011; Aceito: 24 de abril de 2012; Publicado em: 25 de maio de 2012 |

Direitos de autor: © 2012 Moen et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado pelo Instituto Nacional de Ciências Médicas gerais dos Institutos nacionais de Saúde, sob Award Número P20GM103421 (DC); o segmento anterior deste projecto foi apoiado pelo Centro Nacional de Investigação Recursos (NCRR) sob P20 RR 017.695 (DC), R01 CA111533 (SFM) e R21 CA133601 (JMS). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o câncer gástrico é a quarta neoplasia maligna mais frequentemente diagnosticado no mundo. Em 2007, aproximadamente um milhão de novos casos de câncer gástrico levando a aproximadamente 800.000 mortes no mundo foram registrados, tornando-se a segunda causa mais comum de morte por câncer [1]. O câncer gástrico é atualmente a sétima principal causa de mortes por câncer em os EUA, com cerca de 21.500 novos casos diagnosticados em 2011 (http://www.cancer.gov/cancertopics/types/stomach). A, em forma de espiral bactéria gram-negativa Helicobacter pylori (H. pylori)
infecta mais de metade da população do mundo e tem sido identificada como um importante fator de risco na carcinogênese gástrica [2]. A Organização Mundial da Saúde ea Agência Internacional de Investigação do Cancro designou como uma classe I carcinógeno em 1994 [3]. Nossa compreensão atual da H. pylori
carcinogénese induzida é que a bactéria e a resposta inflamatória crónica associada promover a morte celular por apoptose epitelial gástrica [4], com subsequente hiper-proliferação [5], e produção de radicais livres [6] o que contribui para uma sequência lenta e progressiva de alterações na mucosa gástrica que finalmente favoreçam progressão para o câncer. Este modelo é consistente com relatos de que os polimorfismos do gene de citocinas pró-inflamatórias que aumentam a intensidade da resposta inflamatória estão relacionados com o aumento de risco do cancro gástrico [7].

H. pylori
adere estreitamente às células epiteliais gástricas e pode induzir a apoptose directamente [8]. O cag (gene associado citotóxico) ilha de patogenicidade (cag PAI) da H. pylori
é um segmento de 40 kb de ADN que contém os genes que codificam para os componentes de um sistema de secreção de tipo IV bacteriana [9]. Dentro desta região é o gene cagA
que codifica CagA, uma proteína imunodominante de 121-145 kDa [9]. H. pylori
estirpes que possuam e que expressam a cag PAI são mais frequentemente associados com úlcera péptica e câncer gástrico em populações ocidentais do que as estirpes que não [9]. A partir da sua injecção através do sistema de secreção de tipo IV em células epiteliais gástricas hospedeiras, CagA, pode-se posteriormente fosforilado por tirosina-cinases da família src na sua extremidade C-terminal [10], CagA, levando a ligar e activar SHP2 e sinal via ERK [11]. Importante, CagA também é responsável pela activação do transdutor de sinal e ativador de transcrição 3 (STAT3) in vitro
e in vivo
[12], embora isso pode não ser necessariamente dependente de fosforilação CagA [11]

proteínas STAT são constitutivamente expressos em várias neoplasias, incluindo gástrico, mama, cabeça e pescoço, e cancros da próstata [13] - [16].. Após a fosforilação da tirosina 705 resíduo e acetilação na lisina 685, dimeriza STAT3 e entra no núcleo onde funciona para regular a transcrição de uma grande variedade de genes [17], [18]. A activação constitutiva da proteína STAT3 foi mostrado para evitar apoptose e aumentar a proliferação de células e metástases num número de cancros, incluindo o cancro gástrico [19], [20].

