Dati recenti indicano che alterata microRNA-9 (miR-9) espressione è implicato nella progressione del cancro gastrico. Tuttavia, i ruoli precisi e meccanismi sottostanti di miR-9 in proliferazione, invasione e metastasi del cancro gastrico rimangono ancora sconosciuti. In questo studio, miR-9 è risultato essere down-regolato e inversamente correlata con l'espressione della ciclina D1 e v-ets virus erythroblastosis E26 omologo oncogene 1 (ETS1) nei tessuti di cancro gastrico e linee cellulari. L'analisi bioinformatica ha rivelato i putativi miR-9 siti di legame nelle regioni 3'-non tradotte (3'-UTR) di ciclina D1 e ETS1 mRNA. espressione ectopica o atterramento di miR-9 provocato espressione responsively alterata della ciclina D1, ETS1 e loro bersagli a valle retinoblastoma fosforilata e metalloproteinasi della matrice 9 nella coltura di cellule di cancro gastrico linee SGC-7901 e AGS. Nel sistema reporter luciferasi, miR-9 mirati al 3'-UTR della ciclina D1 e ETS1, e questi effetti sono stati aboliti mutando i siti di legame miR-9. Over-espressione di miR-9 soppresso la proliferazione, invasione e metastasi del SGC-7901 e le cellule AGS in vitro Visto:. Zheng L, Qi T, Yang D, Qi M, Li D, Xiang X, et al. (2013) microRNA-9 Sopprime la proliferazione, invasione e metastasi delle cellule cancro gastrico attraverso Targeting ciclina D1 e ETS1. PLoS ONE 8 (1): e55719. doi: 10.1371 /journal.pone.0055719 Editor: Alejandro H. Corvalan, Pontificia Universidad Catolica de Chile, Cile Ricevuto: 14 settembre 2012; Accettato: 29 dicembre 2012; Pubblicato: 31 gen 2013 Copyright: © 2013 Zheng et al. Questo è un articolo ad accesso libero distribuito sotto i termini della Creative Commons Attribution License, che permette l'uso senza restrizioni, la distribuzione e la riproduzione con qualsiasi mezzo, a condizione che l'autore originale e la fonte sono accreditati Finanziamento:. Supportato da la National Science Foundation naturale della Cina (n ° 30.600.278, n ° 30.772.359, n ° 81.071.997, n ° 81.072.073, n ° 81.272.779), Programma per New Century talenti eccellenti in Università (NCET-06-0641), Fondazione di ricerca scientifica per la tornati Overseas Chinese Scholars (2008-889), e fondi di ricerca fondamentale per le università centrali (2012QN224). I finanziatori avevano alcun ruolo nel disegno dello studio, la raccolta e l'analisi dei dati, la decisione di pubblicare, o preparazione del manoscritto Competere interessi:.. Gli autori hanno dichiarato che non esistono interessi in competizione Introduzione cancro gastrico è il quarto cancro più comune al mondo [1]. Nonostante il miglioramento della terapia chirurgica e multimodale, la prognosi del carcinoma gastrico avanzato rimane ancora scarsa a causa della recidiva, invasione e metastasi, con un tasso di sopravvivenza a 5 anni inferiore al 30% [1]. Una migliore conoscenza dei meccanismi alla base progressione del tumore è garantito per scoprire nuovi paradigmi per la diagnosi e il trattamento del cancro gastrico [2]. I microRNA (miRNA), una categoria recentemente identificato di piccole e altamente conservate RNA non codificanti, possono partecipare alla regolazione post-trascrizionale dell'espressione genica attraverso parziale complementare legame con le regioni non tradotte al 3 '(3'-UTR) del mRNA bersaglio, con conseguente degrado repressione o mRNA traslazione [3]. prove emergenti mostra che miRNA sono coinvolti in processi biologici legati alla apoptosi, la proliferazione, la differenziazione, invasione e metastasi, mentre la deregolamentazione dei quali è fondamentale per l'iniziazione e progressione del cancro [3]. Attualmente è urgente di indagare il ruolo dei miRNA e dei loro geni bersaglio nella progressione tumorale da modelli sperimentali. Nel cancro gastrico umano, sono stati riportati un certo numero di miRNA essere aberrante sovra-espressi o down-regolato durante la progressione del cancro gastrico, compresi miR-21 [4], miR-15b [5], miR-16 [5], e miR-101 [6]. Questi miRNA svolgono un ruolo oncogeni o tumore-soppressiva nella regolazione della crescita cellulare, la migrazione e l'invasione