PLoS ONE: mikroRNA-9 Undertrykker spredning, invasjon og metastasering av magekreft celler gjennom målretting Cyclin D1 og ETS1

Abstract

Nyere funn viser at endrede mikroRNA-9 (MIR-9) uttrykk er innblandet i utviklingen av magekreft. Men de eksakte roller og underliggende mekanismer for Mir-9 i spredning, invasjon og metastasering av magekreft fortsatt ukjent. I denne studien ble MIR-9 funnet å være nedregulert og inverst korrelert med ekspresjonen av cyclin D1 og v-ets erythroblastosis virus E26 onkogen homolog 1 (ETS1) i magekreft vev og cellelinjer. Bioinformatikk analyse viste de antatte MIR-9 bindingssteder i 3'-utranslaterte regioner (3'-UTR) av cyclin D1 og ETS1 mRNA. Ektopisk uttrykk eller knockdown av MIR-9 resulterte i responsivt endret uttrykk for cyclin D1, ETS1 og deres nedstrøms mål fosforylert retinoblastom og matriks metalloproteinase 9 i dyrkede mage kreft cellelinjer SGC-7901 og AGS. I luciferase reporter system, MIR-9 direkte rettet 3'-UTR av cyclin D1 og ETS1, og disse effektene ble avskaffet ved mutere Mir-9 bindingssteder. Over-uttrykk for MIR-9 trykt spredning, invasjon og metastasering av SGC-7901 og AGS celler in vitro Hotell og in vivo
. Restaurering av MIR-9-mediert nedregulering av cyclin D1 og ETS1 ved transient transfeksjon, reddet kreftceller fra reduksjon i proliferasjon, migrering og invasjon. Videre anti-MIR-ni inhibitor forfremmet spredning, migrasjon og invasjon av magekreftceller, mens banket ned av cyclin D1 eller ETS1 delvis phenocopied effektene av Mir-ni over-uttrykk. Disse dataene indikerer at Mir-9 undertrykker uttrykk for cyclin D1 og ETS1 via bindingsstedene i sin 3'-UTR, og dermed hemme spredning, invasjon og metastasering av magekreft

Citation. Zheng L, Qi T, Yang D, Qi M, Li D, Xiang X, et al. (2013) mikroRNA-9 Undertrykker spredning, invasjon og metastasering av magekreft celler gjennom målretting Cyclin D1 og ETS1. PLoS ONE 8 (1): e55719. doi: 10,1371 /journal.pone.0055719

Redaktør: Alejandro H. Corvalan, Pontificia Universidad Catolica de Chile, Chile

mottatt: 14. september 2012; Godkjent: 29 desember 2012; Publisert: 31 januar 2013

Copyright: © 2013 Zheng et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres

Finansiering:. Støttet av Foundation National Natural Science of China (No. 30600278, nr 30772359, nr 81071997, nr 81072073, nr 81272779), Program for New Century gode talenter i University (NCET-06-0641), Scientific Research Foundation for returnerte Overseas Chinese Scholars (2008-889), og grunnleggende forskning fond for de sentrale universiteter (2012QN224). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer

Innledning

Magekreft kreft~~POS=HEADCOMP er den fjerde vanligste kreftformen i verden [1]. Til tross for bedring i kirurgisk og multimodal terapi, fortsatt prognosen for avansert magekreft dårlig på grunn av gjentakelse, invasjon og metastasering, med en 5-års overlevelse under 30% [1]. En bedre kunnskap om mekanismene bak tumorprogresjon er berettiget til å oppdage nye paradigmer for diagnostisering og behandling av magekreft [2]. MicroRNAs (mirnas), en nylig identifisert kategori av små og høyt konserverte ikke-kodende RNA, kan delta i post-transcriptional regulering av genuttrykk gjennom delvis komplementær binding med 3-utranslaterte regioner (3'-UTR) av målet mRNA, som resulterer i translasjonell undertrykkelse eller mRNA degradering [3]. Emerging bevis viser at mirnas er involvert i de biologiske prosesser knyttet til apoptose, proliferasjon, differensiering, invasjon og metastasering, mens dereguleringen av noe som er avgjørende for kreft initiering og progresjon [3]. Det er for tiden haster å undersøke rollene til mirnas og deres mål gener i tumorprogresjon ved eksperimentelle modeller.