Uma das características de progressão tumoral gástrico é a aquisição de fenótipos mais invasivas e migratórias durante a transição epitelial-mesenquimal (EMT). Durante EMT, células epiteliais gástricas sofrer alterações fenotípicas caracterizadas pela perda de moléculas de adesão celular, particularmente a caderina epitelial (E-caderina) [21]. O caracol factor de transcrição, uma proteína de dedo de zinco, tem sido caracterizada anteriormente como um importante regulador de EMT devido a sua activação através de Factor Nuclear kappa Beta (NF-kB) [22] e subsequente repressão de E-caderina nas células tumorais epiteliais [ ,,,0],23], [24]. Além disso, estudos utilizando ganho-de-função e perda de função de abordagens identificaram Snail como repressor da transcrição RKIP em células de cancro da próstata metastático [25].

RKIP é um membro da proteína de ligação a fosfatidiletanolamina família e um regulador negativo do (cinase Regulada Sinal extracelular) ERK1 /2 [26], o NF-kB [27] e GRK (G protein-Coupled Receptor Kinase) [28] vias. RKIP desempenha, assim, um papel importante na regulação da sobrevivência celular e apoptose, para além de potenciar a eficácia de agentes quimioterapêuticos [29]. RKIP também tem sido identificada como uma proteína supressora de metástases [30], e em doentes com adenocarcinoma gástrico existe uma correlação positiva entre a expressão RKIP e a sobrevivência do paciente e uma correlação inversa entre a expressão de RKIP e STAT3 [19]. expressão e função RKIP pode ser regulada por modificações pós-traducionais. Por exemplo, a fosforilação de RKIP pela proteína cinase C na serina-153 impede a capacidade do RKIP se ligar à sua molécula alvo, inactivando assim a função RKIP [31]. Além disso, RKIP repressão via metilação do promotor pode ser superado por inibidores de desacetilase de histona de metilação e [25].

Devido aos papéis importantes de RKIP, STAT3 e H. pylori
na patogênese do câncer gástrico, nós investigamos se H. pylori
sinais através RKIP. Nossos estudos sugerem que uma interação complexa entre H. cagPAI
pylori, RKIP, STAT3, e caracol atua para desregular a apoptose das células epiteliais gástricas pela modulação da função RKIP, um mecanismo que define um papel central para RKIP em H. pylori
carcinogênese gástrica -associated.

Materiais e Métodos

Reagentes

Todos os reagentes e produtos químicos foram adquiridos da Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO) a menos de outro modo indicado. MG-132 foi adquirida da Calbiochem (Gibbstown, NJ) dissolvido em DMSO e utilizado na concentração de 10 mM. A interleucina-6 (IL-6) foi adquirido a partir de BD Biosciences (San Diego, CA). reagentes de quantificação de proteína foram obtidos a partir de Bio-Rad Laboratories (Hercules, CA). reagentes de quimioluminescência aumentada e secundário do rato e coelho peroxidase de rábano conjugada para a análise de transferência de Western foram de GE Healthcare (Piscataway, NJ). A actina-HRP, fosforilado-RKIP (pRKIP) e STAT3 anticorpos foram adquiridos a partir de Santa Cruz Biothechnology (Santa Cruz, CA). Os anticorpos para a STAT3 pS727 e pY705 e PARP foram adquiridos a partir de Cell Signaling Technology (Beverly, MA) e o anticorpo para RKIP da Millipore, Billerica, MA. O anticorpo de Snail foi comprado de Abcam (Cambridge, MA).

Células e plasmídeos

A linha celular de carcinoma gástrico humano AGS (CRL-1739) foi adquirido da American Type Culture Collection (Manasas , VA). células MKN28 foram doados pelo Dr. Richard Peek, Universidade Vanderbilt, Nashville, TN e foram originalmente comprado a Riken Cell Bank, Ibaraki, no Japão. Os plasmídeos de expressão para pcDNA3, c-myc STAT3, CMV-HA-RKIP (HA-RKIP) e CMV-HA vector vazio (EV) foram descritos [18], [26]. O plasmídeo RKIP S153V foi fornecido pelo Dr. Marsha Rosner, da Universidade de Chicago, Chicago, IL.

