PLoS ONE: microRNA-9 estää leviämisen, ja metastaasit mahasyövän Cells kautta Targeting sykliini D1 ja Ets1

tiivistelmä

Äskettäin on osoitettu, että muuttunut microRNA-9 (miR-9) ilmentyminen on osallisena etenemistä mahasyövän. Kuitenkin tarkka roolit ja taustalla mekanismeja miR-9 leviämisen, invaasio ja etäpesäkkeiden mahasyövän vielä tuntematon. Tässä tutkimuksessa miR-9 havaittiin olevan alassäädetty ja korreloi käänteisesti ilmaus sykliini D1 ja v-ETS erytroblastoosin virus E26 onkogeeni homologin 1 (Ets1) mahasyövän kudoksissa ja solulinjoissa. Bioinformatiikan analyysi paljasti oletetun miR-9 sitoutumiskohdat 3'-alueet (3'-UTR), sykliini D1 ja Ets1 mRNA. Ektooppinen ilmentyminen tai knockdovvn miR-9 johti vasteena muuttunut ilmentyminen sykliini D1, Ets1 ja niiden loppupään tavoitteensa fosforyloitu retinoblastooma ja matriksimetalloproteinaasi 9 viljellyissä mahasyövässä solulinjoissa SGC-7901 ja AGS. Vuonna lusiferaasireportterisysteemillä, miR-9 kohdistettu suoraan 3'-UTR sykliini D1 ja Ets1, ja nämä vaikutukset poistettiin mutatoimalla miR-9 sitoutumiskohtia. Yli-ilmentyminen miR-9 tukahdutetaan leviämisen, invaasio ja etäpesäkkeiden SGC-7901 ja AGS solujen in vitro
ja in vivo
. Palauttaminen miR-9-välitteisen alas-säätely sykliini D1 ja Ets1 lyhytaikaisella transfektiolla, pelastettiin syöpäsoluja laskun proliferaatiossa, muuttoliike ja hyökkäystä. Lisäksi anti-miR-9 estäjä edisti proliferaatiota, migraatiota ja invaasiota mahalaukun syövän solujen, kun taas kaatamalla sykliini D1 tai Ets1 osittain phenocopied vaikutuksia miR-9 yli-ilmentyminen. Nämä tiedot osoittavat, että miR-9: n ekspressiota vähentävän sykliini D1 ja Ets1 kautta sitoutumiskohdat niiden 3'-UTR: n, estäen siten proliferaatiota, invaasio ja metastaasi mahasyövän.

Citation: Zheng L, Qi T, Yang D, Qi M, Li D, Xiang X, et al. (2013) microRNA-9 estää leviämisen, ja metastaasit mahasyövän Cells kautta Targeting sykliini D1 ja Ets1. PLoS ONE 8 (1): e55719. doi: 10,1371 /journal.pone.0055719

Editor: Alejandro H. Corvalan, Pontificia Universidad Catolica de Chile, Chile

vastaanotettu: 14 syyskuu 2012; Hyväksytty: 29 joulukuu 2012; Julkaistu: 31 tammikuu 2013

Copyright: © 2013 Zheng et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: tukemana National Natural Science Foundation of China (nro 30600278, No. 30772359, No. 81071997, No. 81072073, nro 81272779), Program New Century Excellent Talents in University (NCET-06-0641), Scientific Research Foundation varten Palautetut Overseas Kiinan Scholars (2008-889), ja perustutkimus rahastoja Keski yliopistot (2012QN224). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Mahasyöpä on neljänneksi yleisin syöpä maailmassa [1]. Huolimatta paraneminen kirurgisten ja multimodaalinen hoito, ennuste edennyt mahasyöpä edelleen heikko johtuen toistumisen, invaasio ja metastaasi, jossa on 5-vuoden pysyvyys alle 30% [1]. Parempi tuntemus mekanismeista syövän etenemiseen taataan löytää uusia paradigmoja diagnosointiin ja hoitoon mahasyövän [2]. MikroRNA (miRNA), äskettäin tunnistettu luokka pienten ja hyvin säilyneitä ei-koodaavan RNA: ita, voivat osallistua transkription jälkeisen geenin ilmentymisen säätelyyn osittaisella täydentävien sitoutumisen kanssa 3'alueet (3'-UTR) ja kohde-mRNA, johtaen translaation tukahduttaminen tai mRNA: n hajoamisen [3]. Kehittyvät näyttöä siitä, että miRNA osallistuvat biologisiin prosesseihin liittyvät apoptoosin lisääntymistä, erilaistumista, invaasio ja metastaasi, vaikka vapauttaminen on ratkaisevan tärkeää syövän taudin alkamisen ja etenemisen [3]. Se on tällä hetkellä kiireellisesti tutkia roolit miRNA ja niiden kohdegeenien kasvaimen etenemisen kokeellisissa malleissa.

