PLoS ONE: Ген Экспрессия Подпись приобретенному химиорезистентность цисплатин и фторурацил полихимиотерапии в больных раком желудка

Абстрактный

Фон
<р> Мы инициировали проспективное исследование для выявления транскрипционные изменения, связанные с приобретенной устойчивостью химиотерапии от до и после биопсии образцов из того же пациента и выявить потенциальных молекулярных путей, участвующих в неэффективности лечения, чтобы помочь терапевтических альтернатив.

Методология /Основные выводы
<р> перспективный, высокой пропускной способности исследования транскрипционных профилирование проводили с использованием образцов эндоскопические биопсии от 123 метастатических больных раком желудка, предшествующих цисплатином и фторурацилом (CF) комбинированная химиотерапия. 22 пациентов, которые первоначально ответили на CF были повторно биопсию после того, как они развивали резистентность к CF. Приобрела подпись сопротивление химиотерапии была определена путем анализа профилей экспрессии генов из согласованного до и после CF обработанных образцов.
<Р> Приобретенный подпись сопротивление было в состоянии отделить отдельную когорту 101 вновь диагностированных больных раком желудка в зависимости от времени до прогрессирования после CF. Иерархическая кластеризация с использованием приобретенной устойчивости подписи 633-гена (выбор особенность при P
&л; 0,01) разделили 101 предварительной обработки образцов пациентов на две группы с существенно разное время до прогрессирования (2,5 против 4,7 месяцев). Это 633-ген подпись включал повышающую регуляцию AKT1
, EIF4B
и RPS6
(МРМ путь), репарации ДНК и метаболизм наркотиков гены, и обогатилась генов избыточно экспрессируется в эмбриональных стволовых клеток подписей. А приобрело сопротивление подписи 72-ген (подмножество 633 генов подписи также были определены в клеточных связанных наборов генов ES) был независимым предиктором времени до прогрессирования (скорректированное P
= 0,011) и выживаемость (скорректированное P
= 0,034) из этих 101 пациентов.

Заключение /Значение
<р> Эта подпись может предложить новый взгляд на определение новых целей и методов лечения, необходимых для преодоления приобретенной резистентности рака желудка для CF.
<р> Образец цитирования: Ким HK, Choi IJ, Ким, Ким CG HS, Осима A, Michałowski A и др. (2011) Ген Экспрессия Подпись приобретенному химиорезистентность цисплатин и фторурацил полихимиотерапии в больных раком желудка. PLoS ONE 6 (2): e16694. DOI: 10.1371 /journal.pone.0016694
<р> Редактор: Alfons Navarro, Университет Барселоны, Испания
<р> Поступило: 10 сентября 2010 года; Принято: 24 декабря 2010 года; Опубликовано: 18 февраля, 2011
<р> Это статья с открытым доступом распределяются в соответствии с положениями декларации Creative Commons Public Domain, который предусматривает, что после того, как размещены в свободном доступе, эта работа может свободно воспроизводиться, распространяться, передана, изменена, построена на, или иным образом использоваться кем-либо для любых законных целей
<р> Финансирование:. Эта работа была частично поддержана Национальным институтом интрамурального программы здравоохранения, Центра по исследованию рака, Национальный институт рака; от Корейского Национального онкологического центра Грант 0910570 и Программой научно-исследовательский центр сходящихся через Министерство образования, науки и техники (2010K001121). Доноры не играет никакой роли в дизайн исследования, сбора и анализа данных, решение о публикации или подготовки рукописи
<р> Конкурирующие интересы:.. Авторы заявили, что не существует никаких конкурирующих интересов

