PLoS One: a mikro-RNS-9 meggátolja a proliferáció, invázió és metasztázis gyomorrák sejtek révén célzás ciklin D1 és Ets1

absztrakt katalógusa

A legújabb bizonyítékok azt mutatják, hogy megváltozott a mikro-RNS-9 (miR-9) kifejezés közrejátszik progresszióját gyomorrák. Azonban a pontos szerepét és hátterében álló mechanizmusok miR-9 a proliferáció, invázió és metasztázis a gyomorrák még mindig ismeretlen. Ebben a vizsgálatban, a miR-9 Azt találtuk, hogy alulszabályozott és fordítottan arányos a kifejezés a ciklin D1 és a V-ETS eritroblasztózis vírus E26 onkogén homológ 1 (ETS1) a gyomorrák szövetekben és sejtvonalakban. Bioinformatikai analízis eredményei a feltételezett miR-9 kötőhelyek 3'-nem transzlatált régiók (3'-UTR) a ciklin D1 és a ETS1 mRNS-t. Méhen kívüli expressziója vagy kiütése miR-9 eredményezett válaszul megváltozott expressziója ciklin D1, ETS1 és downstream célpontok foszforilált retinoblasztóma és mátrix metalloproteináz 9 tenyésztett gyomorrák sejtvonalakon SGC-7901 és AGS. A luciferáz riporter rendszer, miR-9 célozza közvetlenül 3'-UTR a ciklin D1 és a ETS1, és ezeket a hatásokat eltörölte mutálásával miR-9 kötőhelyek. Túlzott expressziója miR-9 elnyomta a proliferáció, invázió, és áttéte SGC-7901 és AGS sejtek in vitro katalógusa és in vivo katalógusa. Restaurálása miR-9-közvetített leszabályozza ciklin D1 és ETS1 által tranziens, megmentette a rákos sejtek csökkent szaporodása, migrációja és invázió. Továbbá, az anti-miR-9 inhibitor elősegítette a proliferáció, migráció és invázió gyomorrák sejtek, míg bontani a ciklin D1 vagy ETS1 részben phenocopied hatásait miR-9 túlzott kifejeződése. Ezek az adatok azt jelzik, hogy a miR-9 elnyomja a kifejezés a ciklin D1 és ETS1 keresztül a kötőhelyek saját 3'-UTR, így gátolja a proliferációt, invázió és metasztázis gyomorrák.

bevezető hivatkozás: Zheng L, Qi T, Yang D, Qi M, Li D, Xiang X, et al. (2013) a mikro-RNS-9 meggátolja a proliferáció, invázió és metasztázis gyomorrák sejtek révén célzás ciklin D1 és ETS1. PLoS ONE 8 (1): e55719. doi: 10,1371 /journal.pone.0055719 katalógusa

Szerkesztő: Alejandro H. Corvalan, Pontificia Katolikus Egyetem Chile, Chile katalógusa

Beérkezett: szeptember 14, 2012; Elfogadva: december 29, 2012; Megjelent: január 31, 2013 katalógusa

Copyright: © 2013 Zheng és mtsai. Ez egy nyílt hozzáférésű cikk feltételei szerint terjeszthető a Creative Commons Nevezd meg! Licenc, amely engedélyezi a korlátlan használatát, a forgalmazás és a reprodukció bármilyen adathordozón, feltéve, hogy az eredeti szerző és a forrás jóváírásra. Katalógusa

Forrás: Támogató a Nemzeti Természettudományi Alapítvány Kína (No. 30600278, 30772359 számú, No. 81071997, 81072073 számú, No. 81272779), Program New Century Kiváló Tehetségek University (NCET-06-0641), Tudományos Kutatási Alapítvány visszatért tengerentúli kínai tudósok (2008-889), és alapvető kutatási alapok a közép-egyetemek (2012QN224). A finanszírozók nem volt szerepe a tanulmány tervezés, adatgyűjtés és elemzés, döntés, hogy közzéteszi, vagy a készítmény a kézirat. Katalógusa

Érdekütközés: A szerzők kijelentették, hogy nem ellentétes érdekek léteznek. Katalógusa

Bevezető

a gyomorrák a negyedik leggyakoribb daganat a világon. [1] Annak ellenére, hogy a javulás sebészeti és multimodális terápia prognózisát előrehaladott gyomorrákban továbbra is gyenge, mivel a kiújulás, invázió és metasztázis, egy 5 éves túlélési aránya 30% alatt van [1]. A jobb megismerését szolgáló mechanizmusok tumor progresszióját indokolt, hogy felfedezzék az új paradigmák a diagnózis és a kezelés a gyomorrák. [2] A mikroRNS (miRNS-ek), egy közelmúltban azonosított kategória kis és erősen konzervált nem kódoló RNS-ek, részt vehet a poszt-transzkripciós génexpresszió szabályozásában való részleges komplementer kötési a 3 'nem transzlálódó régiók (3'-UTRs) a cél-mRNS, ami a transzlációs elnyomás vagy mRNS degradáció [3]. Emerging bizonyítékok azt mutatják, hogy a miRNS-ek részt vesznek a biológiai folyamatok kapcsolódó apoptózist, proliferáció, differenciálódás, invázió és metasztázis, míg deregulációja, ami elengedhetetlen a rák kialakulásában és progressziójában [3]. Ez jelenleg sürgős, hogy vizsgálja meg a szerepét miRNS-ek és azok célgének tumor progressziójának kísérleti modellekben.