reprimendo i loro geni bersaglio. Ad esempio, oncogenici miR-21 è aberrante over-espresso nel cancro gastrico, e migliora la proliferazione e l'invasività delle cellule di cancro gastrico di mira proteine ricche di cisteina reversione che inducono con motivi Kazal [4]. Nel frattempo, miR-15b e miR-16 sono down-regolati nel cancro gastrico, e contribuiscono alla resistenza multidrug di cellule di cancro gastrico attraverso la modulazione dell'apoptosi tramite mira a cellule B leucemia /linfoma a 2 [5]. miR-101 è down-regolato in gastrica tessuti tumorali e linee cellulari, mentre l'espressione ectopica di miR-101 inibisce significativamente la proliferazione, la migrazione e l'invasione delle cellule di cancro gastrico di mira enhancer di omologa zeste 2, citocromo c ossidasi subunità II, e mieloide sequenza di leucemia a cellule 1 [6]. Pertanto, è stato un obiettivo di esplorare ulteriormente l'espressione e la funzione di miRNA nella biologia tumorale del carcinoma gastrico. MicroRNA-9 (miR-9) viene identificato come uno dei regolatori cruciali per lo sviluppo , fisiologia e patologia del sistema nervoso in diversi organismi, tra cui Drosophila Risultati miR-9 era down-regolato e inversamente correlata con l'espressione della ciclina D1 e ETS1 nei tessuti di cancro gastrico e linee cellulari Per studiare l'espressione di miR-9 nel carcinoma gastrico, tessuti di cancro gastrico e della mucosa non neoplastica adiacente sono stati raccolti da 86 casi primari. In tempo reale inversione quantitativa trascrizione PCR (RT-PCR) ha rivelato che miR-9 è stato down-regolato nei tessuti gastrici cancro rispetto che nella mucosa non neoplastica adiacente ( P Per investigare l'ipotesi che miR-9 può influenzare l'espressione della ciclina D1 e ETS1 nel carcinoma gastrico, la previsione di calcolo è stato eseguito dai database di miRNA. I potenziali siti di legame di miR-9 con alta complementarietà sono stati notati nelle basi 2974-2995 della ciclina D1 3'-UTR e 2648-2670 del ETS1 3'-UTR (Fig. 2A). Per studiare gli effetti diretti di miR-9 sulla espressione della ciclina D1 e ETS1 in cellule di cancro gastrico, abbiamo eseguito gli esperimenti miRNA over-espressione. trasfezione stabile di miR-9 precursore in SGC-7901 e le cellule AGS ha provocato aumento di miR-9 livelli (Fig. S2). Western Blot, RT-PCR in tempo reale RT-PCR quantitativa hanno dimostrato che l'eccesso di espressione di miR-9 ha comportato la riduzione di proteine e livelli trascrizionali di ciclina D1 e ETS1 in cellule di cancro gastrico rispetto a quelle transfettate con vettore controllo negativo (finto) ( Fig. 2B, Fig. 2C e Fig. 2D). Inoltre, i livelli di retinoblastoma fosforilata (pRB, un effettore a valle della ciclina D1) [21] e metalloproteinasi della matrice 9 (MMP-9, un gene a valle del ETS1) [22] sono diminuiti in miR-9 oltre che esprimono le cellule tumorali (Fig. 2B, Fig. 2C e Fig. 2D). Per esaminare ulteriormente il ruolo soppressivo di miR-9 nella espressione della ciclina D1 e ETS1, abbiamo eseguito gli esperimenti atterramento miR-9 mediante trasfezione di inibitori controllo negativo (anti-NC) anti-miR-9 o in GES-1, SGC -7901 e AGS cellule. Transfection di anti-miR-9 inibitore ovviamente diminuito il endogena miR-9 espressione (Fig. S3A), e upregulated i livelli di proteina di ciclina D1 PRB, ETS1 e MMP-9 rispetto a quelle transfettate con anti-NC (Fig. 2E e Fig. S4A). Real-time RT-PCR quantitativa analisi ha mostrato i livelli di trascrizione avanzate di ciclina D1, ETS1 e MMP-9 in cellule in coltura trasfettate con anti-miR-9 inibitore, se paragonati a quelli transfettate con l'anti-NC (Fig. 2F e Fig. S4B). Nel complesso, questi risultati hanno dimostrato che miR-9 inibito notevolmente l'espressione della ciclina D1 e ETS1 attraverso la repressione post-trascrizionale. Per determinare se miR-9 potrebbe reprimere l'espressione della ciclina D1 e ETS1 di mira i suoi siti di legame nel 3'-UTR, i prodotti di PCR contenenti siti di destinazione intatte o mutazione del miR-9 sequenze di riconoscimento di semi (Fig. 3A) sono stati inseriti in il vettore giornalista luciferasi. I