Ihmisen mahalaukun syöpä, useita miRNA on raportoitu olevan poikkeavasti yli-ilmentynyt tai alas-säädellä aikana etenemisen mahasyöpä, mukaan lukien miR-21 [4], miR-15b [5], miR-16 [5], ja miR-101 [6]. Nämä miRNA pelata onkogeenisia tai kasvain heikentävän rooleja solukasvun säätelyssä, muuttoliikettä ja invaasiota tukahduttaa niiden kohdegeenien. Esimerkiksi onkogeenisiä miR-21 on poikkeavasti yliekspressoitu mahasyövässä, ja parantaa leviämisen ja invasiivisuus mahalaukun syöpäsolujen kohdistamalla palautuminen aiheuttavia kysteiinirikkaan proteiinin Kazal motiiveja [4]. Samaan aikaan miR-15b ja miR-16 ovat alassäädetty mahasyövän ja edistävät monilääkeaineresistenssin mahalaukun syöpäsolujen modulaatio apoptoosin kautta kohdistaminen B-solu leukemia /lymfooma 2 [5]. miR-101 on alassäädetty mahasyövän kudoksissa ja solulinjoissa, kun taas ektooppinen ilmentyminen miR-101 merkittävästi estää proliferaatiota, muuttoliike ja invaasion mahalaukun syöpäsolujen kohdentamalla tehostajana zeste homologin 2, sytokromi c oksidaasi alayksikkö II, ja myelooinen cell leukemia sarja 1 [6]. Siksi on ollut keskittyä tutkimaan edelleen ilmentymistä ja toimintaa miRNA kasvaimen biologiaan mahasyövän.

MicroRNA-9 (miR-9) on ensimmäinen tunnistettu yksi tärkeimmistä sääntelyviranomaisten kehittämisen , fysiologia ja patologia hermoston useissa organismeihin, kuten Drosophila
, seeprakala, ja nisäkkäät [7] - [9]. Sarja myöhemmät tutkimukset ovat osoittaneet, että muuttunut miR-9: n ilmentyminen liittyy kehittymistä ja etenemistä syöpien [10] - [14]. Aiemmat tutkimukset osoittavat, että miR-9 on merkittävästi alassäädetty mahasyövän, mikä sen potentiaali roolit kasvainprogression [15] - [18]. On myös osoitettu, että miR-9 voi moduloida leviämisen mahasyövän solujen kautta kohdistettu caudal tyypin homeobox 2 (CDX2) [19] ja NF-kappa B (NF-KB) [16]. Kuitenkin tarkka toiminta ja taustalla olevien mekanismien miR-9 etenemisessä mahasyövän vielä aihetta lisätutkimuksia. Tässä tutkimuksessa osoitamme, ensimmäistä kertaa, että miR-9 suoraan tavoitteet sykliini D1 ja v-ETS erytroblastoosin virus E26 onkogeeni homologin 1 (Ets1), ja tukahduttaa leviämisen, invaasio ja etäpesäkkeiden mahalaukun syöpäsolujen vuonna vitro
ja in vivo
.

tulokset

miR-9 oli alassäädetty ja korreloi käänteisesti ilmaus sykliini D1 ja Ets1 mahasyövän kudoksiin ja solulinjoja

tutkimiseksi miR-9 ilmentymistä mahasyövän, mahasyövän kudosten ja viereisen ei-neoplastisia limakalvon kerättiin 86 ensisijainen tapauksissa. Reaaliaikainen kvantitatiivinen käänteistranskriptio-PCR (RT-PCR) paljasti, että miR-9 alassäädetty mahasyövän kudoksissa kuin viereisillä epäneoplastisis- limakalvon ( P
= 0,001, Fig. 1A). MIR-9 ilmentyminen oli merkitsevästi alhaisempi mahasyövän tapauksissa syvempi mahalaukun seinämän invaasio ( P
< 0,001), imusolmuke etäpesäke ( P
< 0,001), kaukainen etäpesäke ( P
= 0,022), ja kehittyneet TNM ( P
= 0,01) (taulukko S1). Sen sijaan korkeampi sykliini D1 ja Ets1 transkriptipitoisuuksissa havaittu mahasyövässä kudoksissa ( P
< 0,0001 ja P
< 0,0001 vastaavasti Fig. 1B ja Fig. 1 C). Oli käänteinen korrelaatio miR-9 ilmaisun ja sykliini D1 transkriptipitoisuuksissa mahasyövän kudoksissa ( P
< 0,001, Fig. 1 D). Lisäksi käänteinen korrelaatio miR-9 ilmaisun ja Ets1 transkriptipitoisuuksissa havaittiin myös näissä syövän kudoksissa ( P
< 0,001, Fig. 1 E). Ala miR-9 ilmaisun ja korkeamman transkriptipitoisuuksissa sykliini D1 ja Ets1 havaittiin mahasyövässä solulinjoissa kuin normaaleissa mahalaukun epiteelin GES-1-soluissa [20] (Fig. 1 F). Immunohistokemiallinen värjäys suoritettiin tarkkailla ilmaus sykliini D1 ja Ets1 näissä syövän yksilöt (Fig. S1). Nuclear sykliini D1 havaittiin 26/86 (30,2%) tapauksista, kun taas ydin- ja sytoplasman värjäytymistä Ets1 havaittiin 58/86 (67,4%) tapauksista (taulukko S1). Immunoreaktiivisuus sykliini D1 ja Ets1 oli merkitsevästi korkeampi mahasyövän tapauksissa syvempi mahalaukun seinämän invaasio ( P
< 0,001 ja P
= 0,001), imusolmuke etäpesäke ( P
< 0,001 ja P
< 0,001), kaukainen etäpesäke ( P
< 0,001 ja P
< 0,001), ja kehittyneet TNM ( P
< 0,001 ja P
= 0,004) (taulukko S1). Ala miR-9 ilmentymistä havaittiin mahasyövän kudoksissa suuremmilla immuunivärjäystä sykliini D1 ( P
< 0,0001, Fig. 1G) tai Ets1 ( P
< 0,0001, Fig. 1H ). Nämä tulokset osoittivat, että miR-9 alassäädetty ja korreloi käänteisesti ilmaus sykliini D1 ja Ets1 mahasyövän kudoksissa ja solulinjoissa.