humán gyomorrák, számos miRNS számoltak hogy abnormálisan túlexpresszált vagy alulszabályozott közben progressziójának gyomorrák, beleértve a miR-21 [4], a miR-15b [5], a miR-16 [5], és a miR-101 [6]. Ezek a miRNS játszanak onkogén vagy tumor-szuppresszív szerepet a sejtnövekedés szabályozásában, a migráció és invázió represszáló a cél gének. Például onkogén miR-21 abnormálisan túlzott kifejezve gyomorrák, és növeli a proliferációt és invazivitását gyomorrák sejtek megcélzásával reverziós-indukáló cisztein-gazdag proteint Kazal motívumok [4]. Eközben a miR-15b és miR-16 vagy lefelé szabályozni a gyomorrák, és hozzájárul a több szerrel szembeni rezisztencia gyomorrák sejtek modulációs apoptózis útján célzó B-sejtes leukémia /limfóma 2 [5]. miR-101 alulszabályozott a gyomorrák szövetekben és sejtvonalakban, míg ektópiás expressziója miR-101 jelentősen gátolja a proliferációt, migrációt és invázió gyomorrák sejtek megcélzásával fokozóját Zeste homológ 2, citokróm c-oxidáz alegység II, és a mieloid sejt leukémia szekvencia 1 [6]. Ezért volt a hangsúly, hogy tovább vizsgálja az expressziós és funkcionális miRNS a daganat biológiai gyomorrák. Katalógusa

mikroRNS-9 (miR-9) először azonosították az egyik leglényegesebb szabályozók fejlesztése , fiziológia és patológia idegrendszer számos szervezetek, köztük a Drosophila katalógusa, zebrahal, és emlősök [7] - [9]. Egy sor későbbi vizsgálatok kimutatták, hogy a megváltozott miR-9 expresszió kifejlődésével társul, és progresszióját rákok [10] - [14]. Korábbi tanulmányok azt mutatják, hogy a miR-9 jelentősen alulszabályozott a gyomorrák, ami annak potenciális szerepét a tumor progresszióját [15] - [18]. Azt is jelezte, hogy a miR-9 képes modulálni az elterjedése a gyomor rákos sejtek keresztül célozza a caudalis típusú homeobox 2 (CDX2) [19] és az NF-kappa B (NF-kB) [16]. Azonban a pontos funkciója és mögöttes mechanizmusait miR-9 progressziójában gyomorrák még további vizsgálatokat igényel. Ebben a tanulmányban bemutatjuk, az első alkalommal, hogy a miR-9 közvetlenül célozza ciklin D1 és a V-ETS eritroblasztózis vírus E26 onkogén homológ 1 (ETS1), és elnyomja a proliferáció, invázió és metasztázis gyomorrák sejtek vitro katalógusa és in vivo katalógusa.

Eredmények katalógusa

miR-9 leszabályozott, és fordítottan arányos a kifejezés a ciklin D1 és ETS1 gyomorrákban szövetek és sejtvonalak