Введение
<р> Понимание того, как опухоли развиваются на молекулярном уровне, чтобы преодолеть цитотоксические эффекты химиотерапии является важным шагом в разработке терапевтических подходов, которые будут препятствовать или преодолеть химическую устойчивость. Тем не менее, из-за трудностей в получении последовательных опухолевые биопсии от пациентов на различных этапах терапии, выявление молекулярных изменений, которые происходят как опухоли стали устойчивыми к терапии была неприятной проблемой. Последовательный сбор твердых образцов опухолей из одних и тех же пациентов было чрезвычайно трудно в клинических условиях, но рак желудка дает уникальную возможность для этой цели, так как она часто сначала реагирует на химиотерапию и повторные эндоскопические могут быть выполнены для мониторинга реакции опухоли на химиотерапия.
<р> В этом исследовании образцы эндоскопические биопсии были собраны у больных раком желудка. Мы определили выражение генов подписи приобретенного химиорезистентности к цисплатин и фторурацил (CF) комбинированной химиотерапии, путем сравнения образцов, собранных до CF терапии с образцами, взятых у тех же пациентов в сопротивлении времени на МВ, разработанные на основании объективных клинических прогрессии. Используя этот подход, мы могли бы определить молекулярные кандидатов, которые, возможно, привести к разработке новых методов лечения для целевых рака желудка. Важно отметить, что мы также обнаружили, что приобретенный химиорезистентность подпись может определить, будет ли вновь диагностированных больных раком желудка имеют короткий или более устойчивый ответ CF терапию. Так как приобрела подпись сопротивление уже широко представлена ​​в неответчиков и что кажется маловероятным, что многочисленные выражения изменения, происходящие на глобальном уровне будет развиваться в течение относительно короткого периода времени, наши результаты по всей видимости, поддерживают традиционную, клонального модель выбора опухолевой прогрессии и приобрела химиорезистентность [1]. Определение биомаркеров, которые отличают больных раком, которые будут или не выиграют от цитотоксической химиотерапии позволит значительно улучшить клиническое управление. Хотя исследования с использованием высокой пропускной транскрипции профилирование образцов предварительной обработки биопсии попытались идентифицировать такие предсказатели, производительность этих предсказателей было неоднозначным [2]. Отчасти это может быть связано с трудностями выявления устойчивых подписей генов в опухолях из популяций с большой генетической изменчивости. Наши данные свидетельствуют о том, что экспрессия профилирование образцов доочистки может быть возможным альтернативный подход.
<Р> Некоторые исследования показали, что опухоли, которые развиваются химическую устойчивость могут приобретать определенные свойства, присущие стволовым клеткам, и что лечение химиотерапией приводит к сопутствующему обогащению рака стволовые клетки в пробирке
[3]. Кроме того, мы показали, что извлеченный сигнатурный сопротивление обогащена генов, ранее идентифицированных в эмбриональных стволовых (ES) подписей экспрессии клеток, дополнительно предполагая, что для рака желудка, химиорезистентность возникает в результате селекции ранее существовавших клеток с определенными характеристиками стволовых клеток.