miR-9 alassäädetty ilmaus sykliini D1 ja Ets1 läpi post -transcriptional tukahduttaminen

Tutkiakseen olettamusta, että miR-9 voi vaikuttaa ilmaus sykliini D1 ja Ets1 mahasyövän, laskennallinen ennuste tehtiin miRNA tietokantoja. Mahdolliset sitoutumiskohdat Mir-9 korkea täydentävät, havaittiin emäkset 2974-2995 sykliini D1 3'-UTR ja 2648-2670 on Ets1 3'-UTR (Fig. 2A). Tutkia suorien vaikutusten miR-9 ilmaisun sykliini D1 ja Ets1 mahalaukun syöpäsoluissa, suoritimme Mirna yli-ilmentyminen kokeiluja. Vakaa transfektointi miR-9 esiaste osaksi SGC-7901 ja AGS solut johti kasvua miR-9 tasoa (Kuva. S2). Western blot, RT-PCR ja reaaliaikainen kvantitatiivinen RT-PCR osoitti, että yli-ilmentyminen miR-9 johti vähentyneeseen proteiinin ja transkription tasoa sykliini D1 ja Ets1 mahasyövän soluja kuin ne, jotka on transfektoitu negatiivinen kontrolli vektorin (vale) ( Fig. 2B, kuva 2C, ja kuva 2D). Lisäksi tasot fosforyloitua retinoblastoomaa (pRB, alavirtavaikuttajainhibiittorit sykliini D1) [21] ja matriisimetalloproteinaasi 9 (MMP-9, joka on alavirtaan geenin Ets1) [22] määrä väheni miR-9 yli-ilmentävien syöpäsolujen (Fig. 2B, Fig. 2C, ja Fig. 2D). Tutkia edelleen ehkäisevän roolin miR-9 ilmaisemisessa sykliini D1 ja Ets1, suoritimme MIR-9 Knockdown kokeita transfektoimalla anti-miR-9 tai negatiivinen kontrolli (anti-NC) estäjät osaksi GES-1, SGC -7901 ja AGS soluja. Transfektio anti-miR-9-inhibiittori ilmeisesti väheni endogeeninen miR-9 ilmentymistä (Fig. S3A), ja upregulated proteiinin tasot sykliini D1, pRB, Ets1 ja MMP-9 kuin transfektoitiin anti-NC (Fig. 2E ja Kuva. S4A). Reaaliaikainen kvantitatiivinen RT-PCR-analyysit osoittivat parannettua transkriptitasot sykliini D1, Ets1 ja MMP-9: n viljellyissä soluissa, jotka on transfektoitu anti-miR-9-inhibiittori, verrattuna niihin, jotka on transfektoitu anti-NC (Fig. 2F ja kuvio. S4b). Kaiken kaikkiaan nämä tulokset osoittivat, että miR-9 inhiboituu huomattavasti ilmaus sykliini D1 ja Ets1 läpi transkription jälkeisen tukahduttaminen.

miR-9 suunnattu suoraan sykliini D1 ja Ets1 mahalaukun syöpäsoluissa

onko miR-9 voi tukahduttaa ilmentymistä sykliini D1 ja Ets1 kohdistamalla sen sitoutumiskohdat 3'-UTR: n, PCR-tuotteet, jotka sisältävät ehjä kohdekohtaan tai mutaatio miR-9 siementen tunnistussekvenssit (Fig. 3A) insertoitiin lusiferaasireportterisysteemillä vektori. Plasmidit transfektoitiin mahasyövän pysyvästi transfektoitujen solujen negatiivinen kontrolli -vektoriin (mock) tai miR-9 esiaste. Renilla
lusiferaasiaktiivisuudet normalisoitu kuin Firefly vähensi merkittävästi SGC-7901 ja AGS pysyvästi transfektoitujen solujen miR-9 esiaste (Fig. 3B), ja nämä vaikutukset poistettiin mutatoimalla otaksuttu miR-9 sitoutumiskohtien 3'-UTR sykliini D1 ja Ets1 (Fig. 3B). Lisäksi knockdovvn miR-9 anti-miR-9 estäjä lisäsi lusiferaasin toimintaa GES-1, SGC-7901 ja AGS-soluissa (kuvio. 3C ja kuvio. S4C), kun taas mutaatio miR-9-tunnistuskohdan poistettava nämä vaikutukset (Fig. 3C ja kuvio. S4C). Nämä tulokset osoittivat, että miR-9 välittömästi ja nimenomaisesti vuorovaikutuksessa kohde sivustoja 3'-UTR sykliini D1 ja Ets1.