plasmidi sono state trasfettate in cellule di cancro gastrico stabilmente trasfettate con vettore negativo di controllo (finto) o miR-9 precursore. Il renilla Dato sopra le prove hanno dimostrato che miR-9 inibita l'espressione della ciclina D1, e combinando i fatti che la ciclina D1 svolge un ruolo critico nella progressione del ciclo cellulare e la proliferazione delle cellule tumorali [21], abbiamo studiato ulteriormente gli effetti di miR-9 sovra-espressione e di restauro gene bersaglio su cellule di cancro gastrico in coltura. Western Blot e real-time RT-PCR quantitativa ha indicato che la trasfezione della ciclina D1, ma non di ETS1, salvato il miR-9-indotta down-regulation di ciclina D1 (Fig. 4A e Fig. 4B). In assay formazione di colonie, miR-9-espressione attenuata la crescita di SGC-7901 e cellule AGS, rispetto a quelle trasfettate con controllo negativo vettoriale (finto) (Fig. 4C). Citometria a flusso indicato che miR-9-espressione indotta arresto del ciclo cellulare in G 0 /G 1 fase nella SGC-7901 e le cellule AGS (Fig. 4D). Inoltre, trasfezione di ciclina D1, ma non di ETS1, in SGC-7901 e cellule AGS ripristinato l'inibizione della proliferazione e arresto del ciclo cellulare indotta da sovraespressione di miR-9 (Fig. 4C e Fig. 4D). D'altra parte, abbiamo esaminato gli effetti di miR-9 atterramento su GES-1, SGC-7901 e cellule AGS. L'introduzione di anti-miR-9 inibitore in queste cellule ha provocato capacità migliorate in proliferazione (Fig. S3B) e progressione del ciclo cellulare (Fig. S3C). Questi risultati hanno indicato che miR-9 notevolmente soppresso il in vitro Da studi precedenti indicano i ruoli importanti del ETS1 nella invasione e metastasi delle cellule tumorali [23], [24], abbiamo ulteriormente studiato gli effetti di retrovisori 9 sovra-espressione e di restauro gene bersaglio sulla migrazione e l'invasione del cancro gastrico SGC-7901 e le cellule AGS. Western Blot e real-time RT-PCR quantitativa indicato che trasfezione di ETS1, ma non di ciclina D1, salvato il miR-9-indotta down-regulation di ETS1 (Fig. 5A e Fig. 5B). In transwell saggio di migrazione, cellule di cancro gastrico stabilmente trasfettate con miR-9 precursore presentato una capacità di migrazione ridotta rispetto a quelle transfettate con controllo negativo vettore (finto) (Fig. 5C). Nel saggio di invasione Matrigel, miR-9-espressione attenuato l'invasività della SGC-7901 e le cellule AGS (Fig. 5d). Inoltre, trasfezione di ETS1, ma non di ciclina D1, in SGC-7901 e linee cellulari AGS ripristinati l'inibizione miR-9-meditaed sulla migrazione e l'invasione (Fig. 5C e Fig. 5D). Inoltre, abbiamo esaminato gli effetti di miR-9 atterramento su GES-1, SGC-7901 e cellule AGS. Transfection di anti-miR-9 inibitore ha provocato una maggiore migrazione e l'invasione di queste cellule (Fig. S3D e Fig. S3E). Questi risultati hanno indicato che miR-9 notevolmente attenuato il in vitro Abbiamo poi studiato l'efficacia di miR-9 contro la crescita tumorale e metastasi in vivo Poiché i risultati sopra indicati la regolazione negativa della ciclina D1 e di espressione ETS1 da miR-9, abbiamo ipotizzato che atterramento della ciclina D1 e ETS1 potrebbe esercitare effetti simili sulle cellule di cancro gastrico in coltura. I piccoli RNA interferenti (siRNA) rivolte alla regione codifica della ciclina D1 e ETS1, si-CCND1 e si-ETS1, sono stati progettati e trasfettate in SGC-7901 e le cellule AGS. Transfection di si-CCND1 e si-ETS1 ha comportato la riduzione dell'espressione della ciclina D1, pRB, ETS1 e MMP-9 in cellule di cancro gastrico, rispettivamente, in confronto a quelle trasfettate con scramble siRNA (si-Scb) (Fig. 7A, Fig . 