Annak vizsgálatára, a miR-9 expresszió gyomorrák, gyomorrák szövetek és a szomszédos, nem daganatos nyálkahártya gyűjtöttünk 86 primer esetben. Valós idejű kvantitatív reverz transzkripciós PCR (RT-PCR) feltárta, hogy a miR-9 alulszabályozott a gyomorrák szövetekben, mint a szomszédos, nem daganatos nyálkahártya ( p
= 0,001, 1A.). A miR-9 expresszió szignifikánsan alacsonyabb volt a gyomorrák esetek mélyebb gyomorfal invázió ( P katalógusa < 0,001), nyirokcsomó áttét ( P katalógusa < 0,001), távoli áttét ( P katalógusa = 0,022), és a fejlett TNM ( P katalógusa = 0,01) (táblázat S1). Ezzel szemben a magasabb ciklin D1 és ETS1 transzkripciós szinteket találtak a gyomorrák szövetekben ( P katalógusa < 0,0001 és P katalógusa < 0,0001, Fig. 1B és ábra. 1C). Volt egy inverz korrelációt miR-9 expresszió és a ciklin D1 transzkripciós szint gyomorrákban szövetekben ( P katalógusa < 0,001, Fig. 1D). Emellett fordított korrelációt miR-9 expresszió és ETS1 transzkripciós szinteket is megjegyezte ezekben a rákos szövetekben ( P katalógusa < 0,001, Fig. 1E). Alsó miR-9 expresszió és magasabb transzkripciós szinteket a ciklin D1 és ETS1 észleltek gyomor rákos sejtvonalak, mint normál gyomornyálkahártya GES-1 sejtekben [20] (ábra. 1F). Immunhisztokémiai festéssel végeztük megfigyelni a kifejezés a ciklin D1 és ETS1 ezekben rák példányok (ábra. S1). Nukleáris ciklin D1 volt megfigyelhető 26/86 (30,2%) esetben, míg a nukleáris és a citoplazmában festése ETS1 volt megfigyelhető 58/86 (67,4%) esetben (táblázat S1). Immunreaktivitására ciklin D1 és ETS1 szignifikánsan magasabb volt a gyomorrák esetek mélyebb gyomorfal invázió ( P katalógusa < 0,001 és P katalógusa = 0,001), nyirokcsomó áttét ( P
< 0,001 és P katalógusa < 0,001), a távoli áttétek ( P katalógusa < 0,001 és P katalógusa < 0,001), és a fejlett TNM ( P katalógusa < 0,001 és P katalógusa = 0,004) (táblázat S1). Alsó miR-9 expresszió volt megfigyelhető a gyomorrák szövetekben magasabb immunfestésével ciklin D1 ( P katalógusa < 0,0001, Fig. 1 g) vagy ETS1 ( P katalógusa < 0,0001, Fig. 1H ). Ezek az eredmények azt mutatták, hogy a miR-9 alulszabályozott és fordítottan arányos expressziója ciklin D1 és ETS1 gyomorrákban szövetekben és sejtvonalakban.

miR-9 alulszabályozott expresszióját ciklin D1 és ETS1 keresztül utáni -transcriptional elnyomás katalógusa

Annak vizsgálatára, a hipotézist, hogy a miR-9 befolyásolhatja a kifejezés a ciklin D1 és ETS1 gyomorrákban, számítógépes becslés végeztük miRNS adatbázisok. Potenciális kötőhelyek miR-9 nagy komplementaritás derült alapjait 2974-2995 a ciklin D1 3'-UTR és 2648-2670 a ETS1 3'-UTR (2A.). Annak vizsgálatára, a közvetlen hatásait miR-9 a kifejezés ciklin D1 és ETS1 gyomorrákban sejtekben végeztünk miRNS túlzott kifejeződése kísérletek. Stabil transzfektálás miR-9 prekurzor SGC-7901 és AGS sejtek növekedését eredményezte a miR-9 szint (ábra. S2). Western-blot, RT-PCR és a valós idejű kvantitatív RT-PCR-rel kimutattuk, hogy túlzott expressziója miR-9 csökkenését eredményezte protein és transzkripciós szintje ciklin D1 és ETS1 a gyomor rákos sejtekben, mint azok, transzfektált negatív kontroll vektorral (mock) ( ábra. A 2B, ábra. 2C, és ábra. 2D). Ezen túlmenően, a szintek a foszforilált retinoblasztóma (pRb, egy downstream effektor ciklin D1) [21] és a mátrix metalloproteináz 9 (MMP-9, egy downstream génje ETS1) [22] arra csökkent miR-9 over-expresszáló rákos sejtek (ábra. 2B ábra. 2C, és ábra. 2D). Ahhoz, hogy tovább vizsgálja az elnyomó szerepe miR-9 a kifejezés a ciklin D1 és ETS1 végeztünk a miR-9 knockdown kísérletek transzfekciójával anti-miR-9, vagy negatív (anti-NC) inhibitorok a GES-1, SGC -7901 és AGS sejteket. Transzfekció anti-miR-9 inhibitor nyilvánvalóan csökkent, az endogén miR-9 expresszióját (ábra. S3A), és serkentett a fehérje szint a ciklin D1, pRB, ETS1 és MMP-9, mint azok, transzfektált anti-NC (ábra. 2E és ábra. S4A). Valós idejű kvantitatív RT-PCR-analízis szerint a fokozott transzkripciós szinteket a ciklin D1, ETS1 és MMP-9 tenyésztett sejtekben transzfektált anti-miR-9 inhibitor, ha összehasonlítjuk az említett transzfektált anti-NC (ábra. 2F és ábra. S4B). Összességében ezek az eredmények igazolták, hogy a miR-9 jelentősen gátolta a kifejezés a ciklin D1 és ETS1 keresztül poszt-transzkripciós elnyomás. Katalógusa