miR-9 tukahdutti in vitro
leviämisen mahasyövän soluja kohdistamalla sykliini D1

Koska edellä näyttö osoittaa, että miR-9 esti sykliini D1 ilmentyminen, ja yhdistämällä tosiasiat että sykliini D1: llä on kriittinen rooli solusyklin etenemisen ja leviämisen syöpäsolujen [21], Tutkimme lisäksi vaikutuksia miR-9 yli-ilmentyminen ja kohdegeenin palauttaminen viljellyillä mahalaukun syöpäsoluja. Western blot ja reaaliaikainen kvantitatiivinen RT-PCR osoitti, että transfektio sykliini D1, mutta ei Ets1, pelasti miR-9 aiheuttama säätely alaspäin sykliini D1 (Fig. 4A ja Fig. 4B). Pesäkkeitä muodostumista määrityksessä, miR-9 yli-ilmentyminen vaimenee kasvua SGC-7901 ja AGS solujen, verrattuna niihin, jotka on transfektoitu negatiivinen kontrolli vektorin (vale) (Fig. 4C). Virtaussytometria osoitti, että miR-9 yli-ilmentyminen indusoi solukierron pysähtymisen G _{0 /G 1 vaihe SGC-7901 ja AGS-soluissa (kuvio. 4D). Lisäksi transfektio sykliini D1, mutta ei Ets1, osaksi SGC-7901 ja AGS solujen palauttaa leviämisen inhibitio ja solusyklin pysähtymisen aiheuttamaa yli-ilmentyminen miR-9 (Fig. 4C ja Fig. 4D). Toisaalta, tutkimme vaikutuksia miR-9 Knockdown on GES-1, SGC-7901 ja AGS soluja. Johdanto anti-miR-9 estäjä näihin soluihin johti tehostetun kykyjä leviämisen (Fig. S3B) ja solusyklin etenemisen (kuvio. S3C). Nämä tulokset osoittivat, että miR-9 huomattavasti tukahdutetaan in vitro
leviämisen ja solusyklin etenemisen mahalaukun syöpäsolujen johon pyritään sykliini D1.}

miR-9 heikennetty in vitro
muuttoliike ja invaasion mahasyövän solujen kohdistamalla Ets1

Koska aiemmat tutkimukset osoittavat yhtä tärkeää roolia Ets1 vuonna hyökkäyksen ja etäpesäkkeiden syöpäsolujen [23], [24], me tutki tarkemmin vaikutukset asennuspalveli- 9 yli-ilmentyminen ja kohdegeenin palauttaminen maahanmuutto- ja hyökkäys mahasyövän SGC-7901 ja AGS soluja. Western blot ja reaaliaikaisella kvantitatiivisella RT-PCR osoitti, että transfektion Ets1, mutta ei sykliini D1, pelastettiin MIR-9-indusoidun down-regulation of Ets1 (Fig. 5A ja kuvio. 5B). Vuonna siirtokuoppaan migraatiokokeessa, mahasyöpä pysyvästi transfektoitujen solujen miR-9 esiaste esitti heikentynyt muuttoliike kapasiteetti kuin transfektoitu negatiivinen kontrolli vektorin (vale) (Fig. 5C). Vuonna Matrigel invaasiomääritys, miR-9 yli-ilmentyminen vaimenee invasiivisuus on SGC-7901 ja AGS-soluissa (kuvio. 5D). Lisäksi transfektoimiseksi Ets1, mutta ei sykliini D1, osaksi SGC-7901 ja AGS solulinjat palautti miR-9-meditaed esto maahanmuutto- ja invaasion (Fig. 5C ja kuvio. 5D). Lisäksi tutkimme vaikutuksia miR-9 Knockdown on GES-1, SGC-7901 ja AGS soluja. Transfektio anti-miR-9 estäjä johti lisätä maastamuuttoa ja invaasion näiden solujen (Kuva. S3D ja Fig. S3E). Nämä tulokset osoittivat, että miR-9 huomattavasti heikennetty in vitro
muuttoliike ja invaasion mahasyövän solujen johon pyritään Ets1.

