PLoS ONE: mikrornk-9 Smanjuje proliferaciju, invaziju i metastaziranje želučane stanica raka kroz ciljanje Ciklin D1 i Ets1

Sažetak pregled

Nedavni dokazi pokazuju da je izmijenjen mikrornk-9 (Mir-9) izraz je uključen u napredovanje raka želuca. Međutim, točan uloge i temeljni mehanizmi Mir-9 u proliferaciji, invaziju i metastaziranje karcinoma želuca i dalje ostaju nepoznati. U ovom istraživanju, Mir-9 je pokazao kako je dolje regulira i obrnuto koreliraju s izrazom ciklina D1 i v-ETS erythroblastosis virusa E26 onkogena homologa 1 (Ets1) u želučanom tkivu raka i staničnim linijama. Bioinformatika analiza pokazala je pretpostavljena Mir-9 veznih mjesta u 3'-neprevedenih regija (3'-UTR) za ciklina D1 i Ets1 mRNA. Ektopijska ekspresija ili obaranje Mir-9 rezultirala responsively promijenjena ekspresija ciklina D1, Ets1 i njihovih nizvodnih mete fosforiliran retinoblastom i matriks metaloproteinaze 9 u kultiviranim želučanim staničnim linijama raka SGC-7901 i AGS. U reporterskog sustava miR-9 direktno ciljanih 3'-UTR ciklina D1 i Ets1, a ti učinci su ukinuti mutacijom Mir-9 mjesta vezanja. Prekomjerna ekspresija Mir-9 potisnuti proliferaciju, invaziju i metastaziranje SGC-7901 i AGS stanice in vitro
i in vivo pregled. Obnova Mir-9-posredovane down-regulacije ciklina D1 i Ets1 prolaznom transfekcijom, spasio stanice raka iz smanjenja proliferaciju, migraciju i invaziju. Nadalje, anti-Mir-9 inhibitor promovirao proliferaciju, migraciju i invaziju želučanih stanica raka, a rušeći ciklina D1 ili Ets1 djelomično phenocopied učinke Mir-9 nad-izražavanja. Ovi podaci ukazuju na to da Mir-9 potiskuje ekspresiju ciklina D1 i Ets1 preko veznih u svom 3'-UTR, čime se inhibira proliferaciju, invaziju i metastaziranje raka želuca pregled

Izvor:. Zheng L, Qi T, Yang D, Qi M Li D, Xiang X, et al. (2013) mikrornk-9 potiskuje proliferaciju, invaziju i metastaziranje želučane stanica raka kroz ciljanje Ciklin D1 i Ets1. PLoS ONE 8 (1): e55719. doi: 10,1371 /journal.pone.0055719 pregled

Urednik: Alejandro H. Corvalan, Pontificia Universidad Catolica de Chile, Čile pregled

Primljeno: 14. rujna 2012; Prihvaćeno: 29. prosinca 2012; Objavljeno: 31 siječanj 2013 pregled

Copyright: © 2013 Zheng i sur. Ovo je otvorenog pristupa članak distribuirati pod uvjetima Creative Commons Imenovanje License, koja omogućuje neograničeno korištenje, distribuciju i reprodukciju u bilo kojem mediju, pod uvjetom da je izvorni autor i izvor su zaslužan

financiranja. Supported by Nacionalna zaklada prirodne znanosti Kine (br 30600278, broj 30772359, broj 81071997, broj 81072073, broj 81272779), program za novo stoljeće odlične talente na Sveučilištu (NCET-06-0641), znanstveno-istraživačkog zaklada za Vraćeno prekomorskih kineskih znanstvenika (2008-889), a temeljna istraživanja sredstva za središnji sveučilišta (2012QN224). U financijeri nisu imali ulogu u studiju dizajna, prikupljanja i analize podataka, Odluka o objavi, ili pripremu rukopisa pregled

U konkurenciji interese.. Autori su izjavili da ne postoje suprotstavljeni interesi pregled

Uvod pregled

rak želuca je četvrti najčešći rak u svijetu [1]. Unatoč poboljšanju u kirurškim i multimodalni terapije, prognoza za uznapredovali rak želuca i dalje ostaje siromašan zbog recidiva, invaziju i metastaziranje, sa stopom preživljavanja od 5 godina ispod 30% [1]. Bolje poznavanje mehanizama u podlozi tumorski je zajamčen otkriti nove paradigme za dijagnosticiranje i liječenje karcinoma želuca [2]. MikroRNA (miRNAs), nedavno identificiran kategoriji malih i visoko konzervirane nekodirajuće RNA, mogu sudjelovati u post-regulaciji transkripcije gena kroz djelomičnu komplementarni vezivanje s 3 'neprevedenih regija (3'-UTRs) od ciljne mRNA, što rezultira translacijska represija ili mRNA degradacije [3]. Sve je više dokaza pokazuje da miRNAs uključeni u biološke procese koji se odnose na apoptoze, proliferacije, diferencijacije, invaziju i metastaziranje, a deregulacija koje je ključno za početak i napredovanja raka. [3] To je trenutno hitno istražiti uloge miRNAs i njihovih ciljnih gena u progresiju tumora po eksperimentalnim modelima. Pregled