H. pylori
Estirpes e condições de cultura

tipo selvagem H. pylori
estirpes ou isogênico H. pylori
mutantes foram co-cultivadas com as linhas celulares AGS ou gástrica MKN como descrito anteriormente [32] a uma multiplicidade de infecção (MOI) de 100:1 em todas as experiências, a menos que indicado de outra forma.

A transfecção de as células AGS

AGS células foram transfectadas transientemente utilizando o reagente de transfecção de plasmídeo GenJet (Signagen Laboratories, Gaithersburg, MD) de acordo com o protocolo do fabricante para um formato de placa de 6 poços. quantidades ADN total de entre 1 e 2 ug foram transfectadas por amostra. condições de transfecção foram avaliadas e optimizado por meio de análise de células transfectadas com uma proteína verde fluorescente (GFP) -expressing plasmídeo RKIP. eficiências de transfecção foram consistentemente na gama de 75-85%.

Extracção de proteínas e análise por Western blot

foram preparados extractos celulares totais e fraccionamentos subcelulares e imunotransferidas como descrito anteriormente [29], [32 ]. As concentrações de proteína foram determinadas usando o BCA Protein Assay (Thermo Scientific). Densitometria de Western blot foi realizada de acordo com o protocolo listados no seguinte site:. Http://lukemiller.org/journal/2007/

Realtime PCR

Dois mg de RNA foi convertida ADNc utilizando RevertAid da primeira cadeia de cDNA Synthesis Kit (Thermo Scientific). Quantitative PCR em tempo real foi realizada usando 2 × QIAgen QuantiFast SYBR Green I (Roche). Os primers para Caracol foram para a frente: AGCTCTCTGAGGCCAAGGATCT, inverta: TGTGGCTTCGGATGTGCAT e beta-actina: a frente: CTGGCACCACACCTTCTACAA, inverta: CAGCCTGGATAGCAACGTACA. Os seguintes tempos de perfil típico utilizados foram de 40 ciclos de: um passo inicial a 95 ° C durante 10 min, seguido de 95 ° C durante 15 s e 60 ° C durante 1 min. O nível de expressão relativa foi calculada utilizando o método 2-ΔΔCT como descrito anteriormente [33].

STAT3 e RKIP luciferase repórter Assays

As células (2 x 10 ^{5 células /poço em placas de 6 poços) foram transientemente transfectadas com 0,1 ug (STAT3, RKIP) ou 0,05 ug (NF-kB) de um plasmídeo repórter contendo quer a ligação STAT3 SIE-fragmento da região do promotor do gene do rato IRF1 (p2xSIE-Luc) ou a região do promotor RKIP mais os plasmídeos indicados como previamente descrito [18]. Aproximadamente 24 h após a transfecção, as células foram tratadas com a droga indicada ou infectados com H. pylori
durante a noite ou não tratada. A actividade da luciferase no sobrenadante citosólico foi avaliada utilizando o ensaio de luciferase repórter (Promega) e medida utilizando um luminómetro para estimar a actividade de transcrição [18].}

Apoptose Os ensaios

A apoptose foi quantificada em ensaios separados por citometria de fluxo e a fragmentação do ADN de ELISA. Por citometria de fluxo, a percentagem de células apoptóticas (sub-L _{ó) foi determinada por análise de citometria de fluxo de células iodeto de propídio coradas [29]. Citoplasmática fragmentação de ADN associada a histona foi medida com o ELISA Cell Death Detection plus kit (Roche, Indianapolis, IN) de acordo com as instruções do fabricante.}

citoplasmática fragmentação de ADN associada a histona foi medida com o ELISA Cell Death Detection Além disso kit (Roche, Indianapolis, IN) de acordo com as instruções do fabricante. Os experimentos foram repetidos 3 vezes e realizada em duplicado.

