PLOS ONE: microARN-9 Suprime la proliferación, invasión y metástasis de células de cáncer gástrico a través de orientación y ciclina D1 Ets1

Extracto

La evidencia reciente muestra que las alteraciones en la expresión de microARN-9 (miR-9) está implicada en la progresión del cáncer gástrico. Sin embargo, el papel exacto y los mecanismos subyacentes de miR-9 en la proliferación, invasión y metástasis de cáncer gástrico sigue siendo desconocido. En este estudio, miR-9 fue encontrado para ser reguladas por e inversamente correlacionada con la expresión de ciclina D1 y el virus de la eritroblastosis v-ets E26 homólogo de oncogén 1 (Ets1) en los tejidos de cáncer gástrico y líneas celulares. Bioinformática análisis reveló los supuestos sitios de unión de miR-9 en las regiones 3 'no traducidas (UTR 3') de la ciclina D1 y ARNm Ets1. La expresión ectópica o desmontables de miR-9 dio lugar a la expresión en respuesta alterada de ciclina D1, Ets1 y sus objetivos de abajo retinoblastoma fosforilada y de las metaloproteinasas de matriz 9 en líneas celulares de cáncer gástrico cultivadas SGC-7901 y AGS. En el sistema indicador de luciferasa, miR-9 dirigidos directamente a la 3'-UTR de la ciclina D1 y Ets1, y estos efectos fueron abolidas mediante la mutación de los sitios de unión de miR-9. La sobreexpresión de miR-9 suprimió la proliferación, invasión y metástasis de las SGC-7901 y las células AGS in vitro Opiniones y in vivo
. Restauración de miR-9-mediada baja regulación de la ciclina D1 y Ets1 mediante transfección transitoria, rescató las células de cáncer de disminución en la proliferación, la migración y la invasión. Por otra parte, inhibidor anti-miR-9 promovió la proliferación, la migración y la invasión de células de cáncer gástrico, mientras que golpear abajo de ciclina D1 o parcialmente Ets1 phenocopied los efectos de miR-9 sobre-expresión. Estos datos indican que miR-9 suprime la expresión de la ciclina D1 y Ets1 a través de los sitios de unión en su extremo 3 'UTR, inhibiendo así la proliferación, invasión y metástasis de cáncer gástrico

Visto:. Zheng L, Qi T, Yang D, Qi M, Li D, Xiang X, et al. (2013) microARN-9 suprime la proliferación, invasión y metástasis de células de cáncer gástrico a través de orientación y ciclina D1 Ets1. PLoS ONE 8 (1): e55719. doi: 10.1371 /journal.pone.0055719

Editor: Alejandro H. Corvalan, Pontificia Universidad Católica de Chile, Chile

Recibido: 14 Septiembre, 2012; Aceptado: December 29, 2012; Publicado: 31 Enero 2013

Derechos de Autor © 2013 Zheng et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan

Financiación:. Con el apoyo de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (Nº 30600278, Nº 30772359, Nº 81071997, Nº 81072073, Nº 81272779), Programa para el Nuevo siglo talentos excelentes en la Universidad (NCET-06-0641), la Fundación de Investigación Científica para el regresado de ultramar estudiosos chinos (2008-889), y Fondos de investigación Fundamental para las Universidades central (2012QN224). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito

Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia

Introducción

el cáncer gástrico es el cuarto cáncer más común en el mundo [1]. A pesar de la mejora en el tratamiento quirúrgico y multimodal, el pronóstico del cáncer gástrico avanzado sigue siendo pobre debido a la recurrencia, invasión y metástasis, con una tasa de supervivencia a 5 años por debajo del 30% [1]. Un mejor conocimiento de los mecanismos subyacentes a la progresión del tumor se justifica para descubrir nuevos paradigmas para el diagnóstico y tratamiento del cáncer gástrico [2]. Los microARN (miARN), una categoría recientemente identificado de la pequeña y altamente conservadas ARN no codificantes, pueden participar en la regulación post-transcripcional de la expresión génica a través complementaria parcial de unión con las regiones 3 'no traducidas (3'-UTRs) de ARNm diana, lo que resulta en traslacional represión o ARNm degradación [3]. Nuevas pruebas muestran que los miRNAs están involucrados en los procesos biológicos relacionados con la apoptosis, proliferación, diferenciación, invasión y metástasis, mientras que la desregulación de los cuales es crucial para la iniciación y progresión del cáncer [3]. En la actualidad es urgente para investigar el papel de los miRNAs y sus genes diana en la progresión tumoral en modelos experimentales.