miR-9 közvetlenül megcélzó ciklin D1 és ETS1 gyomorrákban sejtek katalógusa

meghatározására, hogy a miR-9 is elnyomják a kifejezés a ciklin D1 és ETS1 célzásával a kötőhelyek 3'-UTR, a PCR-termékeket tartalmazó intakt célhelyek vagy mutációja a miR-9 mag felismerő szekvenciákat (ábra. 3A) inszertáltunk a luciferáz riporter vektor. A plazmidokat transzfektáltunk gyomorrák stabilan transzfektált sejteket negatív kontroll vektorral (vak) vagy miR-9 prekurzor. A Renilla katalógusa luciferázaktivitás normalizált azoknak a szentjánosbogár szignifikánsan csökkent az SGC-7901 és AGS stabilan transzfektált sejteket miR-9 prekurzor (ábra. 3B), és ezeket a hatásokat eltörölte mutációjával feltételezett miR-9 kötőhelyek a 3'-UTR ciklin D1 és ETS1 (ábra. 3B). Sőt, kiütése miR-9 anti-miR-9 inhibitor növelte a luciferáz tevékenységek GES-1, SGC-7901 és AGS sejtek (3C. És ábra. S4C), míg a mutáció a miR-9 felismerési hely eltörölte ezeket a hatásokat (3C. és ábra. S4C). Ezek az eredmények azt mutatták, hogy a miR-9 közvetlenül és konkrétan kölcsönhatásba lépett a célzott helyek a 3'-UTR ciklin D1 és ETS1. Katalógusa

miR-9 elnyomta a in vitro katalógusa elterjedése gyomorrák sejtekhez célba ciklin D1 katalógusa

Mivel a fenti bizonyítékok azt mutatják, hogy a miR-9 gátolta a ciklin D1 expresszió, és összekapcsolja a tényeket, hogy a ciklin D1 játszik kritikus szerepet a sejtciklus progresszióját és elterjedése a rákos sejtek [21], ben tovább vizsgáltuk az miR-9 túlzott kifejeződése és a megcélzott gén helyreállítása tenyésztett gyomor rákos sejteket. Western blot és a valós idejű kvantitatív RT-PCR jelezte, hogy a transzfekció a ciklin D1, de nem ETS1 mentettek a miR-9-indukált down-regulációja a ciklin D1 (4A. És ábra. 4B). A telepképző assay, miR-9 túlzott expresszió legyengített növekedését SGC-7901 és AGS-sejtek, ha összehasonlítjuk az említett transzfektált negatív kontroll vektorral (mock) (ábra. 4C). Áramlási citometria mutatta, hogy a miR-9 túlzott kifejeződése indukált sejtciklusmegállás a G _{0 /G 1 fázis SGC-7901 és AGS sejtek (ábra. 4D). Ezen túlmenően, a transzfekció a ciklin D1, de nem ETS1, figyelembe SGC-7901 és AGS sejtek visszaállította a proliferáció gátlása, és sejtciklus által indukált túlzott expressziójának miR-9 (ábra. A 4C. 4d). Másrészt, megvizsgáltuk a hatását miR-9 knockdown on GES-1, SGC-7901 és AGS sejteket. Bevezetés az anti-miR-9 inhibitor ezekbe a sejtekbe fokozta képességeit proliferáció (ábra. S3B) és a sejtciklus előrehaladását (ábra. S3C). Ezek az eredmények azt mutatták, hogy a miR-9 méltóan elnyomta a in vitro katalógusa proliferáció és a sejtciklus progresszióját gyomorrák sejtek révén célzó ciklin D1. Katalógusa}

miR-9 csökkentette a in vitro
migrációs és behatolás gyomorrák sejtek révén célzó ETS1 katalógusa

Mivel a korábbi vizsgálatok azt mutatják, fontos szerepe ETS1 az invázió és metasztázis a rákos sejtek [23], [24], akkor a további hatásait vizsgáltuk az miR 9 túlzott kifejeződése és a megcélzott gén helyreállítása a migrációs és behatolás gyomorrák SGC-7901 és AGS sejteket. Western blot és a valós idejű kvantitatív RT-PCR jelezte, hogy transzfekciója ETS1, de nem a ciklin D1, megmentette a miR-9-indukált leszabályozza ETS1 (ábra. 5A ábra. 5B). A transwell migrációs assay, gyomorrák sejtek stabilan transzfektált miR-9 prekurzor bemutatott károsodott migrációs kapacitás, mint azok, transzfektált negatív kontroll vektorral (mock) (ábra. 5C). Matrigelben inváziós vizsgálat, miR-9 túlzott kifejeződése csökkentette a invazivitásának SGC-7901 és AGS sejtek (ábra. 5D). Emellett transzfekciója ETS1, de nem a ciklin D1, a SGC-7901 és AGS sejtvonalak visszaállította a miR-9-meditaed gátlás migrációs és behatolás (ábra. 5C és ábra. 5D). Továbbá megvizsgáltuk a hatásait miR-9 knockdown on GES-1, SGC-7901 és AGS sejteket. Transzfekció anti-miR-9 inhibitor fokozta migrációs és behatolás ezen sejtek (ábra. S3D és ábra. S3E). Ezek az eredmények azt mutatták, hogy a miR-9 feltűnően csökkentette a in vitro katalógusa migrációs és behatolás gyomorrák sejtek révén célzás ETS1. Katalógusa