I human magekreft, har blitt rapportert en rekke mirnas å være abnormt over-uttrykt eller nedregulert i løpet av progresjon av magekreft, inkludert MIR-21 [4], Mir-15b [5], Mir-16 [5], og MIR-101 [6]. Disse mirnas spille onkogene eller kreftundertrykkende roller i regulering av cellevekst, migrasjon og invasjon av undertrykke sine mål gener. For eksempel, er onkogene MIR-21 abnormt over-uttrykt i magekreft, og forbedrer spredning og invasivitet av magecancerceller ved å målrette rever-induserende cysteinrike proteiner med Kazal motiver [4]. I mellomtiden, MIR-15b og MIR-16 er nedregulert i magekreft, og bidra til multimedikamentresistens av magekreftceller ved modulering av apoptose via rettet mot B-celle leukemi /lymfom 2 [5]. MIR-101 er nedregulert i mage kreft vev og cellelinjer, mens ektopisk uttrykk for MIR-101 signifikant hemmer spredning, migrasjon og invasjon av magekreftceller ved å målrette Enhancer av Zeste homolog 2, cytokrom c oksidase subenheten II, og myeloid celle leukemi-sekvens 1 [6]. Derfor har det vært et fokus for å utforske videre uttrykk og funksjon av miRNA i tumorbiologi av magekreft.

mikroRNA-9 (MIR-9) er først identifisert som en av de avgjørende regulatorer for utvikling , fysiologi og patologi av nervesystemet i flere organismer, inkludert Drosophila
, sebrafisk og pattedyr [7] - [9]. En serie av etterfølgende studier har vist at endrede MIR-9 ekspresjon er assosiert med utvikling og progresjon av kreft [10] - [14]. Tidligere studier viser at MIR-9 er betydelig nedregulert i magekreft, noe som tyder på dets potensielle roller i tumorprogresjon [15] - [18]. Det er også antydet at Mir-9 kan modulere spredning av magekreftceller via målrette haletypen homeobox 2 (CDX2) [19] og NF-kappa B (NF-kB) [16]. Men den eksakte funksjon og underliggende mekanismene for Mir-9 i utviklingen av magekreft fortsatt garanterer videre etterforskning. I denne studien demonstrerer vi for første gang, at MIR-9 direkte rettet mot cyclin D1 og v-ets erythroblastosis virus E26 onkogen homolog 1 (ETS1), og undertrykker spredning, invasjon og metastasering av magekreftceller i vitro Hotell og in vivo
.

Resultater

MIR-9 var nedregulert og omvendt korrelert med uttrykk for cyclin D1 og ETS1 i mage kreft vev og cellelinjer

For å undersøke MIR-9 uttrykk i magekreft, magekreft vev og tilstøtende ikke-neoplastisk slimhinnen ble samlet inn fra 86 primær tilfeller. Real-time kvantitativ revers transkripsjon PCR (RT-PCR) viste at Mir-9 ble nedregulert i mage kreft vev enn i tilstøtende ikke-neoplastisk slimhinnen ( P
= 0,001, Fig. 1a). Mir-9 uttrykk var betydelig lavere i magekrefttilfeller med dypere mageveggen invasjon ( P
< 0,001), lymfeknutemetastase ( P
< 0,001), fjernmetastaser ( P
= 0,022), og avansert TNM stadium ( P
= 0,01) (Tabell S1). Derimot ble høyere cyclin D1 og ETS1 transkripsjonsnivåer påvist i magekreft vev ( P
< 0,0001 og P
. ≪. 0,0001, henholdsvis figur 1B og figur 1C). Det var en invers korrelasjon mellom MIR-9 uttrykk og cyclin D1 transkripsjonsnivåer i mage kreft vev ( P
. ≪ 0,001, figur 1D). I tillegg ble en invers korrelasjon mellom MIR-9 uttrykk og ETS1 transkripsjonsnivåer også bemerket i disse kreft vev ( P
. ≪ 0,001, figur 1E). Lavere MIR-9 uttrykk og høyere transkripsjonsnivåer av cyclin D1 og ETS1 ble observert i magekreft cellelinjer enn i normale mage epitelceller GES-1 celler [20] (Fig. 1F). Immunhistokjemisk farging ble utført for å observere den ekspresjonen av cyclin D1 og ETS1 i disse kreft prøver (fig. S1). Nuclear cyclin D1 ble notert i 26/86 (30,2%) tilfeller, mens kjernekraft og cytoplasma farging av ETS1 ble observert i 58/86 (67,4%) tilfeller (tabell S1). Immunreaktiviteten cyclin D1 og ETS1 var betydelig høyere i magekrefttilfeller med dypere mageveggen invasjon ( P
< 0,001 og P
= 0,001), lymfeknutemetastase ( P
< 0,001 og P
< 0,001), fjernmetastaser ( P
< 0,001 og P
< 0,001), og avansert TNM stadium ( P
< 0,001 og P
= 0,004) (tabell S1). Lavere MIR-9 uttrykk ble observert i mage kreft vev med høyere farging av cyclin D1 ( P
< 0,0001, figur 1G.) Eller ETS1 ( P
. ≪ 0,0001, figur 1 H ). Resultatene indikerte at Mir-9 ble nedregulert og omvendt korrelert med uttrykk for cyclin D1 og ETS1 i mage kreft vev og cellelinjer.