материалы и методы

начисление пациента и последующие
<р> Это часть проспективного исследования, утвержденной Institutional Review Board (IRB) Национального онкологического центра больницы в Коян, Южная Корея (NCCNHS01-003). Все участники подписали IRB-утвержденную форму информированного согласия. Право на зачисление в исследование были включены следующие параметры: 1) возраст ≥18 лет; 2) гистологически подтвержденный аденокарциномы желудка; 3) клинически документированные отдаленные метастазы; 4) иные, чем рак желудка не предыдущие или сопутствующие злокачественные опухоли; 5) отсутствие в анамнезе химиотерапии, либо адъювант или паллиативная; и 6) адекватной функции всех основных органов. Пациенты, которые были потеряны для последующего наблюдения до завершения 6 циклов химиотерапии, за документально прогрессирующего заболевания, за исключением, были исключены из анализа.
<Р> Наше проспективное исследование было 2 цели. Первая цель, которая находится в центре внимания другого [4] бумаги, заключалась в разработке геномную упреждения для первоначального ответа химиотерапии путем соотнесения выражение профилирование данных образцов предварительной обработки с клиническим исходом ( внутреннее сопротивление исследование
). Размер выборки исследования было запланировано на основе этой первой цели. Для обучающей выборки, оценивались 91 событий, которые будут необходимы при а = 0,001, р = 0,05, т (стандартное отклонение интенсивности LOG) = 0,75 и δ (отношение риска, связанного с одной единицы изменения интенсивности лог) = 2. Следовательно, 96 образцов предварительной обработки были собраны в период с августа 2001 г. по январь 2005 г. в качестве обучающей выборки (для внутреннее сопротивление исследования
). Вторая группа из 27 подходящих пациентов был зарегистрирован в качестве когорты проверки массива в период с февраля 2005 по апрель 2006 года, который включает в себя 22 пациентов, получавших с МВ и 5 пациентов, получавших цисплатин плюс капецитабина (в фторурацил пролекарства считаются эквивалентными фторурацила; CX ). CX терапия была продемонстрирована быть терапевтически эквивалентен режиму CF метастатического рака желудка [5].
<Р> Вторая цель нашего проспективного исследования, которое преследуется анализов, представленных в этой статье, было определение экспрессии генов подпись для приобретенной химиорезистентности путем сравнения образцов до и после обработки клинического респондеров ( приобретенная устойчивость исследования
). После первоначального эндоскопической биопсии, все пациенты исследования были обработаны и перспективно с последующим планом. Пациенты получали цисплатин (60 мг /м ^{2, D1) в комбинации либо с фторурацилом (1 г /м 2 в течение 5 дней; N = 118) или капецитабина (Кселода; Роше; 1,250 мг /м 2 раза в сутки в течение 2-х недель; п = 5) 5 раз в 3 недели. дозы химиотерапии были снижены в зависимости от токсичности и функционального статуса пациента. Конкретные схемы модификации доз для последующего цикла лечения были по усмотрению лечащего онколога. График лечения фторурацилом может быть сокращен по усмотрению онколога от 5 до 3-х дней для пожилых пациентов (? 70 лет) или у пациентов с плохим статусом (Eastern Cooperative Oncology Group (ECOG) состояния производительности ≥2). Брюшной спираль компьютерной томографии (КТ) проводились для всех пациентов через каждые 3 циклов химиотерапии ( i.e.
, 9 недель). Объективный ответ был зарегистрирован у пациентов с измеримым заболеванием согласно данным Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ) критерии [6]. Частичный ответ (PR) была определена как больше, чем уменьшение суммы произведений 2 больших перпендикулярных диаметров измеряемых повреждений в течение не менее 4 недель 50%, но подтверждение КТ не регулярно проводится через 4 недели после первичной документации по связям с общественностью.}

были 38 пациентов с PR среди 96 обучающей выборки (из внутреннее сопротивление исследования
). Пациенты с PR прошли наблюдали последующей биопсии при прогрессировании заболевания во времени ( i.e.
, Прогрессирующее заболевание, в соответствии с критериями ВОЗ), упоминается как "химиорезистентных государства". Адекватные образцы биопсии от опухолей в химиорезистентных состоянии были получены из 22 больных с ПР (57,9%). Химиорезистентность государственные образцы биопсии остальных 16 пациентов (42,1%) не может быть профилированным либо из-за недостаточного количества /РНК качества или отказа пациентов. Там не было никакого различия по возрасту, полу, гистологическому типу, времени до прогрессирования (ВДП), и общей выживаемости между 22 повторно биопсию пациентов и других 16 пациентов, которые имели связь с общественностью, но не были повторно биопсию. Образцы были собраны по крайней мере, 2 недели после последней дозы фторурацила и
перед запуском второй линии химиотерапии, чтобы свести к минимуму любые острые эффекты препарата на профиля экспрессии.

Два куска грубо-нормальные желудочные образцы ткани слизистой оболочки были также собраны из антрального 21 здоровых добровольцев (таблица S1).