miR-9 csökkentette a növekedés és áttét a gyomorrák sejtek in vivo Matton

a következőkben hatékonyságát vizsgálta miR-9 ellen tumor növekedés és anyagcsere in vivo katalógusa. A stabil transzfekció a miR-9 prekurzor SGC-7901 vagy AGS sejteket eredményezett csökkent növekedés és súlya szubkután xenograft tumorok thymushiányos csupasz egerekben, ha összehasonlítjuk azokat stabilan transzfektált negatív kontroll vektorral (mock) (6A. És 6B. ). Ezen kívül, a kifejezés a ciklin D1, ETS1 és downstream MMP-9-ben csökkentették stabil transzfekció a miR-9 prekurzor (ábra. 6C). A CD31-pozitív átlagos hajó sűrűség csökkenthető belül tumorok által alkotott injekció rákos sejtek stabilan transzfektált miR-9 prekurzor (ábra. 6D). A kísérleti metasztázis tanulmányok, SGC-7901 vagy AGS stabilan transzfektált sejteket miR-9 prekurzor létrehozott statisztikailag kevesebb tüdő metasztázisos kolóniák mint mock-csoport (ábra. 6E). Ezek az eredmények arra utalnak, hogy a miR-9 gátolta a növekedést és a metasztázis gyomorrák sejtek in vivo katalógusa.

kiütése a ciklin D1 és ETS1 phenocopied miR-9 túlzott kifejeződése által közvetített gátlását a proliferáció migráció és invázió gyomorrák sejtek in vitro Matton

Mivel a fenti eredmények azt mutatják, negatív szabályozásában ciklin D1 és ETS1 expresszió miR-9, feltételeztük, hogy akciós a ciklin D1 és ETS1 esetleg fejtenek ki hasonló hatást tenyésztett gyomor rákos sejteket. A kis interferáló RNS-ek (siRNS) megcélzó kódoló régiójának ciklin D1 és ETS1, si-CCND1 és si-ETS1 arra irányultak, és transzfektáltuk SGC-7901 és AGS sejteket. Transzfekció Si-CCND1 és Si-ETS1 eredményezte csökkent expressziója a ciklin D1, pRB, ETS1 és MMP-9 gyomorrák-sejtek, illetve, ha összehasonlítjuk az említett transzfektált Scramble siRNS (si-Scb) (ábra. 7A, ábra . 7D és ábra. S5). Kiütése ciklin D1 elnyomta a proliferáció és az indukált sejtciklusmegállás a G _{0 /G 1 fázis SGC-7901 és AGS sejtek (ábra. 7B és ábra. 7C). Emellett kiütése ETS1 az SGC-7901 és AGS sejtek hatására csökken a képességeit migrációs és behatolás (ábra. 7E és ábra. 7F). Ezek az eredmények azt javasolta, hogy kiütése a ciklin D1 és ETS1 phenocopied (rendelkezett a hasonló fenotípusokat a) miR-9 túlzott expresszió gátlásában a proliferáció, migráció és invázió gyomorrák sejtek in vitro
.}