MIR-9 nedregulert uttrykk for cyclin D1 og ETS1 via post -transcriptional undertrykkelse

for å undersøke hypotesen om at Mir-9 kan påvirke uttrykket av cyclin D1 og ETS1 i magekreft, ble beregnings forutsigelse utført av miRNA databaser. Potensielle bindingsseter fra Mir-9 med høy komplementaritet ble registrert på baser 2974-2995 av cyclin D1 3'-UTR og 2648-2670 av ETS1 3'-UTR (Fig. 2A). For å undersøke de direkte effektene av MIR-9 på uttrykk for cyclin D1 og ETS1 i magekreftceller, utførte vi miRNA over-uttrykk eksperimenter. Stabil transfeksjon av MIR-9 forløper til SGC-7901 og AGS celler resulterte i økning av MIR-9 nivåer (fig. S2). Western blot, RT-PCR og real-time kvantitativ RT-PCR viste at over-ekspresjon av MIR-9 resulterte i redusert protein og transkripsjonelle nivåer av cyklin D1 og ETS1 i magekreftceller enn det som er transfektert med negativ kontroll-vektor (mock) ( fig. 2B fig. 2C, og fig. 2D). I tillegg, vil nivået av fosforylert retinoblastom (pRB, en nedstrøms effektor av cyclin D1) [21] og matriks-metalloproteinase-9 (MMP-9, en nedstrøms gen av ETS1) [22] ble redusert i MIR-9 over-uttrykkende kreftceller (fig. 2B fig. 2C, og fig. 2D). For ytterligere å undersøke undertrykkende rolle MIR-9 i uttrykket av cyclin D1 og ETS1, utførte vi Mir-9 knockdown eksperimenter ved transfeksjon av anti-MIR-9 eller negativ kontroll (anti-NC) hemmere i GES-1, SGC -7901 og AGS celler. Transfeksjon av anti-MIR-9-inhibitor åpenbart minsket den endogene MIR-9 ekspresjon (Fig. S3A), og oppregulert proteinnivåer cyklin D1, pRb, ETS1 og MMP-9 enn de som er transfektert med anti-NC (fig. 2E og fig. S4A). Sanntids kvantitativ RT-PCR-analyser viste de forbedrede transkripsjonsnivåer av cyklin D1, ETS1 og MMP-9 i dyrkede celler transfektert med anti-MIR-9-inhibitor, i forhold til de transfektert med anti-NC (fig. 2F og Fig. S4B). Samlet er disse resultatene viste at Mir-ni betydelig hemmet uttrykk for cyclin D1 og ETS1 via post-transcriptional undertrykkelse.