7D e Fig. S5). Knockdown di ciclina D1 soppresso la proliferazione e indotta arresto del ciclo cellulare in G 0 /G 1 fase nella SGC-7901 e le cellule AGS (Fig. 7B e Fig. 7c). Inoltre, l'abbattimento di ETS1 nelle cellule SGC-7901 e AGS ha provocato una diminuzione di capacità di migrazione e l'invasione (fig. 7E e Fig. 7F). Questi risultati suggeriscono che atterramento della ciclina D1 e ETS1 phenocopied (possedeva i fenotipi simili a) miR-9-espressione nell'inibire la proliferazione, la migrazione e l'invasione delle cellule di cancro gastrico in vitro E 'stato ben stabilito che il profilo di espressione di miR-9 nel cancro si basa sulla distribuzione tissutale. In tumori cerebrali primari, miR-9 è elevata e funziona come un fattore essenziale per la carcinogenesi neurale [10]. miR-9 è anche over-espresso in cancro del collo dell'utero [11], suggerendo il suo ruolo promotore del tumore nello sviluppo del tumore e la progressione. Tuttavia, miR-9 è down-regolato in diversi tumori umani, tra cui il cancro al pancreas [12], il cancro ovarico [13] e il cancro del colon-retto [14], ed è associata con la progressione maligna del tumore al seno [25] e il cancro del colon-retto ( 14). Luo et al. La funzione e geni bersaglio di miR-9 sono tumore-specifici e dipendente dal contesto cellulare. miR-9 è in grado di sopprimere l'espressione E-caderina nel cancro al seno [29], con la conseguente traslocazione nucleare di β-catenina e il suo legame con fattori di trascrizione fattore delle cellule T /fattore enhancer linfoide 1, e la successiva trascrizione up-regolata geni che facilitano la proliferazione cellulare e l'angiogenesi [29]. Costretto miR-9 espressione in linee cellulari di cancro al seno comporta anche significativi cambiamenti di espressione di più geni nella via apoptotica p53-correlati [30]. Attraverso targeting diretto NF-kB, espressione ectopica di miR-9 inibisce il in vitro In questo studio, abbiamo dimostrato che l'eccesso di espressione di miR-9 attenuato la proliferazione, la migrazione e l'invasione delle cellule di cancro gastrico, che era simile a quella di ciclina D1 o ETS1 atterramento, suggerendo la potenziale applicazione di miR-9 come bersaglio per le terapie del cancro gastrico. Inoltre, i nostri dati hanno confermato che miR-9 mirato ciclina D1 e ETS1 in cellule di cancro gastrico attraverso 3'-UTR saggio luciferasi giornalista. Dal momento che dati recenti mostrano che alcune miRNA possono inoltre modulare l'espressione genica, interagendo con i promotori [36] - [38], il ruolo potenziale dei miR-9 nella regolazione della trascrizione di ciclina D1 e ETS1 attraverso l'interazione con i promotori rimangono poco chiari e garantisce la nostra ulteriore indagine. Ciclina D1 è un proto-oncogene che appartiene alla famiglia di G 1 cicline, e svolge un ruolo importante nel ciclo cellulare G 1 a S transizione legandosi suoi partner ciclina dipendente chinasi 4 e 6 di fosforilare e inattivare la proteina RB [21]. Over-espressione della ciclina D1 è un evento precoce nella carcinogenesi del colon-retto in, esofagea e della cistifellea tumori umani [39], ed è un indicatore prognostico associata a scarsa sopravvivenza in esofageo, del seno e tumori delle vie urinarie [39]. Ciclina D1 sovra-espressione nei tumori umani è chiarita da molteplici meccanismi, tra cui alterazioni genomiche, regolazione post-trascrizionale, e la stabilizzazione di proteine post-traslazionale [39]. Dati recenti indicano che il miR-16-1 reprime l'espressione della ciclina D1 a livello post-trascrizionale tramite vincolante sua 3'-UTR nel linfoma a cellule del mantello [40]. Nel corso di studio, i nostri risultati hanno dimostrato che l'inibizione sul ciclo cellulare progressione e proliferazione cellulare miR-9-mediata è stato salvato da un ripristino della ciclina espressione D1 nelle cellule di cancro gastrico, il che suggerisce che l'identificazione della ciclina D1 come un gene target miR-9, può spiegare, almeno in parte, perché un eccesso di espressione di miR-9 soppresso la proliferazione delle cellule di cancro gastrico. ETS1, un membro della famiglia ETS di fattori di trascrizione, si lega a specifiche sequenze di DNA che contengono una GGAA /T nucleo motivo [22], e partecipa invasione tumorale e metastasi attraverso regolazione trascrizionale di diversi geni responsabili di rimodellamento della matrice extracellulare, la migrazione e l'invasione, come metalloproteinasi della matrice e urochinasi attivatore del plasminogeno [22]. Fino ad oggi, un numero crescente di studi clinici hanno dimostrato