Vita katalógusa

Azt is megállapították, hogy a miR-9 expressziós profil rákos támaszkodik szöveti eloszlása. Az elsődleges agydaganatok, miR-9 emelkedett, és működik, mint egy lényeges tényező idegi karcinogenezissel [10]. miR-9 is túlzott kifejezve méhnyakrák [11], ami arra utal, hogy a tumor promoter szerepet a tumor kifejlődésében és progressziójában. Azonban miR-9 alulszabályozott több emberi rákos megbetegedések, beleértve a hasnyálmirigy-rák [12], petefészekrák [13] és a kolorektális rák [14], és kapcsolatban van a malignus progresszió emlőrák [25] és a kolorektális rák ( 14). Luo et al. Katalógusa megjegyezte, leszabályozza a miR-9 24 gyomorrák példányok [15], amelyet később megerősített 9 [16], 72 [17] és 13 [18] gyomorrák esetben. Azonban Inoue et al. Katalógusa számolt túlszabályzását miR-9 5 gyomorrákos betegek valós idejű PCR-alapú miRNS tömbök [26], és ez a különböző megállapítást miR-9 expressziós profil lehet az oka a heterogenitás korlátozott példányok. Ebben a vizsgálatban azt bizonyítjuk, hogy a miR-9 jelentősen alulszabályozott 86 primer gyomorrák példányok, mint a szomszédos, nem neoplasztikus szövetekben, ami összhangban van a korábbi eredmények [15] - [18]. Fontos azt is megerősítik, hogy a miR-9 expresszió fordítottan arányos a klinikai stádium, invázió, és metasztázis a gyomorrák. Az emberek, az érett miR-9 kódolja három független gének, miR-9-1, miR-9-2 és miR-9-3, helyüket a kromoszómák 1, 5 és 15 között [27]. Korábbi tanulmányok azt jelzik, hogy a lefelé szabályozott miR-9 expresszió gyomorrák annak köszönhető, hogy aberrált hipermetiláció a promoter régió a miR-9 génjeit kódoló [17]. Hasonlóképpen, aberráns hipermetiláció miR-9 családi gének is számoltak be néhány primer tumorokban nyirokcsomó-metasztázis, például vastagbélrák, tüdőrák, emlőrák, és melanoma [14], [28]. Fontos megjegyezni, hogy a jelenlegi tanulmány szerint a fordított összefüggés miR-9 szint és a kifejezés ciklin D1 és ETS1 gyomorrákban szövetekben, utalva arra, hogy a ciklin D1 és ETS1 negatívan szabályozza miR-9. Katalógusa

A funkció és célgénjeit miR-9 olyan tumor-specifikus, és függ a celluláris összefüggésben. miR-9 képes elnyomni az E-cadherin expresszió emlőrákban [29], ami a sejtmagba β-catenin és annak kötő transzkripciós faktorokkal a T-sejt-faktor /lymphoid fokozó faktor 1, és az ezt követő felfelé szabályozott átírását géneket, amelyek elősegítik a sejtek szaporodását és az angiogenezis [29]. Kényszerített miR-9 expresszió mellrák sejtvonalakban is eredményezi, jelentős expressziós változások több gén a p53 kapcsolatos apoptózis [30]. Közvetlen célzás NF-kB, ectopiás expresszióját miR-9 gátolja a in vitro katalógusa és in vivo katalógusa növekedés a petefészekrák sejtek [31], valamint a növekedés és metasztázis melanoma [32] . A neuroblatoma, túlzott expressziója miR-9 gátolja az invázió, metasztázis és angiogenezis tumorsejtek keresztül célzási mátrix metalloproteináz 14 [33]. Wan et al. Katalógusa számolt be, hogy túlzott kifejeződése a miR-9 gátolta a in vitro katalógusa és in vivo katalógusa növekedés gyomor adenokarcinóma sejtvonal MGC803 keresztül elnyomja NF-kB a poszt-transzkripciós szintű [16]. Azonban egy friss tanulmány, Rotkrua et al. Katalógusa jelezte, hogy a miR-9 esetleg részt vesz a gyomor karcinogenezis keresztül alulszabályozza CDX2 és kiütése miR-9 esetében a in vitro katalógusa elterjedése gyomorrák MKN-45 sejtek [19], míg az eredményeket kell tovább erősíteni miR-9 túlzott expressziója, célgén mentés és in vivo vizsgálatok katalógusa. Ezen túlmenően, ez jelenleg ellentmondásos vajon CDX2 játszik onkogén vagy tumor szuppresszor szerepe a gyomor karcinogenezis [34], [35]. Továbbá, a potenciális szerepét miR-9 az invázió és metasztázis a gyomorrák még nem tisztázott eddig. Így a funkció és a közvetlen célpontjai miR-9 gyomorrákban indokolják a további vizsgálatot. Katalógusa

Ebben a tanulmányban azt bizonyította, hogy a túlzott kifejeződése miR-9 csökkentette a proliferáció, migráció és invázió gyomorrák sejtek, amely hasonló volt a ciklin D1 vagy ETS1 knockdown, ami arra utal, a potenciális alkalmazása miR-9, mint a cél a terápiás gyomorrák. Ezen felül, a adatok igazolták, hogy a miR-9 közvetlenül megcélzó ciklin D1 és ETS1 gyomorrákban sejtekhez 3'-UTR luciferáz riporter vizsgálat. Mivel a legújabb bizonyítékok azt mutatják, hogy egyes miRNS alternatív génexpresszió kölcsönhatásban áll promóterek [36] - [38], a potenciális szerepét a miR-9 transzkripcióját szabályozzák ciklin D1 és ETS1 keresztül kölcsönhatásban promóterek is tisztázatlanok, és garantálja a további vizsgálat. A ciklin D1 egy proto-onkogén, amely családjába tartozik a G _{1 ciklinek, és fontos szerepet játszik a sejtciklus G 1 és S átmenet által kötő partnerei ciklinfüggő kináz 4 és 6. foszforilálja és inaktiválja az RB fehérje [21]. Over-expresszió a ciklin D1 egy korai esemény a karcinogenezisben humán kolorektális, nyelőcső és az epehólyag rák [39], és egy prognosztikus indikátor társított szegény túlélés nyelőcső, emlő, és húgyúti rák [39]. Ciklin D1 túlzott expresszió az emberi rákos megvilágítjuk több mechanizmusa, beleértve a genomiális változásokat, poszt-transzkripciós szabályozás, és a poszt-transzlációs fehérje stabilizálása [39]. Újabb bizonyítékok azt mutatják, hogy a miR-16-1 elfojtja ciklin D1 expresszió poszt-transzkripciós szinten keresztül kötelező 3'-UTR köpenysejtes lymphoma [40]. A jelenlegi vizsgálat során, eredményeink azt mutatták, hogy a miR-9-gátlást a sejtciklus progresszióját és sejtburjánzás megmenti helyreállítása ciklin D1 expresszió gyomorrák sejtek, ami arra utal, hogy az azonosító ciklin D1 mint miR-9 célgén megmagyarázhatja, legalábbis részben, hogy miért túlzott expressziójának miR-9 elnyomta a proliferációját gyomor rákos sejteket.}