Knockdown Lentivírus mediada de RKIP

Lentivírus constrói.

pLKO.1 puro resistência lentiviral construir RHS3979-97070798 e RHS3979-98492779 foram adquiridos a Abrir Biosystems (Huntsville, AL). As construções continham um marcador de selecção e puromicina foram cultivadas em caldo de Luria contendo ampicilina a 37 ° C. O caldo foi centrifugado a 10000 × g
durante 10 min. e o sobrenadante descartado. ADN a partir dos peletes foi purificado utilizando o Kit QIAGEN Plasmid Maxi Além disso.

produção Lentivirus.

células de empacotamento 293T foram semeadas em meios de baixa antibiótico de crescimento (DMEM, 10% de FBS inactivado pelo calor, 0,1 × penicilina /Strepomycin /Glutamina). As células foram incubadas durante 24 h (37 ° C, 5% de CO _{2), ou até que eles foram de aproximadamente ~ 70% confluentes. Os meios de comunicação sobre as células de empacotamento 293T foi substituído por meio de alto crescimento contendo DMEM. Uma mistura de transfecção dos plasmídeos foram preparados como se segue:. Plasmídeo de empacotamento (ΔVpr.89), o plasmídeo envelope (VSV-G), hairpin-pLKO.1 e vector vazio}

reagente Fugene transfecção foi preparado de acordo com DMEM com as instruções do fabricante. Resumidamente, os plasmídeos 3 foram adicionados gota a gota à FuGENE e DMEM e misturado. A mistura foi, em seguida, deixou-se incubar durante 20-30 minutos. à temperatura ambiente. A mistura de transfecção foi então cuidadosamente adicionada a células de empacotamento. As células foram incubadas durante aproximadamente 18 h. O meio de transfecção foi então descartado na manhã seguinte e substituído por meio de alto crescimento. As células foram incubadas durante 24 h. containingand lentivírus contendo media foi colhida media de alto crescimento adicional acrescentado. As células foram incubadas durante 24 h e o meio colhido. recolha típica era de 2-3 pontos de tempo. Todas as colheitas virais foram reunidas.

infecção por lentivírus de células AGS.

células AGS foram cultivadas a aproximadamente 50% de confluência. Os sobrenadantes virais foram adicionados com polibreno. Doze horas após a infecção, os meios de comunicação viral foi descartado e substituído com meio virais e incubou-se durante mais 12 h. O meio foi descartado e substituído com meio F12 de Ham. As células foram incubadas durante 24 h. As células foram separadas em meio de selecção contendo de puromicina e deixou-se incubar durante 24 h.

Métodos Estatísticos

Todas as experiências de cultura de células foram repetidas pelo menos 3 vezes, a menos que indicado de outra forma, e emparelhado t- testes foram utilizados para determinar a significância estatística.

resultados

H. pylori
infecção aumenta fosforilação de RKIP

RKIP inibe vários percursos de sobrevivência celular, incluindo as mediadas através de NF-kB e Jak /STAT [22]. Para elucidar o efeito de H. pylori
em RKIP em células gástricas, as células AGS foram infectadas com o H. pylori
e colhidas 2 h e 6 h depois. Como mostrado na Fig. 1A, os níveis de RKIP fosforilada (pRKIP) foram elevados após 2 h (3.126 vezes) e 6 h (2,9 vezes) após H. pylori
infecção enquanto a expressão de proteína total RKIP aumentou 1,4 vezes após 2 horas e 1,75 vezes após 6 h de H. pylori
infecção. Resultados semelhantes também foram obtidos com células de câncer gástrico MKN (ver figura S1).