miR-9 vaimennettu kasvua ja etäpesäkkeiden mahalaukun syöpäsolujen in vivo

vieressä tutkittiin tehoa miR-9 vastaan ​​kasvaimen kasvua ja etäpesäkkeiden in vivo
. Stabiili transfektio miR-9 esiaste osaksi SGC-7901 tai AGS solujen alensivat kasvu ja painon ihonalaisen ksenograftikasvaimissa kateenkorvattomissa nude-hiirissä, kun sitä verrataan niihin stabiilisti transfektoitu negatiivinen kontrolli vektorin (vale) (Fig. 6A ja kuvio. 6B ). Lisäksi ilmaisu sykliini D1, Ets1 ja loppupään MMP-9 väheni stabiili transfektio miR-9 esiaste (Fig. 6C). CD31-positiivinen keskiarvo suonitiheyttä vähentää kasvaimiin on muodostettu ruiskuttamalla syöpäsolujen stabiilisti transfektoitu miR-9 esiaste (Fig. 6D). Kokeellisessa etäpesäke tutkimukset, SGC-7901 tai AGS pysyvästi transfektoitujen solujen miR-9 esiaste perustettiin tilastollisesti vähemmän keuhkojen metastaattinen pesäkkeitä kuin mock ryhmä (Fig. 6E). Nämä tulokset viittaavat siihen, miR-9 esti kasvua ja etäpesäkkeiden mahalaukun syöpäsolujen in vivo
.

knockdovvn sykliini D1 ja Ets1 phenocopied miR-9 yli-ilmentyminen estoa proliferaatioon , muuttoliike ja invaasion mahalaukun syöpäsolujen in vitro

Koska edellä tulokset osoittivat negatiiviseen säätelyyn sykliini D1 ja Ets1 ilmentyminen miR-9, me arveltu, että knockdovvn sykliini D1 ja Ets1 saattaisi aiheuttavat samankaltaisia ​​vaikutuksia viljellyissä mahalaukun syöpäsoluja. Pieni häiritsevä RNA: t (siRNA: t), joiden tarkoituksena koodaavan alueen sykliini D1 ja Ets1, si-CCND1 ja si-Ets1, suunniteltiin ja transfektoitiin SGC-7901 ja AGS soluja. Transfektio si-CCND1 ja si-Ets1 johti vähentyneeseen ekspressioon sykliini D1, pRB, Ets1 ja MMP-9 mahasyövän soluissa, vastaavasti, verrattuna niihin, jotka on transfektoitu sekoituskoodin siRNA (si-Scb) (Fig. 7A, kuvio . 7D ja Fig. S5). Knockdown sykliini D1 tukahdutetaan lisääntymistä ja indusoi solusyklin pysähtymisen G _{0 /G 1 vaihe SGC-7901 ja AGS-soluissa (kuvio. 7B ja kuvio. 7C). Lisäksi knockdovvn Ets1 in SGC-7901 ja AGS solujen alensivat valmiuksia muuttoliikkeen ja invaasion (Fig. 7E ja Fig. 7F). Nämä tulokset viittaavat siihen, knockdovvn sykliini D1 ja Ets1 phenocopied (hallussaan samanlainen fenotyyppejä sen) miR-9 yli-ilmentyminen uudiskasvun estämiseksi, muuttoliike ja invaasion mahalaukun syöpäsolujen in vitro
.}

keskustelu

on hyvin osoitettu, että miR-9 ilmaisun profiili syövän perustuu kudosjakaumasta. Vuonna ensisijainen aivokasvaimia, miR-9 on koholla ja toimii olennainen tekijä hermo karsinogeneesissä [10]. miR-9 on myös yli-ilmentynyt kohdunkaulan syövän [11], mikä viittaa siihen, sen kasvaimen promoottorin rooli kasvaimen kehittymisen ja etenemisen. Kuitenkin miR-9 säätyy alas useita ihmisen syövissä, mukaan lukien haimasyöpä [12], munasarjasyöpä [13] ja peräsuolen syövän [14], ja se liittyy pahanlaatuinen etenemisen rintasyövän [25] ja peräsuolen syöpä ( 14). Luo et al.
Totesi alas-säätely miR-9 24 mahasyövässä yksilöt [15], joka vahvistettiin myöhemmin 9 [16], 72 [17], ja 13 [18] mahasyövän tapauksissa. Kuitenkin Inoue et al.
Raportoitu säätelyä miR-9 5 mahalaukun syöpäpotilaiden reaaliaikainen PCR-pohjainen miRNA paneelit [26], ja tämä toinen havainto miR-9 mentymisprofiili voi johtua heterogeenisuus rajallinen yksilöitä. Tässä tutkimuksessa osoitamme, että miR-9 on merkittävästi säädellä vähentävästi 86 ensisijainen mahasyövän yksilöitä kuin viereisen ei-neoplastisia kudoksia, mikä on sopusoinnussa aikaisempien havaintojen [15] - [18]. Mikä tärkeintä, me myös vahvistaa, että miR-9 ilmentyminen käänteisesti yhteydessä kliinisissä vaiheissa, invaasio ja etäpesäkkeiden mahasyövän. Ihmisillä kypsä miR-9 koodaa kolme itsenäistä geenejä, miR-9-1, miR-9-2 ja miR-9-3, paikantaminen on kromosomeja 1, 5 ja 15, vastaavasti [27]. Aikaisemmat tutkimukset osoittavat, että alaspäin säädelty miR-9 ilmentyminen mahasyövän johtuu poikkeava hypermetylaatiota promoottorialueen miR-9 koodaavat geenit [17]. Vastaavasti, poikkeava hypermetylaatiota miR-9 perheen geenien on myös raportoitu joissakin primaareja kasvaimia, jossa imusolmuke etäpesäke, kuten paksusuolen syöpä, keuhkosyöpä, rintasyöpä ja melanooma [14], [28]. Tärkeää on, että nykyinen tutkimus raportoi käänteinen korrelaatio miR-9 tasoa ja ilmaisu sykliini D1 ja Ets1 mahasyövän kudoksissa, mikä tarkoittaa, että sykliini-D1 ja Ets1 voidaan säätelee negatiivisesti miR-9.