En el cáncer gástrico humano, se ha informado de una serie de miRNAs ser aberrante sobre-expresado o regulado hacia abajo durante la progresión del cáncer gástrico, incluyendo el miR-21 [4], el miR-15b [5], el miR-16 [5], y miR-101 [6]. Estos miRNAs juegan un papel oncogénico o supresores tumorales en la regulación del crecimiento celular, la migración y la invasión por la represión de sus genes diana. Por ejemplo, oncogénica miR-21 es de forma aberrante sobre-expresado en el cáncer gástrico, y aumenta la proliferación y la invasión de células de cáncer gástrico por la orientación de proteína rica en cisteína reversión inductor con motivos Kazal [4]. Mientras tanto, el miR-15b y miR-16 son las reguladas en el cáncer gástrico, y contribuyen a la resistencia a múltiples fármacos de células de cáncer gástrico mediante la modulación de la apoptosis a través de la orientación de las células B de leucemia /linfoma 2 [5]. miR-101 es regulada hacia abajo en gástrico tejidos de cáncer y líneas celulares, mientras que la expresión ectópica de miR-101 inhibe significativamente la proliferación, la migración y la invasión de células de cáncer gástrico por la orientación potenciador de homólogo zeste 2, el citocromo c oxidasa subunidad II, y mieloide secuencia de la leucemia de células 1 [6]. Por lo tanto, ha sido un foco para explorar aún más la expresión y función de los genes miARN en la biología del tumor de cáncer gástrico.

microARN-9 (miR-9) se identificó por primera vez como uno de los reguladores cruciales para el desarrollo , fisiología y patología del sistema nervioso en varios organismos, incluidos los Drosophila
, pez cebra y mamíferos [7] - [9]. Una serie de estudios posteriores han demostrado que las alteraciones en la expresión de miR-9 se asocia con el desarrollo y progresión de cánceres [10] - [14]. Estudios previos indican que el miR-9 es significativamente baja regulado en el cáncer gástrico, lo que implica sus posibles funciones en la progresión tumoral [15] - [18]. También se indica que el miR-9 puede modular la proliferación de células de cáncer gástrico a través de la orientación del tipo homeobox caudal 2 (CDX2) [19] y NF-kappa B (NF-kB) [16]. Sin embargo, la función exacta y los mecanismos subyacentes de miR-9 en la progresión del cáncer gástrico todavía merecen una investigación adicional. En este estudio, hemos demostrado, por primera vez, que el miR-9 se dirige directamente a la ciclina D1 y v-ets virus de la eritroblastosis E26 homólogo 1 de oncogén (Ets1), y suprime la proliferación, invasión y metástasis de las células de cáncer gástrico In Opiniones y vitro in vivo
.

Resultados

miR-9 se había reducido regulado e inversamente correlacionada con la expresión de ciclina D1 y Ets1 en tejidos de cáncer gástrico y líneas celulares

Para investigar la expresión de miR-9 en el cáncer gástrico, cáncer de los tejidos gástricos y la mucosa adyacente no neoplásico se obtuvieron de 86 casos primarios. En tiempo real de transcripción inversa cuantitativa PCR (RT-PCR) reveló que el miR-9 se había reducido regulado en los tejidos de cáncer gástrico que en la mucosa adyacente no neoplásico ( P = 0,001
, fig. 1A). La expresión de miR-9 fue significativamente menor en los casos de cáncer gástrico con la más profunda invasión de la pared gástrica ( P Hotel < 0,001), metástasis de ganglios linfáticos ( P Hotel < 0,001), metástasis a distancia ( P = 0,022
), y la fase avanzada TNM ( P
= 0,01) (Tabla S1). Por el contrario, el aumento de la ciclina D1 y los niveles de transcripción Ets1 se detectaron en tejidos de cáncer gástrico ( P
< 0,0001 y P
<.. 0,0001, respectivamente, Fig 1B y la figura 1C). Hubo una correlación inversa entre el miR-9 expresión y ciclina D1 niveles de transcripción en los tejidos de cáncer gástrico ( P
. ≪ 0,001, figura 1D). Además, una correlación inversa entre el miR-9 expresión y los niveles de transcripción Ets1 también se observó en estos tejidos de cáncer ( P Hotel < 0,001., Figura 1E). Bajo la expresión de miR-9 y altos niveles de transcripción de ciclina D1 y Ets1 se observaron en líneas celulares de cáncer gástrico que los de GES-1 células epiteliales gástricas normales [20] (Fig. 1F). La tinción inmunohistoquímica se realizó para observar la expresión de la ciclina D1 y Ets1 en estos especímenes de cáncer (Fig. S1). ciclina D1 nuclear se observó en 26/86 (30,2%) de los casos, mientras que se observó tinción nuclear y citoplasma de Ets1 en 58/86 (67,4%) casos (Tabla S1). La inmunorreactividad de la ciclina D1 y Ets1 fue significativamente mayor en los casos de cáncer gástrico con la más profunda invasión gástrica pared ( P Hotel < 0,001 y P
= 0,001), la metástasis de los ganglios linfáticos ( P Hotel < 0,001 y P Hotel < 0,001), metástasis a distancia ( P Hotel < 0,001 y P Hotel < 0,001), y el estadio TNM avanzada ( P Hotel < 0,001 y P
= 0,004) (Tabla S1). Bajo la expresión de miR-9 se observó en los tejidos de cáncer gástrico con mayor inmunotinción de la ciclina D1 ( P
< 0,0001, Figura 1G.) O Ets1 ( P
. ≪ 0,0001, Fig 1H ). Estos resultados indicaron que el miR-9 se redujo reguladas e inversamente correlacionada con la expresión de la ciclina D1 y Ets1 en tejidos de cáncer gástrico y líneas celulares.