ETS1, tagja az ETS család a transzkripciós faktorok, kötődik a specifikus DNS-szekvenciák tartalmaznak egy GGAA /T mag motívum [22], és részt vesz a tumor invázió és metasztázis transzkripcionális szabályozása útján számos gén felelős az extracelluláris mátrix remodelling, a migráció, és invázió, mint például a mátrix metalloproteináz és az urokináz plazminogén aktivátor [22]. A mai napig, egyre több klinikai vizsgálatok kimutatták, hogy a fontos szerepét ETS1 tumor kifejlődésének és progressziójának különböző szilárd tumorok [23], [24]. Korábbi tanulmányok azt jelzik, hogy ETS1 expressziója összefügg a klinikopatológiai jellemzői gyomorrák, beleértve a tumor beszűrődés és a nyirokcsomók vagy disztális metasztázis, ami arra utal, hogy kritikus szerepet játszik a invázió és metasztázis gyomorrák [41]. Azonban azok a mechanizmusok alapjául szolgáló ETS1 túlzott expresszió az gyomorrák még mindig nagyrészt ismeretlenek. Újabb vizsgálatok kimutatják a poszt-transzkripciós szabályozása ETS1 által miR-125b emlőrákos sejtek [42], és a miR-200b endotél sejtekben [43]. Ebben a tanulmányban azt bizonyította, hogy a közvetlen cél a miR-9, ETS1 került fel szabályozott gyomorrákban, és hozzájárult a migrációs és behatolás rákos sejtek szaporodását. Kiütése ETS1 részben phenocopied hatásait miR-9 túlzott kifejeződése a gyomorrák sejtvonalakon, míg helyreállítása ETS1 kifejezése megmentette a ráksejtek miR-9-gátlást a migrációs és behatolás, felfedve egy új poszt-transzkripciós szabályozás mechanizmusa a ETS1 által miR-9 és klinikai potenciálja gyomorrákban. katalógusa

Összefoglalva, azt bizonyította, először, hogy a miR-9 elnyomja kifejezése ciklin D1 és ETS1 keresztül közvetlenül megcélzó a 3 ' UTR, így gátolja a proliferációt, invázió és metasztázis a gyomor rákos sejteket. Ez a tanulmány kiterjed tudásunk szabályozása ciklin D1 és ETS1 a poszt-transzkripciós szinten miRNS, és javasolja, hogy a miR-9 lehetnek potenciális értékek, mint új terápiás célpont gyomorrák. Katalógusa

Anyagok és módszerek katalógusa

Patient szövetminta katalógusa

jóváhagyása véghez ezt a vizsgálatot végzünk az intézményi Review Board Tongji Medical College (jóváhagyási szám: 2010-S003). Paraffinba ágyazott és friss példányai 86 primer gyomorrák esetben kaptunk a Sebészeti Osztály, Union Kórház Tongji Medical College. Patológiai diagnózis bizonyította legalább két patológusok. A demográfiai és klinikopatológiai adatait minden beteget táblázat S1. Szomszédos gyomornyálkahártya, amely nem tartalmazott makroszkopikus tumor is kapunk, és a nem-neoplasztikus területek ezt követően ellenőriztük mikroszkopikus szövettan. A friss tumor minták és a szomszédos nem-daganatos nyálkahártya összegyűjtjük, és -80 ° C-on tároltuk felhasználásig.