H. pylori
induziu a fosforilação de RKIP é dependente de PKC

A fosforilação da serina 153 no RKIP pela proteína cinase C (PKC) anula a sua capacidade para se ligar a e inibir a Raf quinase MAP a jusante de sinalização [31]. Examinamos se a fosforilação de RKIP pelo H. pylori
era dependente de PKC. células AGS foram infectadas com o H. pylori
durante 6 h, na presença ou na ausência de 40 uM bisindolilmaleimida (bis, um inibidor de PKC). Os nossos resultados indicam que os níveis de RKIP fosforilados foi inibida 3,9 vezes e 1,36 vezes RKIP após H. pylori
infecção na presença do inibidor de PKC, sugerindo que a fosforilação por RKIP H. pylori
envolve, mas pode não ser totalmente dependente, a via regulada por PKC (Fig. 1B).

IL-6 induz a fosforilação da RKIP e H. pylori
ativa STAT3

Uma vez que existe uma relação inversa entre RKIP e expressão STAT3 em amostras de câncer gástrico [19], nós avaliamos se STAT3 e seu regulador chave IL-6 [17] afeta a expressão pRKIP. IL-6 de tratamento a uma dose de 25 ou 50 ng /ml de elevados níveis de proteína pRKIP 1,8 e 1,35 vezes, respectivamente, e a expressão de proteína total RKIP diminuiu de 0,8 e aumentou 1,05 vezes, respectivamente (Fig. 2A). A fosforilação de RKIP em resposta a IL-6 era dependente de PKC (dados não mostrados). Estes dados indicam que a IL-6 pode também induzir a fosforilação de RKIP em células gástricas que podem ocorrer, em parte, para uma via dependente de PKC.

citocinas libertação macrófagos, incluindo a IL-6 durante H. pylori
infecção [34] levando à ativação STAT3 [17]. Para investigar os efeitos do H. pylori
sobre a activação da STAT3, AGS células foram transitoriamente transfectadas com um constructo repórter IRF-1 [18] e co-cultivadas com H. pylori
na gama indicada de multiplicidade de infecção (MOI) durante 24 h. Nossos resultados mostraram que em um MOI entre 10-200:1, H. pylori
foi capaz de induzir a transcrição STAT3 (Fig. 2C) e a fosforilação da STAT3 pY705 (Fig. 2B) no prazo de 6 horas de infecção. A seguir, determinar se IL-6 também pode estimular a transcrição STAT3 em células AGS. AGS células foram transfectadas transientemente com o IRF-1 e com EV e ou c-myc marcada com STAT3 e, em seguida, depois de 24 h as células tratadas com IL-6 (50 ng /mL) ou co-cultivada com H. pylori Restaurant at MOI de 100:1. Os resultados, representados na Fig. 2D, demonstram que a IL-6 (p < 0,0003) e H. pylori
(p < 0,0005) foram, cada um capaz de estimular de forma significativa a transcrição STAT3, um efeito que foi aumentada quando as células foram transfectadas com AGS e STAT3 infectados com H. pylori
(p < 0,0000023). O aumento da activação da STAT3 foi significativamente aumentada quando as células foram AGS co-tratados com IL-6 e H. pylori
quando comparado com o tratamento com IL-6 (p < 0,000028) ou H. pylori
(p < 0,0003). sozinhos

fosforilada RKIP induza o seu próprio Transcrição

Foi utilizado um ensaio de repórter luciferase RKIP para investigar os efeitos do H. pylori
infecção na actividade transcricional RKIP. H. pylori
significativamente aumentados de transcrição RKIP (p < 0,002), com um aumento superior a 10 vezes ocorrem com superexpressão RKIP e um aumento superior a 16 vezes, com a combinação de H. pylori
e RKIP (p < 0,0003) (Fig. 3A) quando comparado com as células não tratadas AGS transfectadas com vector vazio. Houve um aumento significativo (p < 0,0001) na transcrição RKIP com H. pylori
infecção e RKIP superexpressão quando comparado com as células transfectadas com RKIP sem infecção (Fig. 3A). Repetimos destas experiências na presença de cloreto de bis para inibir a actividade de PKC para determinar o aumento da transcrição RKIP era devido à fosforilação. Na presença do inibidor de PKC, H. pylori
aumento da transcrição e RKIP superexpressão RKIP também resultou no aumento da actividade de promotor RKIP. Bis diminuída RKIP transcrição induzida pela sobre-expressão RKIP e H. pylori
infecção maior do que quatro vezes, quando comparada com células em RKIP com sobre-expressão e sugere que estes efeitos eram dependentes RKIP fosforilação (Fig. 3A). Foi examinada a localização de RKIP depois H. pylori
infecção. Immunoblotting fracções subcelulares de células demonstraram que AGS pRKIP está localizada para o núcleo enquanto RKIP permanece principalmente no citosol após a infecção (Fig. 3B). Juntos, estes dados significam que H. pylori
pode promover a translocação de pRKIP para o núcleo, onde ele pode ativar a transcrição RKIP.