Toiminto ja kohdegeenien miR-9 ovat kasvainspesifisiä ja riippuvainen solujen yhteydessä. miR-9 pystyy tukahduttamaan E-kadheriinin ilmentymisen rintasyövässä [29], jolloin ydin- translokaatio β-kateniinin ja sen sitomiseksi transkriptiofaktoreiden T-solu tekijä /imukudoksen tehostajana tekijä 1, ja myöhemmin sääteli transkriptio geenit, jotka helpottavat solujen lisääntymisen ja angiogeneesin [29]. Pakko miR-9 ilmentyminen rintasyöpäsolulinjoissa myös johtaa merkittävään ilmentyminen muuttuu useiden geenien p53 liittyvät apoptoottisen reitin [30]. Suoran kohdistaminen NF-KB, ektooppinen ilmentyminen miR-9 estää in vitro
ja in vivo
kasvun munasarjasyöpäsoluja [31] ja kasvua ja etäpesäkkeiden melanooman [32] . Vuonna neuroblatoma, yli-ilmentyminen miR-9 estää invaasio, etäpesäke, ja angiogeneesin kasvainsolujen kohdistamalla matriksimetalloproteinaasi 14 [33]. Wan et al.
Raportoitu, että yli-ilmentyminen miR-9 esti in vitro
ja in vivo
kasvun mahalaukun Adenokarsinoomasolulinja MGC803 kautta tukahduttaa NF-KB at transkription jälkeisellä tasolla [16]. Kuitenkin tuoreessa tutkimuksessa, Rotkrua et al.
Osoitti, että miR-9 saattaa olla mukana mahasyövän kautta alaspäin säätäminen CDX2, ja knockdovvn miR-9 vähensivät in vitro
leviämisen mahasyöpä MKN-45-soluissa [19], kun taas niiden tulokset tarvitsee edelleen vahvistettava miR-9 yli-ilmentyminen, kohdegeenin pelastus, ja in vivo
tutkimuksissa. Lisäksi, tällä hetkellä on kiistelty siitä, CDX2 lähettää onkogeeninen tai kasvaimia estävä rooli mahasyövän [34], [35]. Lisäksi mahdolliset roolit miR-9 ja metastaasit mahasyövän ei ole selvitetty toistaiseksi. Siten toiminto ja kohdistu suoraa miR-9 mahasyövän optio lisätutkimuksia.

Tässä tutkimuksessa osoitimme, että yli-ilmentyminen miR-9 heikennetty lisääntymistä, muuttoliike ja invaasion mahalaukun syöpäsoluja, joka oli samanlainen kuin sykliini D1 tai Ets1 pudotus, mikä viittaa siihen, potentiaalinen sovellus miR-9 kuin tavoite terapeuttisten mahasyövän. Lisäksi tuloksemme vahvistivat, että miR-9 suunnattu suoraan sykliini D1 ja Ets1 mahasyövän soluihin 3'-UTR lusiferaasireportterilla määritys. Koska viimeaikaiset tiedot osoittavat, että tietyt miRNA voidaan vaihtoehtoisesti moduloida geeniekspressiota vuorovaikutuksessa promoottorit [36] - [38], mahdolliset roolit miR-9 säätelyssä transkription sykliini D1 ja Ets1 kautta vuorovaikutuksessa promoottorit ovat edelleen epäselviä ja ansaitsevat edelleen tutkimus. Sykliini D1 on esikasvaintekijän joka kuuluu perheeseen G _{1 sykliinejä, ja sillä on tärkeä rooli solusyklin G 1 S siirtymisen sitomalla sen kumppanit sykliiniriippuvainen kinaasi 4 ja 6 fosfory- ja inaktivoida RB-proteiini [21]. Yli-ilmentyminen sykliini D1 on varhainen tapahtuma syövän syntymistä paksu-, ruokatorven ja sappirakon syöpää [39], ja on ennustetyövälineenä indikaattori liittyy huono hengissä ruokatorven, rinta, ja virtsan syövät [39]. Sykliini D1 yli-ilmentyminen ihmisen syövissä on selvitetty monin mekanismein, mukaan lukien genominen muutokset, transkription jälkeinen sääntely, ja translaation jälkeinen proteiinin stabiloimiseksi [39]. Äskettäin on osoitettu, että miR-16-1 tukahduttaa sykliini D1 ilmentymisen transkription jälkeisellä tasolla sitoutumisen kautta sen 3'-UTR Manttelisolulymfoomapotilailla [40]. Nykyisessä tutkimuksessa, meidän havainnot osoittivat, että miR-9 estoa solusyklin etenemistä ja solujen lisääntymistä pelastettiin palauttaminen sykliini D1 ilmentyminen mahasyövässä soluissa, mikä viittaa siihen, että tunnistaminen sykliini D1 kuin miR-9 kohdegeenin voi selittää, ainakin osittain, miksi yli-ilmentyminen miR-9 tukahdutti leviämisen mahalaukun syöpäsoluja.}