MIR-9 direkte målrettet cyclin D1 og ETS1 i magekreftceller

Å avgjøre om MIR-9 kan undertrykke uttrykk for cyclin D1 og ETS1 ved å målrette sine bindingssteder i 3'-UTR, ble PCR-produkter som inneholder intakte målområder eller mutasjon av MIR-9 frø gjenkjenningssekvenser (fig. 3A) satt inn luciferase reporter-vektoren. Plasmidene ble transfisert inn i magekreftceller som er stabilt transfektert med negativ kontroll vektor (mock) eller MIR-9 forløper. Renilla
luciferasepreparater aktiviteter normalisert til de av Firefly ble betydelig redusert i SGC-7901 og AGS celler stabilt transfektert med MIR-9 forløper (Fig. 3B), og disse effektene ble avskaffet av mutere den antatte MIR-9 bindingssteder innenfor 3'-UTR av cyclin D1 og ETS1 (fig. 3B). Videre knockdown av MIR-9 med anti-MIR-ni inhibitor økte luciferasepreparater aktiviteter i GES-en, SGC-7901 og AGS celler (Fig. 3C og S4C fig.), Mens mutasjon av MIR-9 anerkjennelse stedet avskaffet disse effektene (fig. 3C og S4C fig.). Resultatene indikerte at Mir-9 direkte og spesifikt interaksjon med målse i 3'-UTR av cyclin D1 og ETS1.

MIR-9 trykt in vitro
spredning av magekreft cellene gjennom målretting cyklin D1

Siden ovennevnte bevis viste at MIR-9 inhiberte cyklin D1 uttrykk, og å kombinere de fakta som Cyclin D1 spiller en kritisk rolle i cellesyklusprogresjon og proliferasjon av kreftceller [21], vi videre undersøkt effekten av Mir-9 over-uttrykk og målet genet restaurering på dyrkede mage kreftceller. Western blot og real-time kvantitativ RT-PCR indikerte at transfeksjon av cyclin D1, men ikke fra ETS1, reddet MIR-9-indusert nedregulering av cyclin D1 (Fig. 4A og 4B fig.). I kolonidannelsesbestemmelsen, MIR-9 over-ekspresjon svekkede veksten av SGC-7901 og AGS-celler, sammenlignet med de som er transfektert med negativ kontroll-vektor (mock) (Fig. 4C). Flowcytometri indikerte at Mir-ni over-uttrykk indusert cellesyklus arrest på G _{0 /G en fase i SGC-7901 og AGS celler (fig. 4D). I tillegg transfeksjon av cyclin D1, men ikke fra ETS1, i SGC-7901 og AGS celler restaurert spredning hemming og cellesyklus arrest indusert av over-uttrykk for MIR-9 (fig. 4C og fig. 4D). På den annen side, undersøkte vi effekten av MIR-9 knockdown på GES-1, SGC-7901 og AGS celler. Innføring av anti-MIR-9-inhibitor inn i disse cellene resulterte i forbedrede egenskaper i proliferasjon (fig. S3b), og cellesyklusprogresjon (fig. S3C). Resultatene indikerte at Mir-9 bemerkelsesverdig undertrykt in vitro
spredning og cellecyklusprogresjonen av magekreftceller gjennom målretting cyclin D1.}

MIR-9 svekket in vitro
migrasjon og invasjon av magekreftceller gjennom målretting ETS1

Siden tidligere studier indikerer de viktige rollene ETS1 i invasjonen og metastasering av kreft celler [23], [24], vi videre undersøkt effekten av speil 9 over-uttrykk og målet genet restaurering på migrasjon og invasjon av magekreft SGC-7901 og AGS celler. Western blot og real-time kvantitativ RT-PCR indikerte at transfeksjon av ETS1, men ikke av cyclin D1, reddet MIR-9-indusert nedregulering av ETS1 (Fig. 5A og 5B fig.). I transwell migrasjon assay, gastrisk kreft celler stabilt transfektert med MIR-9 forløper presentert en nedsatt migrasjon kapasitet enn det som er transfektert med negativ kontroll-vektor (mock) (fig. 5C). I Matrigel invasjonen assay, MIR-ni over-uttrykk svekket invasive av SGC-7901 og AGS celler (Fig. 5D). I tillegg transfeksjon av ETS1, men ikke av cyclin D1, inn SGC-7901 og AGS cellelinjer restaurert Mir-9-meditaed hemming på migrasjon og invasjon (Fig. 5C og Fig. 5D). Videre undersøkte vi effekten av MIR-9 knockdown på GES-1, SGC-7901 og AGS celler. Transfeksjon av anti-MIR-9-inhibitor resulterte i forbedret migrering og invasjon av disse cellene (fig. S3D og S3E fig.). Resultatene indikerte at Mir-9 bemerkelsesverdig svekket in vitro
migrasjon og invasjon av magekreftceller gjennom målretting ETS1.