miR-9 hacia abajo-regulada la expresión de ciclina D1 y Ets1 a través del poste la represión -transcriptional

Para investigar la hipótesis de que el miR-9 puede influir en la expresión de ciclina D1 y Ets1 en el cáncer gástrico, la predicción computacional se realizó mediante las bases de datos de genes miARN. posibles sitios de unión de miR-9 con alta complementariedad se observaron en las bases 2974-2995 de la ciclina D1 3'-UTR y 2648-2670 de la Ets1 3'-UTR (Fig. 2A). Para investigar los efectos directos de miR-9 sobre la expresión de ciclina D1 y Ets1 en células de cáncer gástrico, hemos realizado los miARN sobre-expresión de los experimentos. La transfección estable de miR-9 precursor en SGC-7901 y las células AGS resultó en aumento de los niveles de miR-9 (Fig. S2). Western blot, RT-PCR en tiempo real y RT-PCR cuantitativa demostraron que la sobre expresión de miR-9 resultó en una disminución de proteínas y los niveles de transcripción de ciclina D1 y Ets1 en células de cáncer gástrico que las transfectadas con el vector de control negativo (simulado) ( la Fig. 2B, Fig. 2C y Fig. 2D). Además, los niveles de retinoblastoma fosforilada (PRB, un efector aguas abajo de la ciclina D1) [21] y metaloproteinasas de matriz 9 (MMP-9, un gen aguas abajo de Ets1) [22] se redujeron en el miR-9 células cancerosas que sobre-expresan (Fig. 2B, Fig. 2C y Fig. 2D). Para examinar más a fondo el papel de supresión de miR-9 en la expresión de ciclina D1 y Ets1, se realizó el MIR-9 desmontables experimentos de transfección de los inhibidores de control negativo (anti-NC) anti-miR-9 o en GES-1, SGC -7901 y AGS células. La transfección de anti-miR-9 inhibidor obviamente disminuyó la endógeno miR-9 expresión (Fig. S3A), y regulada positivamente los niveles de proteína de la ciclina D1, pRB, Ets1 y MMP-9 que las transfectadas con anti-NC (Fig. 2E y Fig. S4A). Los análisis en tiempo real de RT-PCR cuantitativa mostró los niveles de transcripción mejoradas de ciclina D1, Ets1 y MMP-9 en células cultivadas transfectadas con anti-miR-9 inhibidor, en comparación con las transfectadas con anti-NC (Fig. 2F y Fig. S4B). En general, estos resultados demuestran que el miR-9 inhibió considerablemente la expresión de ciclina D1 y Ets1 través de la represión post-transcripcional.

miR-9 ciclina D1 y estaban destinadas directamente Ets1 en células de cáncer gástrico