Ets1, jäsen ETS perheen transkriptiotekijöiden, sitoutuu spesifisiin DNA-sekvensseihin, jotka sisältävät GGAA /T ydinmotiivin [22], ja osallistuu kasvaimen invaasion ja etäpesäkkeiden kautta transkription säätelyyn useiden geenien vastuussa soluväliaineen remodeling, muuttoliike, ja invaasio, kuten matriksimetalloproteinaasi ja urokinaasi plasminogeeniaktivaattori [22]. Tähän mennessä yhä useammat kliiniset tutkimukset ovat osoittaneet tärkeän roolin Ets1 kasvaimen kehittymistä ja etenemistä erilaisia ​​kiinteitä kasvaimia [23], [24]. Aikaisemmat tutkimukset osoittavat, että Ets1 ilmentyminen liittyy kliinis mahalaukun syövän, mukaan lukien kasvaimen infiltraatiota ja imusolmukkeisiin tai distaalinen etäpesäkkeitä, viittaa sen tärkeän roolin ja metastaasit mahasyövän [41]. Kuitenkin mekanismeista Ets1 yli-ilmentyminen mahasyövässä edelleen suurelta osin tuntemattomia. Viimeaikaiset tutkimukset osoittavat transkription jälkeisellä sääntely Ets1 by miR-125b rintasyöpäsoluissa [42], sekä miR-200b endoteelisoluissa [43]. Tässä tutkimuksessa osoitimme, että välittömänä kohteena miR-9, Ets1 oli säädellään ylöspäin mahasyövän ja edistänyt migraation ja invaasion syöpäsoluja. Knockdovvn Ets1 osittain phenocopied vaikutuksia miR-9 yli-ilmentyminen mahasyövässä solulinjoissa, kun taas palauttaminen Ets1 ilmaisun pelastettu syöpäsoluja miR-9 estoa maahanmuutto- ja invaasio, paljastaen uusi transkription jälkeisen sääntelyn mekanismi of Ets1 by miR-9 ja sen kliininen potentiaalit mahasyövässä.

Yhteenvetona olemme osoittaneet, ensimmäistä kertaa, että miR-9 tukahduttaa ilmaisun sykliini D1 ja Ets1 kautta suoraan kohdistaminen niiden 3 ' -UTR, estäen siten proliferaatiota, invaasio ja metastaasi mahalaukun syövän soluja. Tässä tutkimuksessa laajennetaan tietämystä sääntelyn sykliini D1 ja Ets1 at transkription jälkeisellä tasolla miRNA, ja ehdottaa, että miR-9 voi olla mahdollisia arvoja uutena terapeuttisena kohteena mahasyövän.

Materiaalit ja menetelmät

Patient kudosnäytteitä

hyväksyntä toteuttamaan tämän tutkimuksen saatiin Institutional Review Board of Tongji Medical College (hyväksynnän numero: 2010-S003). Parafinoidut ja tuoreita yksilöitä 86 ensisijaisen mahasyövän tapaukset saatiin Department of Surgery, Union sairaalan Tongji Medical College. Heidän patologinen diagnoosi osoittautui vähintään kaksi patologia. Väestörakenteen ja kliinis tiedot kaikista potilaista yhteenveto taulukossa S1. Vieressä mahalaukun limakalvon, jotka eivät sisältäneet makroskooppista kasvainta saatiin myös, että ei-neoplastisia alueita sittemmin varmistettiin mikroskooppisen histologia. Tuore Tuumorinäytteet ja viereisen ei-neoplastisia limakalvon kerättiin ja säilytettiin -80 ° C: ssa käyttöön asti.