MIR-9 svekket vekst og metastasering av magekreftceller in vivo

Vi neste undersøkte effekten av MIR-9 mot tumorvekst og metastase in vivo
. Stabil transfeksjon av MIR-9 forløper inn i SGC-7901 eller AGS-celler resulterte i redusert vekst og vekten av subkutane xenograft tumorer i atymiske nakne mus, sammenlignet med de som er stabilt transfektert med negativ kontroll-vektor (mock) (fig. 6A og fig. 6B ). Dessuten ble ekspresjonen av cyclin D1, ETS1 og nedstrøms MMP-9 reduseres med stabil transfeksjon av MIR-9-forløper (fig. 6C). Den CD31-positive midlere fartøyet Tettheten ble redusert i løpet av tumorer som dannes ved injeksjon av kreftceller som er stabilt transfektert med MIR-9-forløper (fig. 6D). I de eksperimentelle metastase studier, SGC-7901 eller AGS celler stabilt transfektert med MIR-9 forløper etablerte statistisk færre lungemetastatiske kolonier enn mock gruppe (Fig. 6E). Disse resultatene antydet at Mir-9 hemmet vekst og metastasering av magekreftceller in vivo
.

knockdown av cyclin D1 og ETS1 phenocopied MIR-ni over-uttrykk hemming på spredning , migrasjon og invasjon av magekreftceller in vitro

Siden ovennevnte resultatene indikerte negative regulering av cyclin D1 og ETS1 uttrykk ved MIR-ni, vi hypotese at knockdown av cyclin D1 og ETS1 makt utøve lignende effekter på dyrkede mage kreftceller. De små interfererende RNA (siRNAs) rettet mot koding regionen cyclin D1 og ETS1, si-CCND1 og si-ETS1, ble utformet og transfektert inn SGC-7901 og AGS celler. Transfeksjon av si-CCND1 og si-ETS1 resulterte i redusert ekspresjon av cyclin D1, pRB, ETS1 og MMP-9 i magekreftceller, respektivt, når sammenlignet med de som er transfektert med krafse siRNA (Si-Scb) (Fig. 7A, fig . 7D og S5) fig.. Knockdown av cyclin D1 trykt spredning og indusert cellesyklus arrest på G _{0 /G en fase i SGC-7901 og AGS celler (Fig. 7B og Fig. 7C). I tillegg knockdown av ETS1 i SGC-7901 og AGS celler resulterte i redusert mulighetene til migrasjon og invasjon (Fig. 7E og 7F fig.). Disse resultatene antydet at knockdown av cyclin D1 og ETS1 phenocopied (besatt lignende fenotyper til) MIR-ni over-uttrykk i hemme spredning, migrasjon og invasjon av magekreftceller in vitro
.}

diskusjon

det har vært godt etablert at MIR-9 uttrykk profil i kreft er avhengig av vev distribusjon. I primære hjernesvulster, er MIR-9 forhøyet og fungerer som en viktig faktor i nevrale kreftutvikling [10]. MIR-9 er også over-uttrykt i livmorhalskreft [11], noe som tyder på sin svulst promoter rolle i tumorutvikling og progresjon. Imidlertid MIR-9 er nedregulert i flere humane kreftformer, inkludert kreft i bukspyttkjertelen [12], eggstokk-kreft [13] og tykktarmskreft [14], og er forbundet med den ondartede progresjon av brystkreft [25] og kolorektal kreft ( 14). Luo et al.
Bemerket nedregulering av MIR-9 i 24 magekreft prøver [15], som deretter ble bekreftet i ni [16], 72 [17], og 13 [18] magekreft saker. Men Inoue mfl.
Rapporterte oppregulering av MIR-9 i 5 magekreftpasienter ved real-time PCR-basert miRNA matriser [26], og dette annerledes funn i MIR-9 uttrykk profil kan skyldes til heterogenitet av begrensede eksemplarer. I denne studien viser vi at MIR-9 er betydelig nedregulert i 86 primærmagekreft prøvene enn i tilstøtende ikke-neoplastiske vev, noe som er i overensstemmelse med tidligere funn [15] - [18]. Viktigere, vi bekrefter også at Mir-9 uttrykk er omvendt assosiert med kliniske stadier, invasjon og metastasering av magekreft. Hos mennesker er moden MIR-9 kodet av tre uavhengige gener, MIR-9-1, MIR-9-2 og MIR-9-3, finne på kromosomene 1, 5 og 15, henholdsvis [27]. Tidligere studier viser at nedregulert MIR-9 uttrykk i magekreft skyldes avvikende hypermethylation av arrangøren regionen MIR-9 kodende genene [17]. Tilsvarende er avvikende hypermethylation av MIR-9 familie gener også rapportert i enkelte primære tumorer med lymfeknutemetastase, som tykktarmskreft, lungekreft, brystkreft, melanom og [14], [28]. Viktigere, denne studien rapporterte invers korrelasjon mellom MIR-9 nivåer og uttrykk for cyclin D1 og ETS1 i mage kreft vev, noe som tyder på at cyclin D1 og ETS1 kan bli negativt regulert av MIR-9.