Идентификация приобретенной устойчивости подписи к CF
<р> Эндоскопические биопсии были выполнены, чтобы получить свежую ткань , От пяти до десяти штук свежих тканей опухоли были получены из не-некротического участка опухоли с использованием больших щипцов биопсии чашку диаметром 7,3 мм (Olympus FB-24K-1, Olympus, Токио, Япония). Затем полученные свежие ткани замораживают в жидком азоте в течение 15 мин после первого урожая биопсии. Образцы тканей, содержащих по меньшей мере 50% опухолевых клеток, обрабатывали для РНК, как описано ранее [7]. Один микрограмм тотальной РНК амплифицировали и гибридизовали с массивом картриджа HG-U133A, в соответствии с протоколом производителя (Affymetrix, Санта-Клара, Калифорния). Все данные выражение микрочипов можно найти на экспрессию гена Omnibus (GEO) базы данных (инвентарный номер GSE14210, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo) [НАСТОЯЩЕЕ, рецензента ДОСТУП ТОЛЬКО: HTTP: //www.ncbi .nlm.nih.gov /гео /запрос /acc.cgi маркер = rtgnlocqoqeiwtw &Amp;? акк = GSE14210]. Данные микрочипов экспрессии генов были нормированы Robust многокристальные Average (RMA), используя R2.6. Пред- и пост-CF экспрессии данных из 22 rebiopsied ответчиков были нормированы независимо от данных выражения из отдельной группы 101, не rebiopsied пациентов. Данные микрочипов были проанализированы с использованием BRB ArrayTools (версия 3.6, Национальный институт рака, http://linus.nci.nih.gov/BRB-ArrayTools.html) [8].

изменения экспрессии генов, которые отличали первоначальный транскрипционный статус опухолей из паттернов экспрессии генов, когда опухоли стали химиорезистентных были определены для 22 пациентов с документально первоначальный ответ (PR) на CF-терапии. Согласованные данные микрочипов сравнивали между образцами, полученными до лечения CF и образцов, собранных после того, как устойчивость к терапии, разработанной. Эти данные были проанализированы с помощью алгоритма сравнения класса BRB-ArrayTools (случайная модель дисперсия), которая вычисляет сопряженное т
-test для каждого гена с использованием РМА-суммированные лог-интенсивности для Affymetrix U133A массивов. Гены дифференцированно выражены между этими 22 парных образцах, определенных приобретенную подпись сопротивления. При выбора функции P
-Value отсечек 0,05 и 0,01, было рассчитано значение перестановки P, которое является доля случайных перестановок, которые определяют аналогичное число значимых генов, которые найдены при сравнении истинных метки класса.
<р> Время до прогрессирования была построена с использованием метода Каплана-Мейера. Тест журнала ранга был использован для определения различий между кривыми выживаемости. Тест Вальда был использован для оценки статистической значимости соотношения риска Кокса. Многопараметрические регрессионный анализ с использованием модели пропорционального риска Кокса. Все эти анализы были проведены с использованием программы SPSS (версия 15.0; SPSS Inc., Чикаго, Иллинойс). Multivariable порядковое логистический регрессионный анализ проводили с использованием SAS (с версии 9.1.3, SAS, Cary, NC), чтобы оценить связь между предсказанием индексом 72-гена и рентгенологической реакции.

фактор Транскрипция анализ
<р> анализ фактора транскрипции, были выполнены, чтобы искать обогащения мишеней транскрипционных факторов в генах, содержащей приобретенной устойчивости подписи (BRB-ArrayTools). Все гены запрошенные в этом алгоритме анализа были каталогизированы для транскрипционных факторов, реагирующих категорий на основе экспериментально проверен фактора транскрипции отзывчивости. Транскрипция фактор связывания информации курирование в базе данных транскрипционный регуляторный элемент (TRED) [9] был использован для устранения целей без каких-либо экспериментальной проверки.

Анализ данных микрочипов общественного ДНК от хирургического лечения больных раком желудка
<р> Общедоступная микрочипов данных для хирургического лечение больных желудка порожденных Стэнфордского функциональной геномики фонда были также получены из базы данных NCBI GEO (GSE4007) и включает около 30300 генов, общих для этих наборов данных. Данные микрочипов были получены и нормализованы, как описано в Leung и др
[10]. Пакетные эффекты в экспрессии генов были удалены с зондом-накрест означает центрирование и недостающие данные были вменены с методом усреднения ближайшего соседа [11]. Массив кДНК клонов аннотированный с помощью источника (Stanford Microarray базы данных) и Entrez GeneID был использован в качестве идентификатора для отображения массива Affymetrix HG-U133A.