immunohistokemia

immunohistokemiallinen värjäys suoritettiin, kuten aiemmin on kuvattu [44], jossa on vasta-aineita, jotka ovat spesifisiä sykliini D1, Ets1, MMP-9 ja CD31 (Abcam Inc, Cambridge, MA, 1: 200 laimennosta). Negatiivisten kontrollien rinnakkaiset osat käsiteltiin poisjättäminen primaarisen vasta-aineen lisäksi viereisen osa samaan lohkoon, jossa primaarinen vasta-aine oli korvattu kanin polyklonaalinen IgG (Abcam Inc), kuten isotyyppikontrolli. Reaktiivisuus aste arvioitiin vähintään kaksi patologia ilman tietoa kliinis-kasvaimia. Positiivisuuden taso oli alun perin luokiteltu prosenttiosuuden positiivisten syöpäsolujen kuten seuraavat: (-) < 5% soluista positiivinen, (1+) 6-25% soluista positiivinen, (2 +) 26-50% soluista positiivisia ja (3 +) > 50% soluista positiivisia. Diat kohtalainen positiivinen (2 +) tai vahva positiivinen (3+) reaktiivisuus luokiteltiin joilla on "korkea ilmaisu", kun taas diat negatiivinen (-) tai heikko positiivinen (1+) reaktiivisuus luokiteltiin jolla on "matala ilmaus" .

Western blot

Cellular proteiini uutettiin 1 x solujen hajotuspuskuria (Promega, Madison, WI). Proteiinia (50 ug) kustakin näytteestä tehtiin 4-20% esivalet- polyakryyliamidigeelissä (Bio-Rad, Hercules, CA), elektroforeesilla ja siirrettiin nitroselluloosamembraaneille (Bio-Rad). Sykliini D1, Ets1, MMP-9, pRB ja β-aktiini (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) havaitseminen, primaarisen vasta-aineen laimennoksia oli 1:500, 1:500, 1:500, 1:500 ja 1: 1000, vastaavasti, minkä jälkeen 1:3000 laimentamalla vuohen anti-kani-piparjuuri-peroksidaasilla leimattua vasta-ainetta (Bio-Rad). Parannettu kemiluminesenssin substraatin (Amersham, Piscataway, NJ) käytettiin chemiluminscent havaitsemiseksi signaalien autoradiografia kalvo (Amersham).

RT-PCR ja reaaliaikainen kvantitatiivinen RT-PCR

Yhteensä RNA eristettiin RNeasy Mini Kit (Qiagen Inc., Valencia, CA). Käänteisen transkription Reaktiot suoritettiin Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit (Roche, Indianapolis, IN). PCR-alukkeet sykliini D1, Ets1, MMP-9 ja β-aktiini suunnitellut Premier Primer 5,0 ohjelmisto (taulukko S2). RT-PCR suoritettiin, kuten aiemmin on kuvattu [44]. Reaaliaikainen kvantitatiivinen RT-PCR SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems, Foster City, CA) suoritettiin käyttäen ABI Prism 7700 Sequence Detector (Applied Biosystems). Fluoresoivia signaaleita aikana kerättiin jatkotutkimuksessa, Ct-arvoja näytteiden laskettiin, ja transkriptitasot sykliini D1, Ets1 ja MMP-9: lle normalisoitiin kuin β-aktiini 2 ^{-ΔΔCt menetelmällä.}

kvantifiointi miR-9 ilmaisun

tasot kypsän miR-9 ensisijainen kudoksissa ja solulinjoissa määritettiin Bulge-Loop ™ miRNA qPCR alukejoukolla (RiboBio Co Ltd, Guangzhou, Kiina). Sen jälkeen, kun cDNA syntetisoitiin kanssa miRNA-specific varsi-silmukka-aluketta, määrällinen PCR suoritettiin spesifisiä alukkeita (taulukko S2). MIR-9 tasoa normalisoituivat kuin U6 snRNA.

miRNA tavoite ennustus

miRNA tavoitteet ennustettiin käyttämällä algoritmeja Miranda miRDB, RNA22, ja Targetscan [45]. Tunnistaa geenien yleisesti ennustettu neljällä eri algoritmien tulokset ennustettu tavoitteet leikkaavat käyttämällä miRWalk [46].

Soluviljely ja transfektio

Ihmisen mahalaukun syövän solulinjat (SGC-7901 ja MKN-74) ja SV40-transformoitu, normaali ja ei-tuumorigeeniset mahalaukun epiteelin GES-1-soluissa [20] saatiin Type Culture Collection of Kiinan tiedeakatemia (Shanghai, Kiina). Ihmisen mahalaukun tasyöpäsolulinja AGS (CRL-1739) hankittiin muodossa American Type Culture Collection (Rockville, MD). Soluja kasvatettiin RPMI1640-alustassa (Life Technologies, Inc., Gaithersburg, MD), johon oli lisätty 10% naudan sikiön seerumia (Life Technologies, Inc.), penisilliiniä (100 U /ml) ja streptomysiiniä (100 ug /ml). Soluja pidettiin 37 ° C: ssa kostutetussa ilmakehässä, jossa 5% CO _2.

• PLoS ONE: Association between vähentäminen Plasma Adiponectin tasot ja vaara bakteeritartunta jälkeen mahasyövän Surgery
• PLoS ONE: n ilmentyminen AFP ja STAT3 osallistuu Arseenitrioksidi indusoiman apoptoosin ja Kasvun inhibitio in AFP-tuottaminen mahasyövän Cells