i ruoli importanti di ETS1 nello sviluppo del tumore e nella progressione di vari tumori solidi [23], [24]. Precedenti studi indicano che l'espressione ETS1 è legato alle caratteristiche clinico-patologici di cancro gastrico, tra cui l'infiltrazione del tumore e dei linfonodi o metastasi distali, suggerendo il suo ruolo critico nella invasione e metastasi del cancro gastrico [41]. Tuttavia, i meccanismi alla base della ETS1 sovra-espressione nel carcinoma gastrico rimane ancora in gran parte sconosciuto. Studi recenti rivelano la regolazione post-trascrizionale di ETS1 da miR-125b in cellule del cancro al seno [42], e miR-200b in cellule endoteliali [43]. In questo studio, abbiamo dimostrato che come un bersaglio diretto di miR-9, ETS1 era up-regolati nel cancro gastrico e ha contribuito alla migrazione e l'invasione delle cellule tumorali. Knockdown di ETS1 parzialmente phenocopied gli effetti di miR-9-espressione in linee cellulari di cancro gastrico, mentre il ripristino di espressione ETS1 salvato le cellule tumorali da inibizione del miR-9-mediata sulla migrazione e l'invasione, rivelando un nuovo meccanismo di regolazione post-trascrizionale di ETS1 da miR-9 e le sue potenzialità cliniche di cancro gastrico. in sintesi, abbiamo dimostrato, per la prima volta, che il miR-9 reprime l'espressione della ciclina D1 e ETS1 attraverso mira direttamente la loro 3 ' -UTR, inibendo così la proliferazione, invasione e metastasi delle cellule di cancro gastrico. Questo studio si estende la nostra conoscenza circa la regolamentazione della ciclina D1 e ETS1 a livello post-trascrizionale di Mirna, e suggerisce che miR-9 può essere di valori potenziali come bersaglio terapeutico per il cancro gastrico. campioni di tessuto del paziente Soddisfazione per condurre questo studio sono stati ottenuti dalla Institutional Review Board di Tongji Medical college (numero di omologazione: 2010-S003). Inclusi in paraffina e campioni freschi di 86 casi di cancro gastrico primari sono stati ottenuti dal Dipartimento di Chirurgia, Unione Ospedale di Tongji Medical College. La loro diagnosi patologica è stata dimostrata da almeno due patologi. I dati demografici e clinico-patologici di tutti i pazienti sono stati riassunti nella Tabella S1. Adiacente mucosa gastrica che conteneva nessun tumore macroscopico è stato anche ottenuto, e le aree non neoplastiche sono stati successivamente verificata con esame istologico al microscopio. I campioni tumorali freschi e mucosa non neoplastica adiacenti sono stati raccolti e conservati a -80 ° C fino all'utilizzo. La colorazione immunoistochimica è stata eseguita come precedentemente descritto [44], con anticorpi specifici per ciclina D1, ETS1, MMP-9 e CD31 (Abcam Inc, Cambridge, MA, 1: 200 diluizioni). I controlli negativi incluse sezioni parallele trattati con omissione dell'anticorpo primario, oltre a una sezione adiacente dello stesso blocco in cui l'anticorpo primario è stato sostituito da coniglio policlonale IgG (Abcam Inc) come controllo isotipico. Il grado reattività è stato valutato da almeno due patologi senza conoscere le caratteristiche clinicopatologiche di tumori. Il grado di positività è stato inizialmente classificato secondo la percentuale di cellule tumorali positive come le seguenti: (-) <% di cellule 5 positiva, (1+) 6-25% di cellule positive, (2+) 26-50% di cellule positive e (3+) > celle 50% positivo. Diapositive con positivo moderata (2+) o fortemente positivo (3+) reattività sono stati classificati come aventi un "elevata espressione", mentre le diapositive con negativo (-) o positivo debole (1+) reattività sono stati classificati come aventi una "bassa espressione" . Western blot proteina cellulare è stato estratto con 1 × tampone di lisi cellulare (Promega, Madison, WI). Proteine (50 mg) di ogni campione è stato sottoposto a 4-20% gel poliacrilammide pre-cast (Bio-Rad, Hercules, CA) elettroforesi e trasferite su membrane di nitrocellulosa (Bio-Rad). Per ciclina D1, ETS1, MMP-9, pRB e β-actina (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) rilevazione, le diluizioni degli anticorpi primari erano 