набор генов сравнение анализ
<р> Набор генов инструмент сравнения анализирует определенные пользователем наборы генов для дифференциальной экспрессии среди заранее определенных классов исходного набора данных. Для каждого исходного набора данных, а P
-value вычисляется для каждого гена соотносить уровень экспрессии против.
Время выживания, используя модель пропорциональных рисков (или для дифференциальной экспрессии между предопределены классов, в зависимости от характера фенотипа), генерируя ранжированный список генов данного проекта BRB-ArrayTools. Для набора N
генов, то LS статистика определяется как среднее значение отрицательного естественного логарифма P
-значения из соответствующих одного гена одномерные испытаний [12]. Сводная статистика вычисляется, что обобщает эти P
значения за определенный пользователем набор генов; суммарная статистика в среднем журнал ( P
) для резюме LS того, как значения P
отличаются от равномерного распределения для LS [12]. Сводная статистика связана с распределением суммарной статистики для случайных выборок N
гены, отбирали пробы из тех, которые представлены на массиве. Здесь N
это число генов в определенных пользователем набора генов. 100000 случайных наборов генов были отобраны для вычисления этого распределения. LS значение P
является доля случайных множеств N
гены с меньшими средними сводные статистические данные, чем LS резюме, вычисленных для реальных данных. Этот подход используется для различных типов корреляций между уровнями экспрессии генов и фенотипа. Характер фенотипа (например, время выживания или бинарных показателей) определяет порядок, в котором вычисляются значения генов конкретных P
. An LS P
значение меньше 0,005 считается значимым.

Идентификация рака желудка конкретной подписи и желудка дифференциации рака сигнатуры
<р> Общую РНК выделяли из замороженного эндоскопических биоптатов антрального слизистой оболочки собирали из 21 здоровых добровольцев и анализировали с помощью микрочипов, как описано ранее. Для того чтобы определить рак желудка конкретной подписи, мы сравнили данные выражения из 21 нормальных образцов с 101 образцов от больных до химиотерапии образцов (за исключением 22 rebiopsied пациенты использовали для разработки приобретенной подписи сопротивления) с использованием алгоритмов сравнения класса BRB- ArrayTools.
<р> из 101 пациентов, 41 пациентов имели кишечную гистологического типа Лорен первичных опухолей и 60 имели диффузный тип. опухоли смешанного типа были отнесены к категории вместе с диффузным типом. Дифференциация подпись была определена путем сравнения данных экспрессии генов из 41 образцов кишечного типа с образцами типа 60 диффузных с использованием алгоритмов сравнения класса BRB-ArrayTools.

Генерация подписей ES клеток из опубликованных данных
<р> Чтобы создать определенный пользователем набор генов для нашего сравнения генов анализа, мы приняли несколько списков генов из опубликованной работы Бен-Porath и др
[13], в котором несколько наборов генов, связанных с идентичностью ES клеток были составлены для набора генов сравнительных анализов. " ES выражение установить
" было определено ранее Бен-Porath и др
[13] как гены более выраженным в клетках ES человека, по крайней мере, 5 из 20 профилирующих исследований [14 ]. Этот ES выражение набор затем с поправками [13], так что гены в "пролиферации" Джин Онтология и кластером пролиферации рака молочной железы [13], [15], были исключены, и упоминается как ES установить без генов пролиферации
. Списки генов-мишеней для MYC [16], Sox2 [17], OCT4 [17], NANOG [17], SUZ12 [18], ЭЭИ [18], и H3K27 [18], которые являются ключевыми факторами транскрипции в стволовых клетках, были также приняты от Бен-Porath [13]. Эти гены были первоначально идентифицированы с помощью исследований массива иммунопреципитации хроматина [16] - [18]. Для нашего набора генов сравнительных анализов, ENTREZ идентификаторы [13] генов-мишеней были нанесены на карту, чтобы исследовать набор идентификаторов на массиве HG-U133A (www.NetAffx.com).

