PLoS ONE: Anthraquinon G503 fremkalder apoptose i Gastric Cancer Cells gennem Mitokondriel Pathway

Abstrakt

G503 er en anthraquinonforbindelse isoleret fra de sekundære metabolitter af en mangrove endofytisk svamp fra det Sydkinesiske Hav. Den foreliggende undersøgelse belyser anti-tumor aktivitet og den underliggende mekanisme af G503. Cellelevedygtighed assay udført i ni cancercellelinier og to normale cellelinier viste, at den gastriske cancercellelinie SGC7901 er de mest G503-sensitive cancerceller. G503 induceret SGC7901 celledød via apoptose. G503 eksponering aktiverede caspase-3, -8 og -9. Forbehandling med den pan-caspase inhibitor Z-VAD-FMK og caspase-9-inhibitor Z-LEHD-FMK, men ikke caspase-8 inbibitor Z-IETD-FMK, svækkede virkningen af ​​G503. Disse resultater tydede på, at den indre mitokondrielle apoptose pathway, snarere end den ydre vej, var involveret i G503-induceret apoptose. Endvidere G503 steg forholdet mellem Bax til Bcl-2 i mitochondrierne og faldt forholdet i cytosolen. G503 behandling resulterede i mitokondrie depolarisering, cytochrom c-frigivelse og den efterfølgende spaltning af caspase -9 og -3. Desuden er det rapporteret, at det endoplasmatiske reticulum apoptose pathway også kan aktiveres af G503 ved at inducere Capase-4-spaltning. I betragtning af den lavere 50% hæmmende koncentration for gastriske kræftceller, kan G503 tjene som en lovende kandidat til mavekræft kemoterapi

Henvisning:. Huang L, Zhang T, Li S, Duan J, Ye F, Li H, et al. (2014) Anthraquinon G503 fremkalder apoptose i Gastric Cancer Cells gennem Mitokondriel Pathway. PLoS ONE 9 (9): e108286. doi: 10,1371 /journal.pone.0108286

Redaktør: Javier S. Castresana, Navarra Universitet, Spanien

Modtaget: 19. april, 2014 Accepteret: August 19, 2014; Udgivet den 30. september, 2014

Copyright: © 2014 Huang et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed:. Det forfattere bekræfter, at alle data, der ligger til grund resultaterne er fuldt tilgængelige uden restriktioner. Alle relevante data er inden for papir og dens Støtte Information filer

Finansiering: Denne undersøgelse blev støttet af National Nature Science Foundation of China, Grant nummer:. 30973449, 81172163, 81272515, 81272338, 81200706; National Key Sci-Tech Special Project Kina, Grant nummer: 2009ZX09103-642, 2013ZX09102053; Program for Doctoral Station i University, Grant nummer: 20120171110053, 20130171110053; Key Project of Nature Science Foundation i Guangdong-provinsen, Kina, Grant nummer: 10251008901000009; Key Sci-tech Forskningsprojekt i Guangdong-provinsen, Kina, Grant nummer: 2011B031200006; Guandong Natural Science Fund, Grant nummer: S2012010009250, S2012040006986; Key Sci-tech Forskningsprojekt i Guangzhou Kommune, Kina, Grant nummer: 2011Y1-00017-8, 12A52061519; Program for Young Underviser i University, Grant nummer: 10YKPY28; Changjiang Scholars og Innovative Research Team i University, antal:. 985 projekt PCSIRT 0947. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser: Den forfattere har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser.

Introduktion

Kirurgi, strålebehandling og kemoterapi er de primære kliniske tumor behandlinger. Men kirurgi og strålebehandling er ineffektive i metastatisk cancer; hvis kemoterapi bruges korrekt, kan metastaser hæmmes [1]. Med hensyn til anti-cancer lægemiddeludvikling, antracykliner er de mest effektive anti-cancer medicin [2]. Naturlige produkter fra havene er vigtige kilder til nye anti-cancer medicin [3]. Marine mikroorganisme metabolitter med unikke strukturer og farmakologiske aktiviteter anvendes typisk som førende antitumorforbindelser [4]. Anthraquinonforbindelser, såsom daunorubicin, doxorubicin, epirubicin og mitoxantron, er de mest effektive kliniske anticancerlægemidler [2]. Den marine anthraquinon SZ-685C undertrykker proliferation af human brystcancer [5] - [6] og human nasopharyngeal carcinoma (NPC) -celler [7]. Huang et al. påvist, at anthraquinoner fra rabarber, såsom emodin, aloe-emodin og rhein, inhiberer vækst og proliferation af forskellige cancerceller, såsom lunge adenocarcinom, myeloid leukæmi, neuroblastom, hepatocellulært carcinom, blærecancer og andre [8].

mekanismen af ​​antitumoraktiviteten af ​​anthraquinoner er primært involveret i følgende aspekter [9] - [10]: DNA interaktioner gennem binding, interkalerende og forstyrrende adskillelse af DNA dobbelt streng; direkte membran effekter; DNA beskadigelse i afhængighed af topoisomerase II hæmning eller generering af frie radikaler, såsom reaktive oxygenarter (ROS), og induktionen af ​​apoptose via topoisomerase II-inhibering, funktionelt p53 eller ROS-generering. Derudover anthraquinoner også udløse apoptose via JNK (c-Jun N-terminal kinase) [11], Akt /PKB (Protein Kinase B) [5], [12] og mitokondrielle pathways [13] - [14].