1:500, 1:500, 1:500, 1:500 e 1: 1000, rispettivamente, seguita da 1:3000 diluizione della capra anti-coniglio anticorpi perossidasi marcata (Bio-Rad). Kit substrato chemiluminescenza avanzata (Amersham, Piscataway, New Jersey) è stato utilizzato per la rilevazione dei segnali chemiluminscent con pellicola autoradiografia (Amersham). RT-PCR in tempo reale RT-PCR quantitativa Totale RNA è stato isolato con RNeasy Mini Kit (Qiagen Inc., Valencia, CA). Le reazioni di trascrizione inversa sono stati condotti con Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit (Roche, Indianapolis, IN). I primer PCR per ciclina D1, ETS1, MMP-9 e β-actina sono stati progettati da un software Premier Primer 5.0 (Tabella S2). RT-PCR è stata eseguita come precedentemente descritto [44]. Real-time RT-PCR quantitativa con SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems, Foster City, CA) è stata eseguita utilizzando ABI Prism 7700 Sequence Detector (Applied Biosystems). I segnali fluorescenti sono stati raccolti durante la fase di estensione, sono stati calcolati i valori Ct dei campioni, ed i livelli di trascrizione di ciclina D1, ETS1 e MMP-9 sono stati normalizzati a quelli della β-actina da 2 -ΔΔCt metodo. La quantificazione di miR-9 espressione I livelli di miR-9 nei tessuti e linee cellulari primarie sono stati determinati usando Bulge-loop ™ miRNA qPCR Primer Set (RiboBio Co. Ltd, Guangzhou, Cina). Dopo cDNA è stato sintetizzato con un stem-loop primer specifico-miRNA, la PCR quantitativa è stata eseguita con i primers specifici (Tabella S2). I livelli di miR-9 sono stati normalizzati a quelli di U6 snRNA. obiettivi miRNA sono stati previsti utilizzando gli algoritmi Miranda, miRDB, RNA22, e TargetScan [45]. Per identificare i geni comunemente previsti da quattro diversi algoritmi, i risultati di obiettivi previsti sono stati intersecati con miRWalk [46]. linee di cellule di cancro gastrico umano (SGC-7901 e MKN-74) e SV40-trasformati, normali e non-cancerogeni epiteliali gastriche GES-1 le cellule [20] sono stati ottenuti dal Type Culture Collection di Accademia Cinese delle Scienze (Shanghai, Cina). gastrica linea di cellule di cancro umano AGS (CRL-1739) è stato acquistato sotto forma American Type Culture Collection (Rockville, MD). Le cellule sono state coltivate in terreno RPMI1640 (Life Technologies, Inc., Gaithersburg, MD) supplementato con 10% di siero fetale bovino (Life Technologies, Inc.), penicillina (100 U /ml) e streptomicina (100 ug /ml). Le cellule sono state mantenute a 37 ° C in atmosfera umidificata al 5% CO 2.
e in vivo
. Restauro di miR-9-mediata down-regulation di ciclina D1 e ETS1 da trasfezione transiente, salvo le cellule tumorali di diminuzione della proliferazione, la migrazione e l'invasione. Inoltre, anti-miR-9 inibitore promosso la proliferazione, la migrazione e l'invasione delle cellule di cancro gastrico, mentre abbattendo di ciclina D1 o ETS1 parzialmente phenocopied gli effetti di miR-9 sovra-espressione. Questi dati indicano che miR-9 sopprime l'espressione della ciclina D1 e ETS1 tramite i siti di legame nel loro 3'-UTR, inibendo così la proliferazione, invasione e metastasi del cancro gastrico
, zebrafish e mammiferi [7] - [9]. Una serie di studi successivi hanno dimostrato che alterata miR-9 è associato con lo sviluppo e la progressione dei tumori [10] - [14]. Precedenti studi indicano che miR-9 è significativamente down-regolato nel carcinoma gastrico, che implica i suoi ruoli potenziali nella progressione tumorale [15] - [18]. E 'anche indicato che il miR-9 in grado di modulare la proliferazione delle cellule di cancro gastrico mediante mira il tipo caudale homeobox 2 (CDX2) [19] e NF-kappa B (NF-kB) [16]. Tuttavia, l'esatta funzione e meccanismi alla base di miR-9 nella progressione del cancro gastrico ancora meritano ulteriori indagini. In questo studio, abbiamo dimostrato, per la prima volta, che il miR-9 si rivolge direttamente ciclina D1 e v-ets virus erythroblastosis E26 omologo oncogene 1 (ETS1), e sopprime la proliferazione, invasione e metastasi delle cellule di cancro gastrico In vitro
e in vivo
.