Para determinar si miR-9 podría reprimir la expresión de la ciclina D1 y Ets1 por la orientación de sus sitios de unión en la 3'-UTR, los productos de PCR que contienen sitios diana intactas o mutación de miR-9 secuencias de reconocimiento de semillas (Fig. 3A) se insertaron en el vector informador de luciferasa. Los plásmidos se transfectaron en células de cáncer gástrico transfectadas de forma estable con el vector de control negativo (mock) o miR-9 precursor. El Renilla luciferasa
actividades normalizadas a las de la luciérnaga se redujeron significativamente en las células SGC-7901 y AGS transfectadas de forma estable con el miR-9 precursora (Fig. 3B), y estos efectos fueron abolidos por mutación del putativa de miR-9 sitios dentro de la 3'-UTR de la ciclina D1 y Ets1 (Fig. 3B) de unión. Por otra parte, desmontables de miR-9 con anti-miR-9 inhibidor aumentó las actividades de luciferasa en GES-1, SGC-7901 y las células AGS (Fig. 3C y la Fig. S4C), mientras que la mutación de miR-9 sitio de reconocimiento abolieron estos efectos (Fig. 3C y la Fig. S4C). Estos resultados indicaron que el miR-9 directa y específicamente interactuado con los sitios diana en el extremo 3 'UTR de la ciclina D1 y Ets1.

miR-9 suprimieron el in vitro
la proliferación del cáncer gástrico células a través de la orientación de ciclina D1

Desde evidencia anterior mostró que miR-9 inhibe la expresión de ciclina D1, y la combinación de los hechos que la ciclina D1 desempeña un papel crítico en la progresión del ciclo celular y la proliferación de células del cáncer [21], que investigarse más a los efectos de miR-9 sobre-expresión y la restauración del gen diana en las células cultivadas de cáncer gástrico. Western blot y cuantitativa en tiempo real RT-PCR indicaron que la transfección de la ciclina D1, pero no de Ets1, rescató el miR-9 inducida por la baja regulación de la ciclina D1 (Fig. 4A y la Fig. 4B). Ensayo de formación de colonias, miR-9 sobre-expresión atenuó el crecimiento de SGC-7901 y las células AGS, en comparación con las transfectadas con vector de control negativo (simulado) (Fig. 4C). La citometría de flujo se indica que el miR-9 sobre-expresión inducida por la detención del ciclo celular en G _{0 /G 1 etapa en la SGC-7901 y las células AGS (Fig. 4D). Además, la transfección de la ciclina D1, pero no de Ets1, en SGC-7901 y las células AGS restauró la detención inhibición de la proliferación y el ciclo celular inducida por la sobre expresión de miR-9 (Fig. 4C y la Fig. 4D). Por otra parte, hemos examinado los efectos de miR-9 caída en GES-1, SGC-7901 y las células AGS. Introducción de anti-miR-9 inhibidor en estas células dio lugar a capacidades mejoradas en la proliferación (Fig. S3 B) y la progresión del ciclo celular (Fig. S3C). Estos resultados indicaron que el miR-9 notablemente suprimida la in vitro
proliferación y la progresión del ciclo celular de las células de cáncer gástrico a través del enfoque de ciclina D1.}

miR-9 atenuó el in vitro
migración y la invasión de células de cáncer gástrico a través de la orientación Ets1

Dado que estudios previos indican las importantes funciones de Ets1 en la invasión y metástasis de las células del cáncer [23], [24], que investigarse más a los efectos de miR 9 sobre-expresión y la restauración del gen diana en la migración y la invasión del cáncer gástrico SGC-7901 y las células AGS. Western blot y cuantitativa en tiempo real RT-PCR indicaron que la transfección de Ets1, pero no de la ciclina D1, rescató el miR-9 inducida por la baja regulación de Ets1 (Fig. 5A y Fig. 5B). En ensayo de migración transwell, células de cáncer gástrico transfectadas de forma estable con miR-9 precursor presentó una capacidad de migración alterada de las transfectadas con vector de control negativo (simulado) (Fig. 5C). En ensayo de invasión de matrigel, miR-9 sobreexpresión atenuó la invasividad de SGC-7901 y las células AGS (Fig. 5D). Además, la transfección de Ets1, pero no de la ciclina D1, en líneas celulares AGS SGC-7901 y restauraron la inhibición meditaed-miR-9 sobre la migración y la invasión (Fig. 5C y Fig. 5D). Además, se examinaron los efectos de miR-9 caída en GES-1, SGC-7901 y las células AGS. La transfección de anti-miR-9 inhibidor resultó en aumento de la migración y la invasión de estas células (Fig. S3D y la Fig. S3E). Estos resultados indicaron que el miR-9 notablemente atenuada del in vitro
la migración y la invasión de células de cáncer gástrico a través de la focalización Ets1.