U ljudskoj raka želuca, broj miRNAs su izvijestili da su se neprirodno pretjerano izražen ili dolje-regulira vrijeme napredovanje karcinoma želuca, uključujući i Mir-21 [4], Mir-15b [5], Mir-16 [5] i Mir-101 [6]. Ove miRNAs igrati onkogene ili tumorskih potiskuju uloge u regulaciji staničnog rasta, migracije i invazije potiskujući svoje ciljne gene. Na primjer, onkogeni miR-21 je nenormalno prekomjerno eksprimiran kod raka želuca, te pospješuje proliferaciju i invazivnost stanica želuca raka ciljajući reverzije inducira cistein-bogatih proteina s Kazal motivima [4]. U međuvremenu, Mir-15b i Mir-16 su dolje regulirano kod raka želuca, te doprinijeti lijekove otpornost želučanih stanica raka modulacijom apoptoze putem ciljanja B-stanica leukemije /limfoma 2 [5]. Mir-101 je podregulirao u želučanom raka tkiva i stanične linije, a ektopijska ekspresija Mir-101 značajno inhibira proliferaciju, migraciju i invaziju stanica želuca raka ciljajući pojačivač zeste homologa 2, citokroma c oksidaze podjedinica II i mijeloidne stanica leukemije slijed 1 [6]. Dakle, to je bio fokus na daljnje istraživanje ekspresiju i funkciju Mirne u biologiji tumora raka želuca. Pregled

mikrornk-9 (Mir-9) prvi put je identificiran kao jedan od ključnih regulatora za razvoj , fiziologija i patologija živčanog sustava u nekoliko organizama, uključujući i Drosophila
, zebraste ribice i sisavaca [7] - [9]. Niz naknadnim studije su pokazale da izmijenjen miR-9 ekspresija je povezana s razvojem i napredovanjem raka [10] - [14]. Prethodne studije pokazuju da Mir-9 je značajno pale regulirano kod raka želuca, što znači svoje potencijalne uloge u progresiju tumora [15] - [18]. Također je navedeno da je Mir-9 može modulirati proliferaciju stanica želuca raka putem ciljanja repne tipa homeobox 2 (CdX2) [19] i NF-kappa B (NF-kB) [16]. Međutim, točan funkcija i temeljni mehanizmi Mir-9 u progresiji karcinoma želuca i dalje opravdavaju daljnje istraživanje. U ovom istraživanju, pokazali smo, po prvi put, da Mir-9 izravno cilja ciklin D1 i v-ETS erythroblastosis virus E26 onkogcni homologa 1 (Ets1) i potiskuje proliferaciju, invaziju i metastaziranje želučanih stanica raka u vitro pregled i in vivo pregled.

Rezultati

mir-9 je regulirati na dolje i obrnuto koreliraju s izrazom ciklina D1 i Ets1 u želučanog tkiva raka i stanične linije