= 0.001, Fig. 1A). L'espressione del miR-9 era significativamente più bassa nei casi di cancro gastrico con profonda invasione parete gastrica ( P
< 0,001), metastasi linfonodali ( P
< 0,001), metastasi a distanza ( P
= 0,022), ed in fase avanzata TNM ( P
= 0,01) (Tabella S1). Al contrario, una maggiore ciclina D1 e livelli di trascrizione ETS1 sono stati rilevati nei tessuti di cancro gastrico ( P
< 0,0001 e P
. ≪. 0.0001, rispettivamente Fig 1B e 1C Fig). C'era una correlazione inversa tra miR-9 espressione e ciclina D1 livelli di trascrizione nei tessuti di cancro gastrico ( P
. ≪ 0,001, Figura 1D). Inoltre, una correlazione inversa tra miR-9 espressione e livelli di trascrizione ETS1 è stato anche osservato in questi tessuti tumorali ( P
. ≪ 0,001, Figura 1E). Lower miR-9 espressione e di più elevati livelli di trascrizione di ciclina D1 e ETS1 sono stati osservati in linee cellulari di cancro gastrico rispetto a quelli normali GES-1 le cellule epiteliali gastriche [20] (Fig. 1F). La colorazione immunoistochimica è stata eseguita per osservare l'espressione della ciclina D1 e ETS1 in questi campioni tumorali (Fig. S1). ciclina D1 nucleare è stata osservata in 26/86 casi (30,2%), mentre la colorazione nucleare e citoplasma di ETS1 è stata osservata in 58/86 casi (67,4%) (Tabella S1). L'immunoreattività della ciclina D1 e ETS1 era significativamente più alta nei casi di cancro gastrico con profonda invasione gastrica muro ( P
< 0,001 e P
= 0,001), metastasi linfonodali ( P
< 0,001 e P
< 0,001), metastasi a distanza ( P
< 0,001 e P
< 0,001), e lo stadio TNM avanzata ( P
< 0,001 e P
= 0,004) (Tabella S1). Lower espressione miR-9 è stato osservato nei tessuti di cancro gastrico con una maggiore immunocolorazione della ciclina D1 ( P
< 0,0001, figura 1G.) O ETS1 ( P
. ≪ 0,0001, Fig 1H ). Questi risultati hanno indicato che miR-9 è stato down-regolato e inversamente correlata con l'espressione della ciclina D1 e ETS1 nei tessuti di cancro gastrico e linee cellulari.
miR-9 down-regolato l'espressione della ciclina D1 e ETS1 tramite posta repressione -transcriptional
miR-9 ciclina D1 direttamente mirato e ETS1 in cellule di cancro gastrico
attività luciferasi normalizzati a quelli della lucciola sono stati significativamente ridotta nelle cellule SGC-7901 e AGS stabilmente trasfettate con miR-9 precursore (Fig. 3B), e questi effetti sono stati aboliti dalla mutazione del putativo miR-9 siti all'interno della 3'-UTR della ciclina D1 e ETS1 (Fig. 3B) vincolante. Inoltre, l'abbattimento di miR-9 con l'anti miR-9-inibitore ha aumentato le attività di luciferasi in GES-1, SGC-7901 e le cellule AGS (Fig. 3C e Fig. S4C), mentre la mutazione del miR-9 sito di riconoscimento aboliti questi effetti (Fig. 3C e Fig. S4C). Questi risultati hanno indicato che miR-9 direttamente e specificamente interagito con i siti di destinazione nel 3'-UTR della ciclina D1 e ETS1.
miR-9 soppressi il in vitro
la proliferazione del cancro gastrico cellule attraverso mira ciclina D1
proliferazione e progressione del ciclo cellulare delle cellule di cancro gastrico attraverso il targeting ciclina D1.
miR-9 attenuato il in vitro
la migrazione e l'invasione delle cellule di cancro gastrico attraverso il targeting ETS1
la migrazione e l'invasione delle cellule di cancro gastrico tramite il targeting ETS1.