Funksjonen og målgener av MIR-9 er tumorspesifikke og avhengig av mobilnettet sammenheng. MIR-9 er i stand til å undertrykke E-cadherin ekspresjon i brystkreft [29], noe som resulterer i den nukleære translokasjon av β-catenin og dens binding med transkripsjonsfaktorer T-celle-faktor /lymfoid enhancer faktor 1, og påfølgende oppregulert transkripsjon av gener som letter celleproliferasjon og angiogenese [29]. Tvunget MIR-9 ekspresjon i brystkreftcellelinjer resulterer også i betydelige uttrykk endring av multiple gener i p53-relaterte apoptotiske reaksjonsvei [30]. Gjennom direkte rettet mot NF-kB, ektopisk uttrykk for MIR-9 hemmer in vitro Hotell og in vivo
vekst av eggstokkreft celler [31] og vekst og metastasering av melanom [32] . I neuroblatoma, over-uttrykk for MIR-9 hemmer invasjonen, metastase, og angiogenese av tumorceller gjennom målretting matriksmetalloproteinase 14 [33]. Wan et al.
Rapportert at over-uttrykk for MIR-9 hemmet in vitro Hotell og in vivo
veksten av adenokarsinom cellelinje MGC803 gjennom undertrykke NF-kB på post-transcriptional nivå [16]. Men i en fersk undersøkelse, Rotkrua mfl.
Indikerte at Mir-9 kan være involvert i magekreftutvikling gjennom å nedregulere CDX2, og knockdown av MIR-9 redusert in vitro
spredning av magekreft MKN-45 celler [19], mens funnene må styrkes ytterligere med MIR-ni over-uttrykk, target genet redning, og in vivo
studier. I tillegg er det for tiden omstridt hvorvidt CDX2 spiller en onkogen eller tumor suppressor rolle i mave karsinogenese [34], [35]. Dessuten har de potensielle roller MIR-9 i invasjonen og metastasering av magekreft ikke klarlagt så langt. Dermed funksjons og direkte mål av MIR-9 i magekreft garanterer videre etterforskning.

I denne studien, viste vi at overuttrykk av MIR-9 svekket spredning, migrasjon og invasjon av magekreftceller, som var lik som cyclin D1 eller ETS1 knockdown, noe som tyder på potensialet anvendelsen av MIR-9 som et mål for terapi av magekreft. I tillegg er våre data bekreftet at Mir-9 direkte målrettet cyclin D1 og ETS1 i magekreftceller gjennom 3'-UTR luciferase reporter analysen. Siden siste bevis viser at visse mirnas kan alternativt modulere genekspresjon ved å samhandle med arrangører [36] - [38], de potensielle roller MIR-9 i regulere transkripsjon av cyclin D1 og ETS1 gjennom samspill med arrangører fortsatt uklare, og garanterer vår videre etterforskning. Cyclin D1 er et proto-onkogen som tilhører familien av G _{1 cykliner, og spiller en viktig rolle i cellesyklusen G 1 til S overgang ved å binde sine partnere cyclin avhengig kinase 4 og 6 for å fosforylere og inaktivere RB-proteinet [21]. Over-ekspresjon av cyclin D1 er en tidlig begivenhet i karsinogenese i humane kolorektale, esophageal og galleblæren kreft [39], og er en prognostisk indikator forbundet med dårlig overlevelse i spiserøret, bryst, og urin kreft [39]. Cyclin D1 over-uttrykk i humane kreftformer er belyst ved flere mekanismer, inkludert genomiske forandringer, post-transkripsjonsregulering, og post-translasjonell proteinstabilisering [39]. Nyere funn viser at Mir-16-1 undertrykker cyclin D1 uttrykk på post-transkripsjonsnivået via binding sin 3'-UTR i mantelcellelymfom [40]. I denne studien, våre funn viste at Mir-9-mediert hemming av cellesyklusprogresjon og celleproliferasjon ble reddet av restaurering av cyclin D1 uttrykk i magekreftceller, noe som tyder på at identifisering av cyclin D1 som MIR-ni mål genet, kan forklare, i det minste delvis, hvorfor over-ekspresjon av MIR-9 undertrykkes spredning av magecancerceller.}