miR-9 atenuó el crecimiento y la metástasis de las células de cáncer gástrico in vivo

a continuación se investigó la eficacia de miR-9 contra el crecimiento tumoral y la metástasis in vivo
. La transfección estable de miR-9 precursor en células SGC-7901 o AGS resultó en una disminución del crecimiento y el peso de los tumores de xenoinjerto subcutáneos en ratones desnudos atímicos, en comparación con las transfectadas de forma estable con control negativo vector (mock) (Fig. 6A y Fig. 6B ). Además, la expresión de la ciclina D1, Ets1 y aguas abajo MMP-9 se redujo mediante transfección estable de miR-9 precursor (Fig. 6C). La densidad de los vasos media CD31-positivas se redujo dentro de los tumores formados por la inyección de las células cancerosas transfectadas de forma estable con miR-9 precursor (Fig. 6D). En los estudios experimentales de metástasis, SGC-7901 o células AGS transfectadas establemente con el miR-9 precursoras establecidas colonias metastásicas pulmonares estadísticamente menos que el grupo de simulacro (Fig. 6E). Estos resultados sugieren que el miR-9 inhibe el crecimiento y la metástasis de las células de cáncer gástrico in vivo
.

Desmontables de ciclina D1 y Ets1 phenocopied miR-9 inhibición de la sobreexpresión mediada por la proliferación , la migración y la invasión de células de cáncer gástrico in vitro

Desde anteriores resultados indican la regulación negativa de la ciclina D1 y de expresión Ets1 por miR-9, la hipótesis de que la caída de la ciclina D1 y podría Ets1 ejercer efectos similares sobre células de cáncer gástrico cultivadas. Los pequeños RNAs de interferencia (siRNAs) dirigidos a la región de codificación de la ciclina D1 y Ets1, si-si-CCND1 y Ets1, se diseñaron y se transfectaron en SGC-7901 y las células AGS. La transfección de si-CCND1 y si-Ets1 resultó en disminución de la expresión de la ciclina D1, PRB, Ets1 y MMP-9 en células de cáncer gástrico, respectivamente, en comparación con las transfectadas con scramble siRNA (si-Scb) (Fig. 7A, Fig . 7D y la Fig. S5). Desmontables de ciclina D1 suprime la proliferación y la detención del ciclo celular inducida en G _{0 /G 1 etapa en la SGC-7901 y las células AGS (Fig. 7B y la Fig. 7C). Además, desmontables de Ets1 en las células SGC-7901 y AGS generado una disminución en las capacidades de migración y la invasión (Fig. 7E y la Fig. 7F). Estos resultados sugieren que la caída de la ciclina D1 y Ets1 phenocopied (poseía los fenotipos similares a) miR-9 sobre-expresión en la inhibición de la proliferación, la migración y la invasión de células de cáncer gástrico in vitro
.}

Discusión

ha sido bien establecido que el perfil de expresión de miR-9 en el cáncer se basa en la distribución en los tejidos. En los tumores cerebrales primarios, miR-9 es elevado y funciona como un factor esencial en la carcinogénesis neuronal [10]. miR-9 es también sobre expresa en cáncer de cuello uterino [11], lo que sugiere su papel promotor de tumores en el desarrollo y progresión del tumor. Sin embargo, miR-9 es el regulado en múltiples cánceres humanos, incluyendo el cáncer de páncreas [12], cáncer de ovario [13] y el cáncer de colon [14], y se asocia con la progresión maligna de cáncer de mama [25] y el cáncer colorrectal ( 14). Luo et al.
Observado la baja regulación de miR-9 en 24 muestras de cáncer gástrico [15], lo cual fue confirmado posteriormente en 9 [16], 72 [17] y 13 [18] cáncer gástrico casos. Sin embargo, Inoue et al.
Informó la regulación al alza de miR-9 en 5 pacientes con cáncer gástrico por matrices basadas en la PCR en tiempo real miARN [26], y este hallazgo diferente en el miR-9 perfil de expresión puede deberse a la heterogeneidad de las muestras limitados. En este estudio, hemos demostrado que el miR-9 es significativamente baja regulado en 86 muestras de cáncer gástrico primario que en los tejidos adyacentes no neoplásicas, lo cual es coherente con los resultados anteriores [15] - [18]. Es importante destacar que también confirman que el miR-9 expresión se asocia inversamente con los estadios clínicos, la invasión y la metástasis del cáncer gástrico. En los seres humanos, los maduros miR-9 está codificado por tres genes independientes, miR-9-1, 9-2 y MIR-MIR-9-3, la localización en los cromosomas 1, 5 y 15, respectivamente [27]. Estudios previos indican que la expresión de miR-9 las reguladas en el cáncer gástrico es debido a la hipermetilación aberrante de la región promotora de miR-9 genes de codificación [17]. Del mismo modo, también se informa de la hipermetilación aberrante de genes miR-9 de la familia en algunos tumores primarios con metástasis en los ganglios linfáticos, como el cáncer de colon, cáncer de pulmón, cáncer de mama y melanoma [14], [28]. Es importante destacar que el presente estudio informó la correlación inversa entre los niveles de miR-9 y la expresión de ciclina D1 y Ets1 en tejidos de cáncer gástrico, lo que implica que la ciclina D1 y Ets1 pueden ser regulados negativamente por el miR-9.