H. pylori
induzida RKIP fosforilação Depende H. cag do pylori
Patogenicidade Ilha e RKIP Serina 153

Para avaliar o papel da específica H. pylori
fatores na fosforilação de RKIP, tipo selvagem H. pylori Comprar e mutantes isog�nicas falta toda a cag PAI ou of the oipA
gene foram co-cultivados com células AGS durante 6 horas. O H. pylori
mutante sem a cag PAI
não foi capaz de induzir a fosforilação RKIP, enquanto a mancha de tipo selvagem e o oipA
mutante induziram fortemente a fosforilação RKIP (Fig. 4A). A mesma tendência foi observada em STAT3 pY705. Estes resultados sugerem que os genes dentro de H.
cagPAI do pylori são necessárias para a indução de RKIP e STAT3 fosforilação.

Para investigar se a mutação de serina 153 afeta H. pylori
fosforilação mediada por RKIP e de activação da transcrição, AGS células foram transitoriamente transfectadas com uma construção de RKIP em que a serina foi substituída pela valina na posição 153 (S153V) e, em seguida co-cultivadas com H. pylori
. Mais uma vez observamos um maior, em seguida, aumento de 16 vezes na atividade do promotor RKIP em células com superexpressão RKIP e H. pylori
infecção (p < 0,0005). No entanto, em células transfectadas com RKIP S153V antes H. pylori
, houve uma redução de 2,5 vezes na actividade de transcrição (p < 0,0003) quando comparado com o H. pylori
no tipo selvagem RKIP superexpressão células (Fig. 4C). Além disso, a sobre-expressão de S153V RKIP inibida H. pylori
fosforilação mediada por RKIP (Fig. 4B). Tomados em conjunto, estes resultados indicam que a fosforilação e activação da transcrição de RKIP é dependente H.
pylori cagPAI e também sobre a fosforilação de RKIP no S153.

H. pylori
infecção resulta em degradação RKIP ea indução de Caracol

Por causa aumento da transcrição RKIP induzida pela H. pylori
não foi associado com o aumento da expressão da proteína RKIP total de estado estacionário, examinamos se H. pylori
pode, simultaneamente, aumentar a taxa de degradação da proteína RKIP através da degradação mediada por proteassoma, como sugerido anteriormente [35]. MG132 aumentou os níveis de proteína RKIP na presença ou ausência de H. pylori
infecção, de acordo com H. pylori
crescente degradação proteossómica RKIP (Fig. 5A).

Outro mecanismo que poderia explicar a falta de mudança em proteínas RKIP ou expressão de mRNA seria repressão da transcrição de RKIP depois H. pylori
infecção. Snail é um factor de transcrição que desempenha um papel importante na EMT [23], bem como um repressor de transcrição conhecido de RKIP em células de cancro da próstata [25]. Para investigar os efeitos do H. pylori
infecção sobre a expressão de Snail e RKIP, AGS células foram co-cultivadas com H. pylori
a uma MOI de 100. caracol expressão de ARNm foi fortemente induzida, após 2-4 h de infecção (Fig. 5D) análise de transferência de Western indicou que H. pylori
resultou num aumento dependente do tempo e da dose nos níveis de proteína Snail (Fig. 5B /C). Este resultado não é consistente com nossos dados sobre a transcrição RKIP após H. pylori
infecção (Fig. 3) e sugere que H. pylori pode
na indução da proteína (s) que anulam o efeito de Snail em RKIP transcrição. Estamos investigando esta possibilidade por meio de análise de Massa Espectrometria usando células parentais e RKIP knockdown (Fig. 6).