Kako istražiti izražaj mir-9 kod raka želuca, želučane tkiva raka i susjedne ne-neoplastičnim sluznice prikupljeni su od 86 primarnih slučajeva. Real-time kvantitativne PCR reverzne transkripcije (RT-PCR) otkrila je da miR-9 podregulirani u želučanom tkivu karcinoma nego u susjednim ne-neoplastičnog sluznice ( P pregled = 0,001, sl. 1). Mir-9 ekspresija bila je značajno niža u slučajevima raka želuca s dubljim zida invazije želuca ( P izvoznici < 0,001), limfni čvor metastaze ( P izvoznici < 0,001), udaljena metastaza ( P pregled = 0,022), a napredni TNM stadij ( P pregled = 0,01) (Tablica S1). Nasuprot tome, veći ciklin D1 i Ets1 razine prijepis otkrivene su u želučanom tkivu karcinoma ( P izvoznici < 0,0001 i P pregled. ≪. 0.0001, odnosno, Slika 1B i sl 1C). Došlo je do inverzna korelacija između Mir-9 izražavanja i ciklin D1 razine prijepisa u želučanim tkiva raka ( P pregled. ≪ 0,001, Slika 1D). Osim toga, inverzna korelacija između Mir-9 izražavanja i Ets1 razine prijepisa je također navedeno u ovim tkivima oboljelih od raka ( P pregled. ≪ 0,001, Slika 1 E). Donja Mir-9 ekspresija i višim razinama transkript ciklina D1 i Ets1 su kod želučanih staničnim linijama karcinoma od onih u normalnim želučanog epitela GES-1 stanica [20] (Sl. 1F). Imunokemijsko bojenje je izveden da bi se pratilo ekspresiju ciklina D1 i Ets1 ovih uzoraka raka (Sl. S1). Nuklearna ciklin D1 zabilježen je u 26/86 (30,2%) slučajeva, dok su nuklearna i citoplazmi bojenje Ets1 zabilježeno je u 58/86 (67,4%) slučajeva (Tablica S1). Imunoreaktivnost ciklina D1 i Ets1 bila je značajno viša u slučajevima raka želuca s dubljim želučane stijenke invaziji ( P izvoznici < 0,001 i P pregled = 0,001), limfnih čvorova metastaze ( P izvoznici < 0,001 i P izvoznici < 0,001), udaljena metastaza ( P izvoznici < 0,001 i P izvoznici < 0,001), a napredni TNM stadij ( P izvoznici < 0,001 i P pregled = 0,004) (Tablica S1). Donja Mir-9 ekspresija je uočena u želučanim tkiva raka s višim imunološko ciklina D1 ( P izvoznici < 0,0001, sl 1G.) Ili Ets1 ( P pregled. ≪ 0,0001, slika 1 H ). Ovi rezultati pokazuju da Mir-9 je regulirati na dolje i obrnuto korelira s ekspresijom ciklina D1 i Ets1 u želučanog tkiva raka i staničnim linijama. Pregled

Mir-9 dolje regulira ekspresiju ciklina D1 i Ets1 putem pošte -transcriptional represija pregled

da bi se ispitala hipoteza da mir-9 može utjecati na ekspresiju ciklina D1 i Ets1 kod raka želuca, računalna predviđanja obavljena je Mirna bazama podataka. Potencijalni vezna mjesta Mir-9 s visokim komplementarnosti su zabilježeni u bazi 2974-2995 od ciklina D1 3'-UTR i 2648-2670 od Ets1 3'-UTR (sl. 2a). Da bi istražili izravnih učinaka Mir-9 na ekspresiju ciklina D1 i Ets1 u želučanih stanica raka, proveli smo Mirne prekomjerna ekspresija eksperimente. Stabilna transfekcija Mir-9 prekursora u SGC-7901 i AGS stanica rezultirala povećanjem Mir-9 razina (sl. S2). Western blot, RT-PCR i real-time kvantitativne RT-PCR je pokazao da prekomjerna ekspresija Mir-9 dovodi do smanjene proteina i transkripcijske razine ciklina D1 i Ets1 u želuca stanica karcinoma nego oni transficirane s negativnim kontrolnim vektorom (mock) ( Sl. 2B, sl. 2C, i sl. 2D). Pored toga, razina fosforiliranog retinoblastom (PRB, silazni efektor ciklina D1) [21] i matričnih metaloproteinaza 9 (MMP-9, silazni gen Ets1) [22] su umanjeni u Mir-9 nad-ekspresiju stanica raka (Sl. 2B, sl. 2C, i sl. 2D). Dalje ispitati supresijske ulogu Mir-9 u ekspresiji ciklina D1 i Ets1, izveli smo eksperimente obaranje miR-9 transfekcijom anti-Mir-9 ili negativna kontrola (anti-NC) inhibitori u GES-1, SGC -7901 i AGS stanice. Transfekcija anti-miR-9 inhibitora očito manja endogene miR-9 ekspresija (sl. S3A) i povišeni razina proteina ciklina D1, pRb, Ets1 i MMP-9 koji nisu transficirane s anti-NC (Sl. 2E i Sl. S4A). Real-time kvantitativne RT-PCR analiza je pokazala povećanu razinu transkript ciklina D1, Ets1 i MMP-9 u uzgojenim stanicama transfeciranim s anti-miR-9 inhibitora, u usporedbi s onima koji su transficirane s anti-NC (Sl. 2F i sl. S4B). Sveukupno, ovi rezultati su pokazali da je Mir-9 značajno inhibira ekspresiju ciklina D1 i Ets1 kroz post-potiskivanjem transkripcije. Pregled