ETS1, et medlem av ETS-familien av transkripsjonsfaktorer, bindes til spesifikke DNA-sekvenser som inneholder en GGAA /T kjernemotivet [22], og deltar i tumorinvasjon og metastase ved transkripsjonsregulering av flere gener som er ansvarlige for ekstracellulær matriks remodellering, migrering og invasjon, så som matriksmetalloproteinase og urokinase-plasminogen-aktivator [22]. Til dags dato har et økende antall kliniske studier vist de viktige rollene ETS1 i tumor utvikling og progresjon av ulike solide svulster [23], [24]. Tidligere studier viser at ETS1 uttrykk er relatert til clinicopathological funksjonene til magekreft, inkludert tumorinfiltrasjon og lymfeknuter eller distal metastase, noe som tyder på sin kritiske rolle i invasjonen og metastasering av magekreft [41]. Men fortsatt mekanismene bak ETS1 over-uttrykk i magekreft fortsatt i stor grad ukjent. Nyere studier viser at post-transcriptional regulering av ETS1 av MIR-125b i brystkreftceller [42], og ved MIR-200b i endotelceller [43]. I denne studien viste vi at som et direkte mål for MIR-9, ETS1 ble oppregulert i magekreft og bidratt til migrasjon og invasjon av kreftceller. Knockdown av ETS1 delvis phenocopied effektene av MIR-ni over-uttrykk i mage kreft cellelinjer, mens restaurering av ETS1 uttrykk reddet kreftcellene fra MIR-9-mediert hemming på migrasjon og invasjon, avslører en ny post-transkripsjonsregulering mekanisme av ETS1 av MIR-9 og dens kliniske potensialer i magekreft.

i sammendraget har vi vist for første gang, at MIR-9 undertrykker uttrykk for cyclin D1 og ETS1 gjennom direkte rettet mot deres 3 ' -UTR, og dermed hemme proliferasjon, invasjon og metastasering av gastrisk kreft celler. Denne studien utvider vår kunnskap om regulering av cyclin D1 og ETS1 på post-transkripsjonsnivået av miRNA, og antyder at Mir-9 kan være av potensielle verdier som en roman terapeutisk mål for magekreft.

Materialer og metoder

pasient~~POS=TRUNC vevsprøver

godkjennings~~POS=TRUNC å gjennomføre denne studien ble innhentet fra Institutional Review Board of Tongji Medical College (godkjenningsnummer: 2010-S003). Parafin-embedded og friske eksemplarer av 86 primærmagekrefttilfeller ble hentet fra Department of Surgery, Union Hospital of Tongji Medical College. Deres patologisk diagnose ble bevist av minst to patologer. De demografiske og clinicopathological data av alle pasienter ble oppsummert i tabell S1. Tilstøtende gastrisk mucosa som inneholdt ingen makroskopisk tumor ble også oppnådd, og de ikke-neoplastiske områdene ble deretter bekreftet ved mikroskopisk histologi. De friske vevsprøver og tilstøtende ikke-neoplastisk mucosa ble samlet og lagret ved -80 ° C inntil bruk.

Immunhistokjemi

Immunhistokjemisk farging ble utført som tidligere beskrevet [44], med antistoffer som er spesifikke for cyclin D1, ETS1, MMP-9 og CD31 (Abcam Inc, Cambridge, MA, 1: 200 fortynninger). De negative kontroller inkluderes parallelle seksjoner som ble behandlet med utelatelse av det primære antistoff, i tillegg til en tilstøtende seksjon av den samme blokk i hvilken det primære antistoff ble erstattet med kanin polyklonal IgG (Abcam Inc) som en isotype-kontroll. Reaktiviteten graden ble bestemt ved minst to patologer uten kjennskap til clinicopathological funksjonene i tumorer. Graden av positivitet ble opprinnelig klassifisert i henhold til prosentandelen av positive cancerceller som følgende: (-) < 5% celler positiv, (1+) 6-25% positive celler, (2 +) 26-50% celler positiv og (3 +) > 50% celler positive. Lysbilder med moderat positive (2+) eller sterk positiv (3+) reaktivitet ble klassifisert som å ha en "high uttrykk", mens lysbilder med negativ (-) eller svak positiv (1+) reaktivitet ble klassifisert som å ha en "low uttrykk" .