RKIP Melhora H. pylori
mediada por apoptose

H. pylori
induz a apoptose de células epiteliais gástricas [8]. Desde RKIP pode promover a apoptose [29], examinamos se a indução de pRKIP depois H. pylori
, poderia ser responsável pela H. pylori
apoptose induzida. AGS células foram transfectadas transientemente com RKIP ou um vector vazio, infectados com H. pylori
durante 16 h e a apoptose avaliado através de clivagem de PARP citometria de fluxo e a fragmentação do ADN. Em algumas experiências RKIP foi inibida por knockdown RKIP mediada por lentivírus. Como mostrado na Fig. 6A, H
. pylori
induziu a clivagem de PARP, um efeito que foi aumentada pela expressão ectópica de RKIP. Citometria de fluxo indicou que H. pylori
resultou num aumento de aproximadamente 4 vezes na apoptose (p < 0,0008), RKIP sobre-expressão, um aumento de 3 vezes (p < 0,003), e a combinação de um aumento de 6 vezes (p < 0,0005) quando comparado com células não tratadas AGS (Fig. 6B). No ensaio de fragmentação de ADN baseado em ELISA, a actividade apoptótica aumentou: de 2,5 vezes (p < 0,000063) em células infectadas com o H. pylori
; 1,8 vezes (p < 0,006) em células transfectadas transitoriamente com RKIP; e 3,5 vezes (p < 0,0007) com a combinação (figura 6C.). Para determinar se RKIP foi responsável pela H. pylori
apoptose mediada, que suprimiu a expressão RKIP utilizando inibição de ARN mediada por lentivírus e observou-se uma redução nos níveis de proteína RKIP por análise de transferência de Western demonstrando a redução de RKIP em não tratada e H. pylori células infectadas AGS (Fig. 6D). Em nossa análise de DNA fragmentação, nas células AGS parentais H. pylori
resultou num aumento de 2 vezes (p < 0,0007) na apoptose (Figura 6E.). Nos RKIP knockdown células AGS, H. pylori
resultou num aumento de 1,5 vezes na apoptose (p < 0,003) (Fig. 6E). A redução na apoptose entre as células parentais AGS e RKIP knockdown foi estatisticamente significativa (p < 0,0006). Estes resultados indicam que é necessário para RKIP H. pylori
apoptose mediada.

Discussão

A gastrite crónica e renovação celular alterada induzida por H. pylori
promover o desenvolvimento de adenocarcinoma gástrico distal [36]. H. pylori
pode regular a apoptose epitelial gástrica através de vários mecanismos. Por exemplo, após a infecção e a aderência a células epiteliais gástricas, o sistema de secreção CAG serve para alterar a transdução de sinal intracelular resultando na activação de NF-kB. NF-kB pode transloca para o núcleo para activar a transcrição de genes pró-apoptóticos [37]. H. pylori
também pode induzir apoptose por aumento da expressão da FAS e seu ligando (FASL) que conduz à activação da via extrínseca da apoptose [38]. Paradoxalmente, H. pylori
também pode activar caminhos que regulam negativamente a apoptose [39], especialmente no final do curso da infecção crónica [40]. Esta resposta adaptativa das células epiteliais para resistir a apoptose em crônica H. pylori
pode contribuir para a H. carcinogênese pylori
induzida gástrica [41]. A resposta apoptótica das células epiteliais gástricas para H. pylori
também é dependente de factores de virulência específicos de tensão. Por exemplo, a infecção com estirpes de PAI-positiva cag pode induzir apoptose mais rapidamente do que as estirpes cag PAI-negativos [42]. O H. pylori vacA
produto do gene estimula a via de apoptose que leva intrínseca para a libertação mitocondrial de citocromo c, e activação de caspase-3 [43]. apoptose induzida por VacA está associada a uma redução da STAT3 levando à regulação negativa de Bcl-2 e Bcl-X _{G [43]. Noutro estudo, demonstrou-se que H. pylori
induz a apoptose através de uma via envolvendo a indução sequencial de apical a actividade da caspase-8, as proteínas pró-apoptóticas Bad e Bid, a actividade da caspase-9 e caspase-3 efectora actividade [44].}

