PLOS ONE: Statiner dämpa Helicobacter pylori CagA translokation och minska Förekomst av Gastric Cancer: In vitro och populationsbaserade fall-kontrollstudier

Abstrakt

Gastric cancer är den näst vanligaste orsaken till cancerrelaterad död i världen. Korrelationen mellan Helicobacter pylori Mössor och etiologin av magcancer var i huvudsak säker. Kolesterolrika mikroområden (även kallade lipidaggregat), som tillhandahåller plattformar för signalering, är förknippade med H
. pylori
inducerad patogenes som leder till magsäckscancer. Patienter som har ordinerats statiner, hämmare av 3-hydroxy-3-metyl glutaryl-coenzym A (HMG-CoA) reduktas, har uppvisat en minskad risk för flera olika typer av cancer. Emellertid har inga studier behandlas effekten av statiner på H
. pylori
-associated magcancer från den antineoplastiska perspektiv. I denna studie visade vi att behandling av gastriska epitelceller med simvastatin minskade graden av cellulär kolesterol och ledde till dämpning av translokation och fosforylering av H
. pylori
cellgift associerad gen A (CagA), som är erkänd som en viktig faktor för magcancer utveckling. Dessutom var en rikstäckande fall-kontrollstudie baserad på data från den taiwanesiska National Health Insurance forskningsdatabas (NHIRD) genomförs. En populationsbaserad fallkontrollstudie visade att patienter som använde simvastatin uppvisade en signifikant minskad risk för magcancer (justerad oddskvot (OR) = 0,76, 95% konfidensintervall (CI) = 0,70-0,83). Hos patienter som uppvisar H
. pylori
infektion som har ordinerats simvastatin, den justerade ELLER för magcancer var 0,25 (95% CI = 0,12-0,50). Våra resultat kombinerat en In vitro
studie med en rikstäckande populationsanalys visar att statinanvändning kan vara en framkomlig väg för att förhindra H
. pylori
-associated gastric cancer

Citation:. Lin C-J, Liao W-C, Lin H-J, Hsu Y-M, Lin C-L, Chen Y-A, et al. (2016) Statiner dämpa Helicobacter pylori
CagA translokation och minska Förekomst av Gastric Cancer: In Vitro Mössor och populationsbaserade fall-kontrollstudier. PLoS ONE 11 (1): e0146432. doi: 10.1371 /journal.pone.0146432

Redaktör: Saeid Ghavami, University of Manitoba, Kanada

Mottagna: 8 augusti, 2015, Accepteras: 15 december 2015, Publicerad: 5 Januari 2016

Copyright: © 2016 Lin et al. Detta är en öppen tillgång artikel distribueras enligt villkoren i Creative Commons Attribution License, som tillåter obegränsad användning, distribution och reproduktion i alla medier, förutsatt den ursprungliga författaren och källan kredit

datatillgänglighet: Alla relevanta uppgifter är inom pappers-

Finansiering:. Denna studie stöddes av bidrag (DMR-103-018, DMR-103-020, CMU102-BC-2, och CMU102-S-28) som tillhandahålls av Kina Medical University och sjukhuset, Taiwan ministeriet för hälsa och välfärd Clinical Trial and Research Center of Excellence (MOHW104-TDU-B-212-113002), hälsa och välfärd avgift på tobaksprodukter, Kina Medical University Hospital Cancer Research Center of Excellence (MOHW103-TD- B-111-03), ministeriet för vetenskap och teknik (103-2633-B-182-001 och 104-2320-B-182-040), Chang Gung Memorial Hospital (CMRPD1F0011-3), och i morgon Medicine Foundation. Finansiärerna hade ingen roll i studiedesign, datainsamling och analys, beslut att publicera, eller beredning av manuskriptet

Konkurrerande intressen:.. Författarna har förklarat att inga konkurrerande intressen finns

Introduktion

Helicobacter pylori
, en gramnegativ mikroaerofil spiral bakterien, koloniserar människans mage och infekterar över 50% av befolkningen i världen [1,2]. Ihållande H
. pylori
infektion är associerad med flera gastroenterologiska sjukdomar, inklusive gastrit, magsår och magcancer [3]. H
. pylori
kan penetrera slemhinneskiktet och överleva intracellulärt i magsäckens epitelceller, därmed flyr värd immunsvar eller antimikrobiell behandling [4,5].

Flera virulensfaktorer utmärker H
. pylori
inducerad patogenes [6]. Cellgift associerade genen A (CagA) är en av de mest kritiska virulensfaktorer av H
. pylori
[7,8]. Translokation av CagA av CAG
-pathogenicity ö ( CAG
-PAI) kodat typ IV sekretionssystem (TFSS) resulterar i fosforylering av Glu-Pro-Ile-Tyr-Ala ( Epiya) motiv och induktion av värdcell patogenes, såsom cellförlängning (kolibri fenotyp) [9], induktion av nukleär faktor (NF) -κB aktivering, interleukin (IL) -8 utsöndring [10], och cancer [11].

Det har rapporterats att H
. pylori
utnyttjar kolesterolrika mikroområden (även kallade lipidaggregat) för internalisering av celler [12,13], så många patogener gör [14-16]. De viktigaste komponenterna i lipidaggregat inkluderar kolesterol, fosfolipider och sfingolipider, som interagerar och skapar stela mikrodomäner i cytoplasman membranet [17]. Flera flotte-tillskansa eller sönderdelningsmedel, såsom simvastatin, metyl-β-cyklodextrin (MβCD), och filipin har i stor omfattning användes vid undersökning av de biologiska funktionerna och kompositionerna enligt lipidaggregat [18]. Behandling av celler med kolesterol tillskansa medel kan dissociera flotte-associerade proteiner och lipider och göra strukturen fungerar inte [19]. Utarmning av kolesterol har visat sig dämpa CagA-inducerad patogenes, vilket tyder på att leveransen av CagA i epitelceller är kolesterolberoende [20,21]. Dessutom är translokeras CagA bunden till den inre bipacksedel av plasmamembranet genom direkt bindning av fosfatidylserin [13]. Detta tyder på att H
. pylori
kan fint manipulera membran kolesterol som bidrar till CagA funktioner och patogenes.