Mir-9 izravno ciljane ciklin D1 i Ets1 u želučanim stanicama raka pregled

Da utvrditi da li miR-9 može potisnuti ekspresiju ciklina D1 i Ets1 ciljanjem na vezna mjesta na 3'-UTR, PCR produkti sadržavaju intaktne ciljna mjesta ili mutaciju miR-9 sjeme sekvence prepoznavanja (Sl. 3A) su umetnuti u luciferazni reporter vektor. Plazmidi su transfecirani u stanice raka želuca stabilno transfektiranih s negativnim kontrolnim vektorom (tobožnji) ili miR-9 prekursora. Renilla pregled aktivnosti luciferaze normalizirane onima krijesnice su značajno smanjeni u SGC-7901 i AGS stanice stabilno transficirane Mir-9 prekursora (Sl. 3B), a ti učinci ukinute su mutacijom navodni Mir-9 veznih mjesta unutar 3 'UTR ciklina D1 i Ets1 (sl. 3b). Osim toga, obaranje Mir-9 s anti-Mir-9 inhibitora povećana luciferaze aktivnosti GES-1, SGC-7901 i AGS stanice (Sl. 3C i sl. S4C), dok je mutacija Mir-9 prepoznavanja stranice ukinuti ove efekte (Sl. 3C i sl. S4C). Ovi rezultati pokazuju da Mir-9 izravno i posebno u interakciji s ciljnim mjestima u 3'-UTR ciklina D1 i Ets1. Pregled

Mir-9 potisnut in vitro pregled širenja raka želuca stanice kroz ciljanje ciklin D1

od gore dokazi su pokazali da miR-9 inhibira ekspresiju ciklin D1, i kombiniranje činjenice da ciklin D1 ima ključnu ulogu u napredovanju staničnog ciklusa i proliferaciju stanica raka [21], smo dodatno istražili učinke Mir-9 prekomjerna ekspresija i ciljnih gena obnove na uzgojenim stanicama raka želuca. Western blot i real-time kvantitativne RT-PCR pokazuju da transfekcija ciklina D1, ali ne Ets1, spasili Mir-9 inducirane podreguliranje ciklina D1 (Sl. 4A a Sl. 4B). U analizi formiranja kolonija, Mir-9 prekomjerna ekspresija prigušuje rast SGC-7901 i AGS stanica, u usporedbi s onima koji su transficirane s negativnim kontrolnim vektorom (oponašanje) (Sl. 4C). Protočna citometrija naznačeno da Mir-9 prekomjerna ekspresija izazvanog staničnog ciklusa u G _{0 /G 1 faza u SGC-7901 i AGS stanica (Sl. 4d). Osim toga, transfekcii ciklina D1, ali ne i Ets1, u SGC-7901 i AGS stanica obnovljena uhićenje inhibicije proliferacije i staničnog ciklusa izazvano prekomjerna ekspresija Mir-9 (Sl. 4C i sl. 4D). S druge strane, ispitali smo učinke miR-9 obaranje na GES-1, SGC-7901 i AGS stanice. Uvođenje anti-Mir-9 inhibitora u ovih stanica rezultirala poboljšanim sposobnosti u proliferaciji (Sl. S3B) i napredovanja staničnog ciklusa (Sl. S3C). Ovi rezultati pokazuju da Mir-9 značajno potisnuti In vitro pregled proliferacija i progresiju staničnog ciklusa od želučanih stanica raka kroz ciljanje ciklina D1. Pregled}

Mir-9 oslabljena in vitro
migracija i invazija želučanih stanica raka kroz ciljanje Ets1

od prethodne studije ukazuju na važne uloge Ets1 u invaziju i metastaziranje stanica raka [23], [24], što dodatno istražiti učinke miR- 9 prekomjerna ekspresija i ciljnih gena obnove na migracije i invazije karcinoma želuca SGC-7901 i AGS stanica. Western blot i real-time kvantitativne RT-PCR ukazuju da transfekciji Ets1, ali ne i ciklina D1, spasili Mir-9 inducirane podreguliranje Ets1 (Sl. 5A i Sl. 5B). U bunara testa migracije, želučanih stanica raka stabilno transficirane Mir-9 prethodnik predstavljen oslabljenu migracija kapacitet od onih transfecirane negativni kontrolni vektor (oponašanje) (Sl. 5C). U invaziju u Matrigel testu, Mir-9 prekomjerna ekspresija prigušuje invazivnosti SGC-7901 i AGS stanica (Sl. 5D). Osim toga, transfekcija Ets1, ali ne i ciklina D1, u sGC 7901 i staničnim linijama AGS obnovio miR 9- meditaed inhibicije na migraciju i invaziju (Sl. 5C i 5D sl.). Nadalje, ispitali smo učinke miR-9 obaranje na GES-1, SGC-7901 i AGS stanice. Transformacija anti-Mir-9 inhibitora rezultiralo poboljšanom migracije i invazije tih stanica (Sl. S3D i sl. S3E). Ovi rezultati pokazuju da Mir-9 značajno oslabljena In vitro pregled migracija i invazija želučanih stanica raka kroz ciljanje Ets1. Pregled