Immunhisztokémia

Az immunhisztokémiai festést végeztünk a korábban leírtak [44], specifikus antitestekkel ciklin D1, ETS1, MMP-9 és CD31 (ABCAM Inc, Cambridge, MA, 1: 200 hígításban). A negatív kontrollok közé párhuzamos szakaszok kezelt kihagyásával a primer antitest, amellett, hogy egy szomszédos szakasza ugyanabban a blokkban, amelyben a primer antitest váltotta nyúl poliklonális IgG-t (ABCAM Inc), mint egy izotípus kontroll. A reaktivitás fokozat értékelte legalább két patológusok ismerete nélkül klinikopatológiai jellemzői daganatok. A pozitivitás fokát eredetileg szerint osztályozzák a százalékos pozitív rákos sejtek, mint a következő: (-) < 5% sejtek pozitív, (1+) 6-25% sejtek pozitív, (2+) 26-50% sejtek pozitív , és (3+) > 50% sejtek pozitív. A tárgylemezeket mérsékelt pozitív (2+), vagy erősen pozitív (3+) reaktivitás sorolták, mint amelyek a "magas" kifejezés, míg a diák negatív (-) vagy gyenge pozitív (1+) reaktivitás sorolták, mint amelyek egy "alacsony" kifejezés .

Western blot

sejtfehérje extraháljuk 1 × sejt lízis pufferben (Promega, Madison, WI). Fehérje (50 ng) minden mintából vetettük alá 4-20% előregyártott poliakrilamid gélen (Bio-Rad, Hercules, CA) elektroforézissel és nitrocellulóz membránokra visszük át (Bio-Rad). A ciklin D1, ETS1, MMP-9, pRB és β-aktin (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) észlelése, a primer ellenanyag hígításokat 1:500, 1:500, 1:500, 1:500 és 1: 1000, illetve, majd 1:3000 hígítású kecske anti-nyúl torma-peroxidáz-jelzett antitest (Bio-Rad). Fokozott kemilumineszcencia szubsztrát kittel (Amersham, Piscataway, NJ) használtunk a chemiluminscent kimutatására jelek autoradiográfiás filmre (Amersham).

RT-PCR és a valós idejű kvantitatív RT-PCR

Összesen RNS-t izoláltunk RNeasy Mini Kit (QIAGEN Inc., Valencia, CA). A reverz transzkripciós reakciót végeztünk Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit (Roche, Indianapolis, IN). A PCR-iáncindítók a ciklin D1, ETS1, MMP-9 és β-aktin tervezte Premier Primer 5.0 szoftver (táblázat S2). RT-PCR-t végeztünk a korábban leírtak [44]. Valós idejű kvantitatív RT-PCR SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems, Foster City, CA) alkalmazásával végeztük ABI Prism 7700 Sequence detector (Applied Biosystems). A fluoreszcens jelet, alatt gyűjtötték kiterjesztett fázis, Ct értékeket a minták számoltuk, és az átirat szintek ciklin D1, ETS1 és MMP-9 normalizáltuk azok β-aktin 2 ^{-ΔΔCt módszerrel.}

számszerűsítése miR-9 expresszió katalógusa

A szintek érett miR-9 elsődleges szövetek és sejtvonalak segítségével meghatároztuk ardenneki-Loop ™ miRNS qPCR primer Set (RiboBio Co. Ltd., Guangzhou, Kína). Miután a cDNS-t szintetizáltunk egy miRNS-specifikus szár-hurok primert, a kvantitatív PCR-t végeztünk a specifikus primereket (táblázat S2). A miR-9 szint is azoknak a U6 snRNS. Katalógusa

miRNS target predikciós katalógusa

A miRNS célokat megjósolható az algoritmusok Miranda, miRDB, RNA22 és Targetscan [45]. Azonosítani a gének gyakran megjósolta négy különböző algoritmusok eredményei megjósolt célokat metszette a miRWalk [46]. Katalógusa

Sejttenyésztés és transzfekció katalógusa

Az emberi gyomor rákos sejtvonalak (SGC-7901 és MKN-74) és az SV40-transzformált, normál, nem tumorképző gyomornyálkahártya GES-1 sejtekben [20] kaptuk a Type Culture Collection of kínai Tudományos Akadémia (Sanghaj, Kína). Emberi gyomorrák sejtvonalat AGS (CRL-1739) vásárolt formában az American Type Culture Collection (Rockville, MD). A sejteket RPMI1640 tápközegben (Life Technologies, Inc., Gaithersburg, MD), kiegészítve 10% magzati borjúszérummal (Life Technologies, Inc.), penicillinnel (100 U /ml) és sztreptomicint (100 ng /ml). A sejteket 37 ° C-on nedvesített atmoszférában, 5% CO _2.

• PLoS One: egyrészről csökkenti a plazma adiponectin szintje és bakteriális felülfertőzés veszélye után gyomorkarcinóma Sebészet
• PLoS One: Expression az AFP és STAT3 részt vesz az arzén-trioxid-indukált apoptózis gátlása és a proliferációs AFP-termelő gyomorkarcinóma Cells