La función y los genes diana de miR-9 son tumor específico y depende del contexto celular. miR-9 es capaz de suprimir la expresión de E-cadherina en el cáncer de mama [29], lo que resulta en la translocación nuclear de β-catenina y su unión con los factores de transcripción factor de células T /factor de potenciador linfoide 1, y la posterior transcripción-up regulada de genes que facilitan la proliferación celular y la angiogénesis [29]. Forzado expresión miR-9 en líneas celulares de cáncer de mama también se traduce en cambios de expresión significativos de múltiples genes en la vía de apoptosis relacionada con p53 [30]. A través de un objetivo directo de NF-kB, la expresión ectópica de miR-9 inhibe la in vitro
y in vivo
crecimiento de las células de cáncer de ovario [31] y el crecimiento y metástasis del melanoma [32] . En neuroblatoma, la sobre expresión de miR-9 inhibe la invasión, metástasis y angiogénesis de las células tumorales a través de la orientación de la metaloproteinasa de matriz 14 [33]. Wan et al.
Informó que la sobre expresión de miR-9 inhibe la
e in vitro crecimiento in vivo Red de línea celular de adenocarcinoma gástrico MGC803 través de la represión de NF-kB a nivel post-transcripcional [16]. Sin embargo, en un estudio reciente, Rotkrua et al.
Indicó que el miR-9 podría estar implicado en la carcinogénesis gástrica a través CDX2 abajo de la regulación, y la caída de miR-9 se ha reducido el in vitro
la proliferación del cáncer gástrico MKN-45 células [19], mientras que sus hallazgos deben reforzarse aún más con sobre-expresión, rescate del gen diana, y in vivo
estudios de miR-9. Además, actualmente es controvertido si CDX2 juega un papel supresor oncogénico o tumor en la carcinogénesis gástrica [34], [35]. Por otra parte, la posible función de miR-9 en la invasión y la metástasis del cáncer gástrico no han sido aclaradas hasta ahora. Por lo tanto, los objetivos de función y directos de miR-9 en el cáncer gástrico orden de mayor investigación.

En este estudio, hemos demostrado que la sobre expresión de miR-9 atenúa la proliferación, la migración y la invasión de células de cáncer gástrico, que era similar a la de ciclina D1 o knockdown Ets1, lo que sugiere la posible aplicación de miR-9 como un objetivo para la terapéutica de cáncer gástrico. Además, nuestros datos confirman que el miR-9 dirigida directamente ciclina D1 y Ets1 en células de cáncer gástrico a través del ensayo indicador de luciferasa 3'-UTR. Dado que la evidencia reciente muestra que algunos miRNAs pueden modular, alternativamente, la expresión génica mediante la interacción con los promotores [36] - [38], la posible función de miR-9 en la regulación de la transcripción de ciclina D1 y Ets1 través de la interacción con los promotores siguen sin estar claros y garantiza nuestra futura investigación. Ciclina D1 es un proto-oncogén que pertenece a la familia de G _{1 ciclinas, y juega un papel importante en el ciclo celular G 1 a S transición mediante la unión de sus socios quinasa dependiente de ciclina 4 y 6 de fosforilar e inactivar la proteína RB [21]. La sobreexpresión de ciclina D1 es un evento temprano en la carcinogénesis colorrectal, de esófago y de la vesícula cánceres humanos [39], y es un indicador pronóstico asociado con una mala supervivencia en esófago, mama y cánceres urinarios [39]. Ciclina D1 sobreexpresión en los cánceres humanos se explica por múltiples mecanismos, incluyendo alteraciones genómicas, post-transcripcional regulación y estabilización de la proteína después de la traducción [39]. La evidencia reciente muestra que el miR-16-1 reprime la expresión de ciclina D1 en el nivel post-transcripcional a través de su unión a UTR en 3 'en el linfoma de células del manto [40]. En el estudio actual, nuestros resultados mostraron que la inhibición de la progresión y la proliferación celular del ciclo celular miR-9-mediada fue rescatado por la restauración de la expresión de ciclina D1 en células de cáncer gástrico, lo que sugiere que la identificación de la ciclina D1 como un gen diana miR-9, puede explicar, al menos en parte, la razón por la sobre expresión de miR-9 suprimido la proliferación de células de cáncer gástrico.}