Mir-9 prigušuje rast i metastaziranje želučanih stanica raka in vivo

sljedeći ispituje učinkovitost Mir-9 protiv rasta tumora i metastaza in vivo pregled. Stabilna transfekcija miR-9 prekursora u SGC-7901 ili AGS stanica rezultirala smanjenjem rasta i težinu subkutane tumora u atimičnih golih miševa, u usporedbi s onima koje su postojano transficirane s negativnim kontrolnim vektorom (tobožnji) (Sl. 6A i Sl. 6B ). Štoviše, ekspresija ciklina D1, Ets1 i nizvodno MMP-9 je smanjen za stabilne transfekcije Mir-9 prekursora (sl. 6C), Prosječna gustoća Posuda CD31-pozitivnih je reduciran u tumora nastalog injekcijom tumorskih stanica koje su stabilno transficirane s miR-9 prekursor (Sl. 6D). U eksperimentalnim istraživanjima metastaza, SGC-7901 ili AGS stanice stabilno transficirane miR-9 prekursora utvrđene statistički manje plućnih metastatskih kolonija nego oponašanje skupini (Sl. 6e). Ovi rezultati sugeriraju da miR-9 inhibirali su rast i metastaziranje stanica raka želučanog in vivo pregled. Pregled

obaranje ciklina D1 i Ets1 phenocopied miR-9 prekomjerna ekspresija posreduje u inhibiciji na proliferaciju , migracija i invazija želučanih stanica raka In vitro

s obzirom da gore navedeni rezultati ukazuju na negativnu regulaciju ciklina D1 i Ets1 izražavanja Mir-9, pretpostavili smo da je obaranje ciklina D1 i Ets1 možda pokazuju slične učinke na kultiviranim stanicama raka želuca. Mali smetaju RNA (siRNA) ciljaju na regiju kodiranja ciklin D1 i Ets1, SI-CCND1 i SI-Ets1, su dizajnirani i transficirana u SGC-7901 i AGS stanica. Transfekcija Si-CCND1 i SI-Ets1 dovodi do smanjene ekspresije ciklina D1, pRb, Ets1 i MMP-9 u želučanim stanicama raka, odnosno, u usporedbi s onima koji su transficirane s jagmiti siRNA (Si-SCB) (Sl. 7A, Sl , 7D i sl. S5). Obaranje ciklina D1 potisnuti proliferaciju i potaknulo staničnog ciklusa u G _{0 /G 1 faza u SGC-7901 i AGS stanice (Sl. 7B i sl. 7c). Osim toga, obaranje Ets1 u SGC-7901 i AGS stanicama dovodi do smanjene sposobnosti migracije i invazije (Sl. 7E i sl. 7F). Ovi rezultati sugeriraju da je obaranje ciklina D1 i Ets1 phenocopied (posjeduju slične fenotipova do) Mir-9 povećanom ekspresijom u inhibira proliferaciju, migraciju i invaziju želučanih stanica raka in vitro pregled. Pregled}

Rasprava pregled

to je dobro utvrđeno da je Mir-9 izraz profil na rak ovisi o raspodjeli tkiva. U primarnim tumorima mozga, Mir-9 je povišena i funkcionira kao bitnog čimbenika u neuronske karcinogeneze [10]. miR-9 je prekomjerno ekspresivan kod karcinoma cerviksa [11], što ukazuje na njegovu ulogu u tumor promoter razvoju tumora i napredovanja. Međutim, miR-9 podregulirani u višestrukim oblicima raka, uključujući rak gušterače [12], raka jajnika [13] i rak debelog crijeva [14], a povezan je s malignim napredovanja raka dojke [25] i rak debelog crijeva ( 14). Luo i sur. Pregled, istaknuo-naniže Mir-9 u 24 želučanih uzoraka raka [15], što je kasnije potvrdio u 9 [16], 72 [17], a 13 [18] raka želuca slučajeva. Međutim, Inoue i sur. Pregled, izvijestio je povećanje ekspresije Mir-9 u 5 bolesnika s rakom želuca u realnom vremenu PCR-based Mirna polja [26], a ovaj drugačiji nalaz u Mir-9 ekspresije profila mogu biti posljedica na heterogenost ograničenih uzoraka. U ovom istraživanju, pokazali smo da je Mir-9 je značajno pale regulirano u 86 osnovnih uzoraka raka želuca nego u susjednim ne-maligne tkivima, što je u skladu s ranijim nalazima [15] - [18]. Važno je, također potvrđuju da je Mir-9 izraz obrnuto povezana s kliničkim fazama, invaziju i metastaziranje raka želuca. Kod ljudi, zreli Mir-9 je kodiran tri nezavisne genima, Mir-9-1, Mir-9-2 i Mir-9-3, locirati na kromosomima 1, 5 i 15, odnosno u [27]. Prethodna istraživanja ukazuju da podregulira miR-9 ekspresija u karcinomu želuca zbog aberantnog Hipermetilacija od promotorske regije miR-9 genima [17]. Slično tome, aberantna Hipermetilacija Mir-9 obitelji gena također je u nekih primarnih tumora limfnih čvorova metastaze, kao što su rak debelog crijeva, rak pluća, rak dojke, melanom i [14], [28]. Važno je napomenuti da je istraživanje izvijestio inverzni korelaciju između razine Mir-9 i ekspresije ciklina D1 i Ets1 u želučanog tkiva raka, što znači da ciklin D1 i Ets1 može negativno reguliran Mir-9.