Определение прогнозного индекса 72-гена

Среди 468 генов активируемых в химиорезистентных состоянии ( P
&л; 0,01), 72 уникальных генов были членами по крайней мере один из 4 опубликованной ES клеток, связанных с генных наборов <бр> ( " ES установить без генов пролиферации
" [13], [15], экспериментально апробированы MYC транскрипции набора генов-мишеней фактор (TRED MYC_T00140) [9], а также целевые гены MYC и SOX2 идентифицированы исследование иммунопреципитация хроматина массив [16], [17]). Геномную предсказатель (называемый как "72-гена с предсказанием индексом") была построена путем вычисления взвешенной линейной комбинации значений сигналов лог этих 72 уникальных генов перекрывающихся между извлеченный сигнатурный сопротивлением и " эмбриональных стволовых клеток, связанных наборов генов
". Одномерный т
-статистик для сравнения классов (приобретенный химиорезистентных против.
Предварительной обработки состояний) были использованы в качестве весов. BRB-ArrayTools (предсказания класса) был использован для расчета т
-value каждого гена. Предсказательная сила предиктивного индекса 72-гена был испытан на время до прогрессирования и выживаемости с использованием модели пропорциональных рисков Кокса.

Результаты

Идентификация приобретенной устойчивости подписи к CF
<р> Двадцать два пациента, которые продемонстрировали клинический ответ (PR) для CF терапии были биопсию до начала терапии и впоследствии следующие прогрессирование заболевания после химиотерапии. Пре- и образцы после CF существенно не отличались в процентах опухолевых клеток и мер контроля качества микрочипов данных (таблица 1 и таблица S2). Срединный интервал между 2 биопсий составил 8,7 месяца (межквартильный диапазон 6.4-12.6). Так как перестановка значения P
были последовательно менее 0,05 при P
отсечек для отбора признаков 0,01 и 0,05 (перестановка значения P
, 0,012 и 0,006, соответственно), это свидетельствует о том, что экспрессия генов значительно отличается между химиорезистентных и предварительной обработки состояний. Гены дифференцированно выражены между предварительной обработки состояния 22 опухолей, которые оказались изначально реагирует на CF химиотерапии и опухолей из одних и тех же пациентов, после того, как превратилась в приобретаемой химиорезистентных состоянии были идентифицированы как "Приобретаемая подписей сопротивления". 2446 генов были идентифицированы в приобретенной подписи сопротивления с выбором особенностью P
&л; 0,05, в то время как 633 гены были идентифицированы с помощью выбора функции из P
&л; 0,01. Наиболее широко представлена ​​функциональная категория в приобретенной подписи сопротивление синтез белка
(таблица S3; Изобретательность Тропинка анализ [www.ingenuity.com]), которая включает в себя AKT1
, субъединицы рибосомы мРНК ( RPS6, RPL13, RPL14, RPL15, RPL18, RPL29, RPL3, RPL30, RPL4, RPS11, RPS19, RPS9
) и эукариотические факторы инициации трансляции ( EIF4B EIF3D, EIF3E, EIF3F, EIF3H <бр>). Akt MTOR и Ras-МАРК сигнальные модули /два наиболее изученных путей, которые демонстрируют первостепенную влияние на трансляционной регуляции [19]. Учитывая одновременное усиление активности этих ключевых компонентов этого пути ( AKT1
( P
= 0,0012), EIF4B
( P
= 0,0089), и RPS6
( P
= 0,0009)), то PI3K /Akt /MTOR трансдукции сигнала пути предполагается активировать в приобретенном состоянии сопротивления (рис S1). AKT1 был связан с в пробирке
цисплатин сопротивление [20] - [22]. ингибирование MTOR также было известно обратное в пробирке
приобрели устойчивость к гормональной терапии и ингибиторы EGFR рака молочной железы и рака легких, соответственно [23], [24]. Так как ERBB2
является также повышалась в приобретенной подписи сопротивления ( P
= 0,0065), ERBB2
может играть определенную роль в повышающей регуляции синтез белков <бр> гены информации о связанных, посредством активации MTOR пути [25].
<р> анализ фактора транскрипции набор генов сравнения показали, что приобретенная устойчивость подписи обогащается целями нескольких факторов транскрипции, в том числе набор MYC гена-мишени (TRED MYC_T00140) [9] (таблица S4). Это согласуется с микрочипов данных, описанных в литературе, что большинство генов, реагирующих на Мус сверхэкспрессии участвуют в синтезе, макромолекулярном оборота белков, и обмен веществ, в том числе 30 рибосомных генов белка [26].