Ets1, un miembro de la familia ETS de factores de transcripción, se une a secuencias específicas de ADN que contienen un GGAA /T núcleo motivo [22], y participa en la invasión tumoral y la metástasis a través de la regulación transcripcional de varios genes responsables de la remodelación de la matriz extracelular, la migración y la invasión, tales como metaloproteinasas de la matriz y la uroquinasa activador del plasminógeno [22]. Hasta la fecha, un número creciente de estudios clínicos han demostrado el importante papel de Ets1 en el desarrollo tumoral y la progresión de diversos tumores sólidos [23], [24]. Estudios anteriores indican que la expresión Ets1 está relacionada con las características clinicopatológicas de cáncer gástrico, incluyendo infiltración de tumor y los ganglios linfáticos o metástasis distal, lo que sugiere su papel crítico en la invasión y metástasis de cáncer gástrico [41]. Sin embargo, los mecanismos subyacentes a la Ets1 sobre-expresión en el cáncer gástrico sigue siendo en gran medida desconocido. Estudios recientes revelan la regulación post-transcripcional de Ets1 por miR-125b, en células de cáncer de mama [42], y por el miR-200b en las células endoteliales [43]. En este estudio, hemos demostrado que a medida que un objetivo directo de miR-9, Ets1 fue hasta reguladas en el cáncer gástrico y contribuyó a la migración y la invasión de las células cancerosas. Desmontables de Ets1 phenocopied parcialmente los efectos de miR-9 sobre-expresión en líneas celulares de cáncer gástrico, mientras que la restauración de la expresión Ets1 rescató las células cancerosas de la inhibición mediada por el miR-9 sobre la migración y la invasión, dejando al descubierto un nuevo mecanismo de regulación post-transcripcional de Ets1 por miR-9 y su potencial clínico en el cáncer gástrico.

en resumen, hemos demostrado, por primera vez, que el miR-9 reprime la expresión de ciclina D1 y Ets1 través de la orientación directa sus extremos 3 ' -UTR, inhibiendo así la proliferación, invasión y metástasis de células de cáncer gástrico. Este estudio amplía nuestro conocimiento acerca de la regulación de la ciclina D1 y Ets1 a nivel post-transcripcional de los genes miARN, y sugiere que el miR-9 puede ser de valores de potencial como nueva diana terapéutica para el cáncer gástrico.

Materiales y métodos

muestras de tejido de pacientes
aprobación

para llevar a cabo este estudio se obtuvo de la Junta de Revisión Institucional de Tongji Medical College (número de registro: 2010-S003). Embebido en parafina y muestras frescas de 86 casos de cáncer gástrico primarios se obtuvieron del Departamento de Cirugía, Hospital Unión de Tongji Medical College. Su diagnóstico patológico se demostró por al menos dos patólogos. Los datos demográficos y clínico-patológicos de todos los pacientes se resumen en la Tabla S1. También se obtuvo mucosa gástrica adyacentes que no contenía tumor macroscópico, y las áreas no neoplásicas fueron verificados posteriormente por histología microscópica. Los especímenes tumorales frescas y mucosa no neoplásico adyacente se recogieron y se almacenaron a -80 ° C hasta su uso.