funkciju i ciljne gene Mir-9 su tumorski specifični i ovise o kontekstu stanice. miR-9 može potisnuti ekspresiju E-kadherina u karcinomu dojke [29], što je rezultiralo u nuklearne translokacije P-katenina i njegovo vezivanje s faktora transkripcije faktor T-stanica /limfnog faktor poboljšivači 1, i zatim doregulirani transkripciju gena koji omogućuju povećanje broja stanica i angiogenezu [29]. Prisilna Mir-9 ekspresija u stanicama raka dojke također rezultira značajnim izrazom promjena više gena p53 vezane apoptoze [30]. Kroz izravno ciljanje NF-kB, izvanmaternične izražavanja Mir-9 inhibira In vitro pregled i in vivo pregled rast stanica jajnika [31] i na rast i metastaziranje melanoma [32] , U neuroblatoma, prekomjerna ekspresija Mir-9 inhibira invaziju, metastaze i angiogenezu tumorskih stanica kroz ciljanja matrične metaloproteinaze, 14 [33]. Wan i sur. Pregled, izvijestio je da prekomjerna ekspresija Mir-9 inhibirana In vitro pregled i in vivo pregled rast želuca adenokarcinom stanične linije MGC803 kroz potiskujući NF-kB na razini nakon transkripcije [16]. Ipak, u nedavnom istraživanju, Rotkrua i sur. Pregled pokazuje da je Mir-9 može biti uključen u želučanoj karcinogeneze kroz niz regulaciju CdX2 i obaranje Mir-9 smanjena In vitro pregled proliferacija raka želuca MKN-45 stanica [19], a njihovi nalazi treba biti dodatno ojačana Mir-9 prekomjerna ekspresija spašavanja ciljnih gena i in vivo
studije. Osim toga, to je sada kontroverzni li CdX2 ima onkogena ili suzbijanje tumora ulogu u želučanom karcinogeneze [34], [35]. Osim toga, potencijalni uloge Mir-9 u invaziju i metastaziranje raka želuca nisu do sada razjašnjen. Dakle, funkcija i izravni ciljevi Mir-9 u rak želuca naloga daljnje istrage. Pregled

U ovom istraživanju, pokazali smo da prekomjerna ekspresija Mir-9 prigušuje proliferaciju, migraciju i invaziju želučanih stanica raka, koja je slična onoj ciklina D1 i Ets1 obaranje, što upućuje na potencijalnu primjenu Mir-9 kao cilja za terapeutika raka želuca. Osim toga, naši podaci potvrdili su da Mir-9 izravno ciljane ciklin D1 i Ets1 u želučanim stanicama raka kroz 3'-UTR luciferaze reporter testu. Od nedavna istraživanja pokazuju da određene miRNAs alternativno može modulirati ekspresiju gena u interakciji s promotorima [36] - [38], potencijalne uloge Mir-9 u regulaciji transkripcije ciklina D1 i Ets1 kroz interakciju s promotorima i dalje nejasni i jamči naš daljnji istraga. Ciklin D1 je proto-onkogena koji pripada porodici G _{1 ciklina, i igra važnu ulogu u staničnom ciklusu G 1 do S prijelaza vezivanjem svojih partnera ciklinu ovisna kinaza 4 i 6 do fosforiliraju i inaktivira RB protein [21]. Prekomjerna ekspresija ciklina D1 je rani događaj u procesu karcinogeneze u ljudskim debelog crijeva, jednjaka i žučni mjehur raka [39], te je prognostički pokazatelj povezana s lošim opstanak u jednjaka, dojke i mokraćnog raka [39]. Ciklin D1 povećanom ekspresijom u humanim karcinomima ilustriran više mehanizama, uključujući genomske izmjene, poslije regulaciji transkripcije i post-translacijske stabilizaciju proteina [39]. Nedavna istraživanja pokazuju da Mir-16-1 potiskuje ciklin izraz D1 na post-razini transkripcije putem vezanja svoj 3'-UTR u limfom stanica plašta [40]. U trenutnoj studiji, naši rezultati su pokazali da Mir-9-posredovane inhibicije na progresije staničnog ciklusa i stanične proliferacije je spasio obnovu ciklina izražavanja D1 u želučanih stanica raka, što upućuje da je identifikacija ciklina D1 kao ciljni gen Mir-9, može objasniti, barem djelomično, zbog povećane ekspresije Mir-9 potisnuti proliferaciju stanica želuca raka. pregled}