Western blot

Cellular protein ble ekstrahert med 1 x cellelyse buffer (Promega, Madison, WI). Protein (50 ug) fra hver prøve ble underkastet 4-20% pre-støpt polyakrylamid-gel (Bio-Rad, Hercules, CA) elektroforese og overført til nitrocellulosemembraner (Bio-Rad). For cyclin D1, ETS1, MMP-9, pRB og β-aktin (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) deteksjon, de primære antistoff fortynninger var 1:500, 1:500, 1:500, 1:500 og 1: 1000, henholdsvis, fulgt av 1:3000 fortynning av geite-anti-kanin-pepperrot peroksidase-merket antistoff (Bio-Rad). Forbedret kjemiluminescens substrat-sett (Amersham, Piscataway, NJ) ble anvendt for chemiluminscent deteksjon av signaler med autoradiografi film (Amersham).

RT-PCR og real-time kvantitativ RT-PCR

Total RNA ble isolert med RNeasy Mini Kit (Qiagen Inc., Valencia, CA). Den reverse transkripsjonsreaksjoner ble utført med Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit (Roche, Indianapolis, IN). PCR primere for cyclin D1, ETS1, MMP-9 og β-aktin ble designet av Premier Primer 5.0-programvaren (tabell S2). RT-PCR ble utført som tidligere beskrevet [44]. Real-time kvantitativ RT-PCR med SYBR Grønn PCR Master Mix (Applied Biosystems, Foster City, CA) ble utført ved hjelp av ABI Prism 7700 Sequence Detector (Applied Biosystems). De fluorescerende signalene ble samlet inn under forlengelse, ble Ct-verdier på prøvene beregnet, og transkripsjonsnivåer av cyclin D1, ETS1 og MMP-9 ble normalisert til de av β-actin av 2 ^{-ΔΔCt metode.}

Kvantifisering av MIR-9 uttrykk

nivåene av modne MIR-9 i primær vev og cellelinjer ble bestemt med Bulge-Loop ™ mirnas qPCR Primer Set (RiboBio Co Ltd, Guangzhou, Kina). Etter cDNA ble syntetisert med en miRNA-spesifikk stem-loop primer, ble den kvantitative PCR utført med de spesifikke primere (tabell S2). Mir-9 nivåer ble normalisert til de av U6 snRNA.

miRNA mål prediksjon

miRNA mål ble spådd ved hjelp av algoritmer Miranda, miRDB, RNA22, og Targetscan [45]. For å identifisere gener som vanligvis spådd av fire forskjellige algoritmer, ble resultatene av predikerte mål krysses ved hjelp miRWalk [46].

Cell kultur og transfeksjon

Menneskelige mage kreft cellelinjer (SGC-7901 og MKN-74) og SV40-transformert, normal og ikke-tumorigene mage epitelceller GES-1 celler [20] ble oppnådd fra Type Culture Collection of Chinese Academy of Sciences (Shanghai, Kina). Human magekreft cellelinje AGS (CRL-1739) ble anskaffet fra American Type Culture Collection (Rockville, MD). Celler ble dyrket i RPMI1640-medium (Life Technologies, Inc., Gaithersburg, MD) supplert med 10% føtalt bovint serum (Life Technologies, Inc.), penicillin (100 U /ml) og streptomycin (100 ug /ml). Celler ble opprettholdt ved 37 ° C i en fuktet atmosfære av 5% CO _2.

• PLoS ONE: Sammenhengen mellom reduksjon av plasma adiponectin nivåer og risikoen for bakteriell infeksjon etter Gastric Cancer Surgery
• PLoS ONE: Uttrykk for AFP og STAT3 er involvert i Arsenikk apoptose og hemming av spredning i AFP-produserende Gastric Cancer Cells