miR-9 attenuato la crescita e la metastasi delle cellule di cancro gastrico in vivo
. trasfezione stabile di miR-9 precursori in cellule SGC-7901 o AGS ha comportato la riduzione della crescita e del peso dei tumori xenotrapianto sottocutanei in topi nudi atimici, se paragonati a quelli stabilmente transfettate con controllo negativo vettore (finto) (Fig. 6A e Fig. 6B ). Inoltre, l'espressione della ciclina D1, ETS1 ea valle MMP-9 è stato ridotto di trasfezione stabile di miR-9 precursore (Fig. 6C). La densità dei vasi medio CD31-positive è stata ridotta all'interno del tumore formate mediante iniezione di cellule tumorali stabilmente trasfettate con miR-9 precursore (Fig. 6D). Negli studi metastasi sperimentali, SGC-7901 o cellule AGS stabilmente trasfettate con miR-9 precursori stabilite colonie metastatiche statisticamente meno al polmone rispetto gruppo finto (Fig. 6E). Questi risultati suggeriscono che miR-9 ha inibito la crescita e le metastasi delle cellule di cancro gastrico in vivo
.
Knockdown di ciclina D1 e ETS1 phenocopied miR-9 sovra-espressione mediata inibizione della proliferazione , la migrazione e l'invasione delle cellule di cancro gastrico in vitro
.
Discussione
Notato la down-regolazione di miR-9 in 24 campioni di cancro gastrico [15], che è stata successivamente confermata in 9 [16], 72 [17], e 13 [18] cancro gastrico casi. Tuttavia, Inoue et al.
Segnalato la sovraregolazione di miR-9 in 5 pazienti affetti da cancro gastrico di array PCR in tempo reale basati su miRNA [26], e questo diverso risultato in miR-9 profilo di espressione può essere dovuto all'eterogeneità di esemplari limitati. In questo studio, abbiamo dimostrato che il miR-9 è significativamente down-regolato in 86 principali campioni di cancro gastrico rispetto ai tessuti non neoplastici adiacenti, che è coerente con i precedenti risultati [15] - [18]. È importante sottolineare che, anche noi confermiamo che miR-9 espressione è inversamente associato con gli stadi clinici, invasione e metastasi del tumore gastrico. Negli esseri umani, il maturo miR-9 è codificato dai tre geni indipendenti, miR-9-1, miR-9-2 e miR-9-3, la localizzazione a cromosomi 1, 5 e 15, rispettivamente, [27]. Precedenti studi indicano che il miR-9 espressione down-regolato nel cancro gastrico è dovuto alla ipermetilazione aberrante di regione del promotore di miR-9 geni codifica [17]. Allo stesso modo, ipermetilazione aberrante di geni miR-9 della famiglia è anche riportato in alcuni tumori primari con metastasi linfonodali, come il cancro al colon, il cancro del polmone, il cancro al seno, e il melanoma [14], [28]. È importante sottolineare che l'attuale studio ha riportato la correlazione inversa tra miR-9 livelli e l'espressione della ciclina D1 e ETS1 nei tessuti di cancro gastrico, il che implica che la ciclina D1 e ETS1 possono essere regolate negativamente da miR-9.
e in vivo
crescita delle cellule tumorali ovariche [31] e la crescita e le metastasi del melanoma [32] . In neuroblatoma, sovra-espressione di miR-9 inibisce l'invasione, metastasi e angiogenesi delle cellule tumorali attraverso il targeting metalloproteinasi della matrice 14 [33]. Wan et al.
Ha riferito che l'eccesso di espressione di miR-9 ha inibito il in vitro
e in vivo
crescita della linea di cellule adenocarcinoma gastrico MGC803 attraverso la repressione di NF-kB a livello post-trascrizionale [16]. Tuttavia, in un recente studio, Rotkrua et al.
Indicato che miR-9 potrebbe essere coinvolto nella carcinogenesi gastrica attraverso CDX2 down-regolazione, e atterramento di miR-9 diminuito il in vitro
la proliferazione del cancro gastrico MKN-45 cellule [19], mentre i loro risultati devono essere ulteriormente rafforzati con miR-9 over-espressione, salvataggio gene bersaglio, e in vivo
studi. Inoltre, è attualmente controverso se CDX2 gioca un ruolo soppressore oncogenico o tumore nella carcinogenesi gastrica [34], [35]. Inoltre, il ruolo potenziale dei miR-9 nella invasione e metastasi del cancro gastrico non sono stati chiariti finora. Così, la funzione e diretti bersaglio di miR-9 in gastrica mandato cancro ulteriori indagini.
Materiali e metodi
Immunoistochimica
miRNA bersaglio previsione
coltura cellulare e trasfezione