Ets1, član ETS obitelj transkripcijskih faktora, veže na specifične DNA sekvence koje sadrže GGAA /T motiva jezgra [22], te sudjeluje u tumorskoj invaziji i metastaziranju kroz regulaciji transkripcije nekoliko gena odgovornih za remodeliranja ekstracelularnog matriksa, migracija i invazija, kao matrične metaloproteinaze i urokinaza plazminogen aktivatora [22]. Do sada, sve veći broj kliničkih ispitivanja pokazali su važne uloge Ets1 u razvoju tumora i progresiju raznih solidnih tumora [23], [24]. Prethodna istraživanja pokazuju da Ets1 izraz se odnosi na klinikopatološkim značajke raka želuca, uključujući tumor infiltriranje i limfnih čvorova ili distalnom metastaza, sugerirajući njegov kritičnu ulogu u invaziji i metastaziranju raka želučanog [41]. Međutim, mehanizmi kojima se temelji Ets1 povećanom ekspresijom u rak želuca i dalje ostaje nepoznanica. Nedavne studije otkrivaju nakon regulaciji transkripcije Ets1 po Mir-125b u stanicama raka dojke [42], a Mir-200B u endotelnim stanicama [43]. U ovom istraživanju, pokazali smo da kao izravna meta Mir-9, Ets1 je viša u rak želuca i pridonijela migracija i invazije stanica raka. Obaranje Ets1 djelomično phenocopied učinke Mir-9 povećanom ekspresijom u želučanom staničnim linijama karcinoma, dok je obnova Ets1 izražavanja spasio stanice raka iz inhibicije Mir-9-posredovane na migracije i invazije, otkrivajući novi post-transkripcijski mehanizam regulacije od Ets1 strane Mir-9 i njenih kliničkih potencijala u raka želuca. pregled

Ukratko, pokazali smo, po prvi put, da Mir-9 potiskuje ekspresiju ciklina D1 i Ets1 kroz izravno ciljanje svoje 3 ' UTR, čime se inhibira proliferaciju, invaziju i metastaziranje želučanih stanica raka. Ovo istraživanje proširuje naše znanje o regulaciji ciklina D1 i Ets1 na post-razini transkripcije Mirne, te predlaže da se Mir-9 može biti od potencijalnih vrijednosti kao novi terapijski cilj za rak želuca. Pregled

Materijali i Metode pregled

uzorcima bolesnika tkiva

Odobrenje za provođenje ovog istraživanja bio je dobiti od Institutional Review Board of Tongji Medical College (broj odobrenja: 2010-S003). Parafin-ugrađen i svježe uzorke 86 primarnih slučajeva raka želuca dobiveni su iz Odjela za kirurgiju bolnice Unije Tongji Medical College. Njihova patološka dijagnoza je pokazao najmanje dva patologa. Demografske i kliničkopatološkim podaci svih pacijenata sažeti su u tablici S1. Susjedna želučane sluznice koji ne sadrže makroskopski tumor također je dobiven i ne-maligne područja su kasnije potvrdili mikroskopskom histologiju. Svježe uzorci tumora susjedni ne-neoplastičnih sluznicu se prikupe i pohrane na -80 ° C do upotrebe. Pregled