Приобретенный сопротивление подпись сегрегируется пациентов в зависимости от времени до прогрессирования заболевания после терапии CF, но не является прогностическим в больных раком желудка лечили только хирургическим путем
<р> Мы хотели, чтобы определить, является ли выражение приобретенной подписи сопротивления в желудочном раковых опухолей при начальной диагностике прогнозировать ответ на CF-терапии. Выражение приобретенной подписи сопротивления в отдельной группе 101 не-rebiopsied больных раком желудка была определена и связана с клиническим исходом пациентов в соответствии с которым основным иерархическим кластера были сгруппированы пациенты. У пациентов без поражений первоначально отслежены диагностической визуализации, время до прогрессирования (ВДП) измеряли от начала терапии CF к тому времени, когда изменение в терапии требовалось из-за прогрессирования заболевания недвусмысленной. Иерархическая кластеризация из 101 образцов предварительной обработки проводили с использованием приобретенной устойчивости подписи 2446-гена. Результат, как измерено с помощью TTP значительно отличалась между пациентами в каждой из двух первичных кластеров. У пациентов в группе с повышенной экспрессии генов активируемых в химиорезистентных состоянии был значительно короче, чем у пациентов ТТП с более низкой экспрессии этих генов (Log ранга P
значение = 0,033) (рис 1А). Для того чтобы дополнительно оценить связь этих генов с 2446 TTP 101 пациента, мы также провели анализ для прогнозирования риска выживания BRB-ArrayTools, в котором весь процесс перекрестной проверки 10-кратный повтор ли с использованием 2,446 генов и логарифмически Оценка статистики для ТТП от 2 предсказывал групп риска была получена для каждого случайного набора данных с данными ТТП перетасованную среди 101 пациентов [8], [27]. Перестановка P значение
для проверки нулевой гипотезы, что нет никакой связи между генами и 2446 TTP, которая является хвост площадь этого нулевого распределения за пределы значения логарифмического, полученные для реальных данных, по оценкам 0,06 , что указывает на пограничное значение ассоциации. У пациентов в группе с повышенной экспрессией 468 генов, активируемых в химиорезистентных состоянии при P
&л; 0,01 и была значительно короче ТТП, чем у пациентов с более низким экспрессии этих генов (Log-Rank P <бр> значение = 0,012) (рис 1B). Эти результаты свидетельствуют о том, что приобретенная подпись сопротивления отражает реальную молекулярную профиль химиорезистентных клонов, а не неспецифических эффектов препарата.
<Р> Мы также хотели бы дальнейшего рассмотрения, были ли эти полученные сигнатуры сопротивления прогнозирования CF ответа или представляет собой общую прогностическую подпись, которая может предсказать выживаемость 88 больных раком желудка, которых лечили хирургическим путем в одиночку, а не химиотерапии 10. Ни один из двух приобретенных подписей сопротивления (2446 или 633 генов) была предиктором выживания в хирургического лечения больных раком желудка с использованием того же иерархического метода кластеризации, как описано выше (Log ранга значения P
, 0,84 и 0,41, соответственно ). Таким образом, приобретенная подпись сопротивление прогнозирования реакции пациента на МВ, а не только прогностическое для больных раком желудка в целом.