Inmunohistoquímica

La tinción inmunohistoquímica se realizó como se describe anteriormente [44], con anticuerpos específicos para ciclina D1, Ets1, MMP-9 y CD31 (Abcam Inc, Cambridge, MA, 1: 200 diluciones). Los controles negativos incluyeron secciones paralelas tratados con omisión del anticuerpo primario, además de una sección adyacente del mismo bloque en el que el anticuerpo primario fue sustituido por policlonal de conejo IgG (Abcam Inc) como un control de isotipo. El grado de reactividad se evaluó mediante al menos dos patólogos sin el conocimiento de las características clinicopatológicas de tumores. El grado de positividad fue clasificada inicialmente de acuerdo con el porcentaje de las células cancerosas positivas como las siguientes: (-) < 5% de células positivas, (1+) 6-25% de células, (2 +) células positivas 26-50% positivo y (3 +) > 50% de células positivas. Diapositivas con (3+) reactividad positiva moderada (2+) o fuertemente positivo se clasificaron como de "alta expresión", mientras que se desliza con negativo (-) o positiva débil (1+) reactividad fueron clasificados como de "baja expresión" .

Western blot

proteína celular se extrajo con 1 x tampón de lisis celular (Promega, Madison, WI). La proteína (50 mg) de cada muestra se sometió a gel de poliacrilamida pre-cast 4-20% (Bio-Rad, Hercules, CA) de electroforesis y se transfirió a membranas de nitrocelulosa (Bio-Rad). Para ciclina D1, Ets1, MMP-9, PRB y β-actina (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) de detección, las diluciones de anticuerpos primarios fueron 1:500, 1:500, 1:500, 1:500 y 1: 1,000, respectivamente, seguido de 1:3000 dilución de cabra anti-conejo anticuerpo marcado con peroxidasa de rábano picante (Bio-Rad). Se utilizó el kit de sustrato de quimioluminiscencia (Amersham, Piscataway, NJ) para la detección de señales chemiluminscent con autorradiografía película (Amersham).

RT-PCR y cuantitativa en tiempo real RT-PCR

Total ARN se aisló con RNeasy Mini Kit (Qiagen Inc., Valencia, CA). Las reacciones de transcripción inversa se realizaron con Transcriptor Primera Strand cDNA Synthesis Kit (Roche, Indianapolis, IN). Los cebadores de PCR para la ciclina D1, Ets1, MMP-9 y β-actina fueron diseñados por el software Primer Premier 5.0 (Tabla S2). RT-PCR se realizó como se describe anteriormente [44]. Cuantitativa en tiempo real RT-PCR con SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems, Foster City, CA) se realizó mediante ABI Prism 7700 Sequence Detector (Applied Biosystems). Las señales fluorescentes se recogieron durante la fase de extensión, se calcularon los valores de Ct de las muestras, y los niveles de transcripción de ciclina D1, Ets1 y MMP-9 se normalizaron a los de β-actina por 2 método ^-ΔΔCt.

La cuantificación de la expresión de miR-9

Los niveles de madurez de miR-9 en tejidos y líneas de células primarias se determinaron utilizando Bulge-Loop ™ miRNAs qPCR Primer Set (RiboBio Co. Ltd, Guangzhou, china). Después de ADNc se sintetizó con un cebador tallo-bucle-miARN específico, la PCR cuantitativa se realizó con los cebadores específicos (Tabla S2). Los niveles de miR-9 se normalizaron a los de U6 snRNA.

miARN objetivo de predicción

miARN objetivos se prevé utilizar los algoritmos de Miranda, miRDB, RNA22, y TargetScan [45]. Para identificar los genes comúnmente predichos por cuatro algoritmos diferentes, los resultados de los objetivos previsto se cruza usando miRWalk [46].

Cultivo de células y transfección

líneas celulares de cáncer gástrico humano (SGC-7901 y MKN-74) y SV40-transformado, se obtuvieron epiteliales gástricas normales y no tumorigénicas GES-1 en las células [20] de la Colección de Cultivos Tipo de la Academia china de Ciencias (Shanghai, china). línea celular de cáncer gástrico humano AGS (CRL-1739) se adquirió forma la American Type Culture Collection (Rockville, MD). Las células fueron cultivadas en medio RPMI 1640 (Life Technologies, Inc., Gaithersburg, MD) suplementado con suero bovino fetal 10% (Life Technologies, Inc.), penicilina (100 U /ml) y estreptomicina (100 mg /ml). Las células se mantuvieron a 37 ° C en una atmósfera humidificada de 5% de CO _2.

• PLOS ONE: Asociación entre la reducción de los niveles plasmáticos de adiponectina y el riesgo de infección bacteriana después de la cirugía del cáncer gástrico
• PLOS ONE: Expresión de AFP y STAT3 está involucrado en inducida por el trióxido de arsénico La apoptosis y la inhibición de la proliferación en AFP productora de cáncer gástrico Cells