Imunohistokemija pregled

Imunokemijsko bojenje je izveden kako je prethodno opisano [44], a antitijela specifična ciklin D1, Ets1, MMP-9 i CD31 (Abcam Inc, Cambridge, MA, 1: 200 razrjeđenja). Negativne kontrole su uključivale paralelne dijelove tretirane izostavljanje primarnog antitijela, osim susjednog presjek istog bloka u kojem se primarno antitijelo zamijenjeni zečjim poliklonskim IgG (Abcam Inc) kao izotipske kontrole. Stupanj Reaktivnost je određena najmanje dva patologa bez poznavanja klinikopatološkim obilježja tumora. Stupanj pozitivnosti je u početku klasificirana prema postotku pozitivnih tumorskih stanica kao i sljedeće: (-) < 5% stanica pozitivno, (1+) 6-25% pozitivnih stanica, (2+) 26-50% stanica pozitivno i (3 +) > 50% stanica pozitivno. Slajdovi sa umjerena pozitivna (2+) ili snažan pozitivan (3+) reaktivnosti su klasificirana kao da ima "high izraz", dok su slajdova s ​​negativnim (-) ili slaboj pozitivnoj (1+) reaktivnost su klasificirane kao da ima "nisku izraz" . pregled

Western blot pregled

stanični protein se ekstrahira s 1 x puferom za lizu stanica (Promega, Madison, WI). Protein (50 ug) od svakog uzorka se podvrgne 4-20% predfabriciranog poliakrilamidnom gelu (Bio-Rad, Hercules, CA) elektroforezom i transferirana na nitrocelulozne membrane (Bio-Rad). Za ciklina D1, Ets1, MMP-9, pRB i β-aktin (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) otkrivanje, primarni razrjeđenja antitijela je 1:500, 1:500, 1:500, 1:500 i 1: 1000, nakon čega slijede 1:3000 razrjeđivanjem kozjeg anti-zečjeg peroksidaza-obilježenog antitijela (Bio-Rad). Hemiluminiscencija supstrata kita (Amersham, Piscataway, NJ) je korištena za detekciju chemiluminscent signala s autoradiografijom filmom (Amersham). Pregled

RT-PCR u realnom vremenu i kvantitativni RT-PCR pregled

Ukupni RNA je izolirana sa Rneasy Mini Kit (Qiagen Inc., Valencia, CA). Na naličju reakcije transkripcije su provedena uz Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit (Roche, Indianapolis, IN). PCR primeri za ciklin D1, Ets1, MMP-9 i p-aktin su dizajnirani prema Premier Primer 5.0 softvera (Tablica S2). RT-PCR je izveden kako je prethodno opisano [44]. U stvarnom vremenu kvantitativni RT-PCR s SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems, Foster City, CA) je izvedena pomoću ABI Prism 7700 Sequence detektor (Applied Biosystems). Fluorescentne Signali su se sakupljali u produženju faze Ct vrijednosti uzoraka su izračunate, te je razina transkript ciklina D1, Ets1 i MMP-9 su normalizirane na one od P-aktin za 2 ^{-ΔΔCt metodom. Pregled}

Kvantifikacija Mir-9 izražavanja pregled

razine zrelim Mir-9 u osnovnoj tkiva i stanične linije su određena pomoću oticati petlje ™ miRNAs qPCR prajmera (RiboBio Co Ltd, Guangzhou, Kina). Nakon cDNA sintetiziran stem petlje primera Mirni specifičnih za kvantitativni PCR je proveden pomoću specifičnih primera (Tablica S2). Razine Mir-9 su normalizirani na one U6 snRNA.

Mirna meta predviđanje pregled

Mirna ciljevi su predviđeni korištenjem algoritama Miranda, miRDB, RNA22 i Targetscan [45]. Da biste identificirali gene obično predviđene četiri različite algoritme, rezultati predviđeni ciljevi su presječen pomoću miRWalk [46]. Pregled

kultura stanica i transfekcija pregled

Ljudska stanične linije raka želučani (SGC-7901 i MKN-74) i SV40-transformiraju, normalna i ne-Tumorigenske želučane epitelne GES-1 stanice [20] dobiveni su iz Type Culture Collection kineske akademije znanosti (Shanghai, Kina). Ljudskog raka želuca stanična linija AGS (CRL-1739) kupljena je oblik American Type Culture Collection (Rockville, MD). Stanice su uzgajane u RPMI1640 mediju (Life Technologies, Inc., Gaithersburg, MD), uz dodatak 10% fetalnog goveđeg seruma (Life Technologies, Inc.), penicilinom (100 U /ml) i streptomicina (100 ug /ml). Stanice su održavane na 37 ° C u vlažnoj atmosferi 5% CO _2.

• PLoS ONE: pridruživanju između smanjenju Plazma adiponektina razine i rizik od bakterijske infekcije nakon rak želuca kirurgija
• PLoS ONE: Izražavanje AFP i STAT3 je uključen u arsen trioksid apoptozi i inhibiciju proliferacije AFP-proizvodi Želučani stanica raka