подписные акции приобрели устойчивость много общих черт с собственной подписью сопротивление, но не с желудочной железы с удельная подпись или желудка дифференциации рака подпись
<р> Эти приобретенные сигнатуры сопротивления были сопоставлены с внутренней лекарственной устойчивостью подписью отдельную группу из 101 не-rebiopsied пациентов, используя анализ набора генов сравнения из BRB-ArrayTools [12] , Если коротко, то этот алгоритм вычислили P
-value для каждого из 2446 генов соотносить уровень экспрессии VS.
TTP этих 101 пациентов, используя модель пропорциональных рисков. Затем вычисляется в виду отрицательный натуральный логарифм из P
-значения из единственного гена одномерные испытаний (LS статистики этого набора 2446 генов), а доля случайных наборов 2446 генов с меньшими средними сводные статистические данные, чем LS резюме вычисляется для реальных данных (LS P значение
). Такой же анализ был повторен для 633 генов, выбранных в P
≪ 0,01. В соответствии с результатами анализа иерархической кластеризации, были найдены быть сильно обогащены «собственной подписи сопротивления" отдельной группы из 101 пациентов с МВ обработанных приобретаемые подписей сопротивления. LS ресемплирования значения P
были &л; 10 -5 для обоих определяемых пользователем наборов генов, выбранных с различными отсечек для определения приобретенной подписи сопротивления ( т.е.
, для 2446 и 633 генов). Гены, перекрывающие между приобретенными и внутренними подписями сопротивления приведены в таблице 2. Рисунок 2С B
графически отображает, что 468 генов активируются в химиорезистентных состоянии 22 rebiopsied пациентов ( P
&л; 0,01) показывают, согласного избыточная экспрессия в не rebiopsied пациентов с более короткой ТТП, в то время как 165 генов подавляются в химиорезистентных состоянии показать конкордантный сверхэкспрессии у пациентов с более ТТП.
<р> Используя аналогичный набор генов сравнения анализы, полученные подписи сопротивления были сопоставлены с " рак желудка конкретной подписи
" и "желудочный дифференцировки рака подпись
" этих 101 пациентов. Для сравнения приобретенной устойчивости подписи с " желудочной канцер-специфической сигнатуры
", Л. С. статистикой 2446 генов в приобретенной подписи сопротивления была оценена путем вычисления среднего отрицательный натуральный логарифм P
-значения из единственного гена одновариантных тестов для дифференциальной экспрессии каждого из 2446 генов между 101 больных раком желудка и 21 здоровых добровольцев. Никакого значительного перекрытия в экспрессии генов не наблюдалось сравнение извлеченный сигнатурный сопротивления к " желудочной канцер-специфической сигнатуры
" (LS P
значение = 0,96; Таблица S5). Точно так же, не было никакого существенного перекрытия между 2446-гена приобретенной подписи сопротивление и "желудочный дифференцировка рака подпись
", что мы идентифицировали путем сравнения экспрессии генов между intestinal- Лорена (n = 41) по сравнению с диффузным
типа (п = 60) опухоли, либо (LS P
значение = 0,024; Таблица S5). Эти результаты позволяют предположить, что приобретенная подпись сопротивления представляет собой набор генов дизрегуляции в ассоциации с химиорезистентности, а не рака вообще.

Приобретенные акции сопротивления подписи особенности с подписями стволовых клеток
<р> Учитывая, что сложные регуляторные сети в стволовых клетках может быть лучше всего детектируется анализа экспрессии многих генов, мы провели несколько набор генов сравнения анализирует сравнивая наши приобретенные подписи сопротивления с опубликованными подписей эмбриональных стволовых клеток, как сообщает Бен-Porath и др
<вир> 13 (таблица S6). Мы предположили, что сравнение приобретенной устойчивости подписи с подписями ES клеток будет информативным, так как было высказано предположение, что клетки-предшественники рака обладают стволовые клетки, как черты [28].
<Р> Наша приобретенная устойчивость подписи, в отличие от