Enligt internationella cancerrapporten 2014, är magcancer den femte vanligaste cancerformen och den tredje vanligaste orsaken till cancerrelaterade dödsfall över hela världen [22]. Kolesterol-rika mikrodomäner, som ger plattformar för signalering, tros vara associerade med utvecklingen av olika typer av cancer [23]. Dessutom, kolesterolrika flottar spela en avgörande roll i H
. pylori
inducerad patogenes och dess progression till magcancer [24,25]. En nyligen genomförd populationsbaserad fallkontrollstudie visade att patienter som behandlades med statiner som hämmar 3-hydroxy-3-metyl glutaryl-coenzym A (HMG-CoA) reduktas, det hastighetsbegränsande enzymet i biosyntesen av kolesterol, uppvisade minskad risk för magcancer [ ,,,0],26]. Men den molekylära mekanismen bakom statin användning dämpa risken för H
. pylori
-associated magsäckscancer har inte klarlagts. I denna studie undersökte vi effekten av statiner på gastric cancerrisk i denna landsomfattande populationsbaserad fallkontrollstudie och undersökte interaktionen av kolesterolsänkande statiner och H
. pylori
CagA-inducerad patogenes.

Material och metoder

A. Experimentell studie

Reagens och antikroppar.

CagA antikropp och fosfotyrosin (4G10) antikropp köptes från Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA). Lipofectamine 2000 köptes från Invitrogen (Carlsbad, CA, USA). Luciferas-substrat och β-galaktosidas-expressionsvektor köptes från Promega (Madison, MA, USA). Simvastatin, lovastatin, RhoA hämmare (Y27632) och alla andra kemikalier var av högsta kvalitet kommersiellt tillgängliga och köptes från Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA).

Cell och bakteriekultur.

mänskliga gastriska epitelceller (AGS-celler, ATCC CRL 1739) odlades i F12 (GibcoBRL, NY, USA). MKN45-celler (JCRB0254, RIKEN Cell Bank, Japan) odlades i Dulbeccos minimala essentiella medium (HyClone, Logan, UT, USA). TSGH9201-celler odlades i RPMI 1640-medium (Gibco Laboratories, Grand Island, NY, USA). Tio procent de-kompletterade fetalt bovinserum (Hyclone) sattes till alla kulturer. Penicillin och streptomycin (GibcoBRL) användes vid behov. Antibiotika inte till cellodlingsmediet i H
. pylori
infekterade analys. H
. pylori
26695 (ATCC 700392) odlades rutinmässigt på Brucella blodagarplattor (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ, USA) innehållande 10% fårblod under 5% CO _{2 och 10% O 2 förhållanden vid 37 ° C under 2-3 dagar.}

Analys av cellviabilitet och cellulär kolesterol.

Gastric epitelceller behandlades med eller utan olika koncentrationer av simvastatin (0, 10, 20, och 50 ^ M) under 1 h. Trypan blå färgning användes för att mäta effekterna av statin på cellviabilitet [20]. Efter behandling med simvastatin, tvättades cellerna med fosfatbuffrad saltlösning (PBS) och sönderdelades genom ultraljudsbehandling (tre 10-s skurar vid rumstemperatur). Den cellulära kolesterol mättes med användning av en Amplex Red kolesterol analyskit (Molecular Probes) i enlighet med tillverkarens instruktioner [21].

Analys av translokeras CagA och phophorylated CagA.

Immunoprecipitat för analys av H
. pylori
CagA translokation och fosforylering framställdes med hjälp av relevanta tekniker [20]. Immunprecipitaten utsattes för 6,5% SDS-PAGE och överfördes på en polyvinylidendifluoridmembran (Pall, East Hills, NY, USA) för immunoblotanalys. CagA sonderades med hjälp av mus-anti-CagA antikroppar (Santa Cruz Biotechnology) och tyrosin-fosforylerad CagA undersöktes med hjälp av musen antifosfotyrosin antikroppar (4G10) (Upstate Biotechnology, Billerica, MA, USA). För att säkerställa lika laddning av varje beredda provet, var β-aktin från hel-cellysat färgas med get antiactin antikroppar (Santa Cruz Biotechnology). De relevanta proteinerna visualiseras med förstärkt kemiluminescens reagens (GE Healthcare, Buckinghamshire, UK) och detekterades genom exponering för röntgenfilm (Kodak, Boca Raton, FL, USA).

Övergående transfektion av NF-kB reportergen och luciferasaktiviteten analys.

AGS-celler odlades i 12-brunnars plattor i 20 h och transfekterades med en NF-kB-Luc reporter plasmid med användning av Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) [21 ]. Efter en 24-h inkubation för transfektion ades cellerna samodlades i närvaro av 25

• PLOS ONE: låg incidens av synkron eller Metachronous tumörer efter endoskopisk submukosala Dissection för tidig ventrikelcancer med odifferentierad Histology
• PLOS ONE: DNA-metylering i Exon 1 regionen och Complex förordning av TWIST1 Expression i Gastric Cancer Cells