nosso estudo descreve outro mecanismo pelo qual H. pylori
podem promover a apoptose em células de cancro gástrico, especificamente através da promoção RKIP fosforilação. A capacidade de inibir a RKIP Raf /MAPK sinalização [26], [27] e promovem a apoptose tem sido bem documentada [29]. A interacção das teses vias e níveis de expressão RKIP tem sido implicada em muitos passos de formação de tumores e /ou progressão [30]. Além disso, a sobre-expressão de resultados RKIP na inibição de metástase e invasão em vários modelos de tumores [45] - [48]. O mecanismo subjacente da expressão diferencial de pRKIP e RKIP não é conhecido. Esperávamos que os níveis relativamente elevados de pRKIP após a infecção pode se correlacionam com níveis RKIP inferiores. No entanto, descobrimos que H. pylori
resultou na degradação da proteína RKIP, possivelmente permitindo a indução de sinalização MAPK e apoptose no cancro gástrico após H. pylori
infecção. RKIP fosforilação mediada por PKC podem perturbar a capacidade de RKIP para se ligar a Raf e inibir a sinalização MAPK [31], no entanto, até hoje não houve relatórios anteriormente nenhum sobre o papel de pRKIP na regulação da apoptose. Estudos prévios realizados em nosso laboratório demonstraram que os resultados RKIP superexpressão na ativação direta de pró-caspase 8 [29]. Embora phosphoryation resultados em relocalization nuclear, seguida por activação do seu próprio RKIP transcrição, os níveis de proteína RKIP não aumentam. Isto sugere um mecanismo diferente da regulação RKIP do que o que foi previamente relatado. Estamos actualmente a analisar o mecanismo pelo qual pRKIP desencadeia a apoptose em células de cancro gástrico após a H. pylori
infecção.

CAG-positivo H. pylori
regular positivamente de forma significativa os genes associados a EMT caracol, lesma e vimentina em associação com a indução de MMP-7, sugerindo um papel para estas proteínas em desenvolvimento do cancro gástrico [49]. Em nosso estudo observamos a rápida indução de proteína pRKIP depois H. pylori
infecção, e um aumento na transcrição RKIP, e uma sobre-regulação de ARNm e a expressão da proteína Snail. Embora Snail foi identificado como um repressor da transcrição do RKIP [25], o nosso estudo indica que, provavelmente, não tem efeito sobre a forma fosforilada de RKIP, uma vez que após a infecção, não observamos uma repressão da transcrição RKIP.

Infecções com cepas de H cagPAI-possuindo. pylori
estão associados com uma resposta inflamatória mais forte no estômago e representar um risco maior de desenvolver úlceras pépticas ou cancro do estômago do que as estirpes que não possuem a ilha cag [36]. H. pylori
induz uma resposta inflamatória intensa e localmente níveis elevados de diversas citocinas incluindo a interleucina 6 (IL-6) [34].

• PLOS ONE: Programmed quimioterapia para pacientes com metastático não ressecável Câncer Gástrico
• PLOS ONE: medição quantitativa de ácidos orgânicos em tecidos de pacientes com câncer gástrico indica aumento metabolismo da glicose em Câncer Gástrico