G503 er en anthraquinonforbindelse isoleret fra de sekundære metabolitter mangrove endofytisk svamp nr 1403 fra det Sydkinesiske Hav [15] .Men uanset G503 har anticancer potentiale som en anthraquinonforbindelse er ikke undersøgt. Derfor blev nærværende undersøgelse designet til at belyse den anti-tumor aktivitet G503 og den underliggende mekanisme involveret.

Materialer og metoder

Kemikalier og reagenser

3- (4 , 5-dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenylterazolium (MTT) og ROS scavenger N-acetyl-cystein (NAC) blev indkøbt fra Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA). Hochest 33342, carboxy-H2DCFDA, MitoProbe DiOC2 (3) Assay Kit og MitoProbe Transition Pore Assay Kit (M34153) blev opnået fra Invitrogen (USA). Annexin V-FITC (fluoresceinisothiocyanat) /PI (propidiumiodid) Apoptose Detection Kit blev købt fra Keygen (Nanjing, Jiangsu, Kina). RPMI1640 medium og føtalt bovint serum (FBS) var fra Hyclon (Logan, UT, USA ).
Caspase-8 inhibitor Z-IETD-FMK, caspase-9-hæmmer Z-LEHD-FMK og caspase-familie-hæmmer Z-VAD-FMK var fra Calbiochem (Gibbstown, NJ, USA) og Beyotime (CHINA). Antistoffer mod caspase-3, caspase-4, caspase-8, caspase-9 og COXIV antistof var fra Cell Signaling Technology (Beverly, MA, USA). Antistoffer mod cytochrom c
, Bax, Bcl-2, p38, p-p38 og anti-gede-IgG-HRP var fra Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA). Muse anti-β-actin og anti-GAPDH primære antibodywere fra Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA). Anti-kanin-IgG-peroxidase og anti-muse-IgG-peroxidase var fra Vector (Burlingame, CA, USA) .Mitochondria isolation kit blev indkøbt fra Pierce (Pierce, IL, USA), proteinassaykit blev indkøbt fra Bio-Rad (Hercules , CA, USA), og ECL afsløring kit var fra Applygen Technologies Inc (Beijing, Kina).

gæring, ekstraktion og isolering af G503 fra Nigrospora
sp. No. 1403

NO.1403 blev isoleret fra råddent træ af Kandeliacandel
(L.) Druce og reidentified som Nigrospora
sp. (Genebank tiltrædelse nummer: HQ891110), indsamlet fra Mai Po, Hong Kong, og en salt sø i Bahamas. G503 blev isoleret og oprenset fra de sekundære metabolitter af NO. 1403 [15]. Starterkulturer blev holdt på majsmel havvand agar. Propper af agar understøtter mycelievækst blev skåret og overført aseptisk til en 250 ml Erlenmeyer-kolbe indeholdende 100 ml flydende medium (glucose 10 g /l, pepton 2 g /l, gærekstrakt 1 g /l, NaCl _{2 g /L, pH D 7,0). Kolben blev inkuberet ved 28 ° C. Efter rystning på et roterende rysteapparat i 3-5 dage, blev myceliet aseptisk overført til en 500 ml Erlenmeyer-kolbe indeholdende flydende kultur (200 ml). Kolben blev derefter inkuberet ved 28 ° C i 25 dage.}

Kulturerne (150 L) blev filtreret gennem osteklæde. Filtratet blev koncentreret til 5 L under 50 ° C og ekstraheret tre gange ved rystning med et tilsvarende volumen ethylacetat. De samlede organiske ekstrakter blev underkastet en silicagelsøjle og elueret med en gradient af petroleumsether til ethylacetat til opnåelse af forbindelsen.

Forbindelsen blev opløst i dimethylsulfoxid (DMSO) ved en stamkoncentration på 50 mmol /L og fortyndet til specifikke koncentrationer før brug

Cell kultur

HUVEC'er blev isoleret fra de humane umbilical vene snore normale parturitions og kultiveret efter en protokol beskrevet tidligere [16] -. [ ,,,0],17]. Chang leverceller og tumorcellelinier Hone-1, CNE-2, 5-8F, HepG2, B7402, Rb, PC3, A549 og SGC7901, AGS blev opretholdt ved vores laboratorium og dyrket i RPMI1640-medium suppleret med 10% FBS, 100 U /ml streptomycin og 100 U /ml penicillin (Gibco) ved 37 ° C i en fugtig atmosfære af 5% CO _{2. Denne undersøgelse er i overensstemmelse med principperne i Helsinki-erklæringen, der er godkendt af Medical Ethics Committee of Sun Yat-Sen University, og skriftligt informeret samtykke blev opnået fra donoren.}

Cell levedygtighed assay

celler blev podet ved en densitet på 2 x 10 ^{4 celler /ml i plader med 24 brønde (HUVEC'er blev podet i gelatineovertrukne plader med 24 brønde). Når cellerne opnåede en densitet på 60% -70%, blev de behandlet med forskellige koncentrationer af G503 i 48 timer i RPMI1640 medium (1 ml /brønd) uden FBS; de negative kontrolgrupper blev behandlet med PBS. Efterfølgende blev 100 pi MTT (5 mg /ml) opløst i PBS tilsat til hver brønd og inkuberet i yderligere 4 timer for at tillade dannelse af formazancrystals. Krystallerne blev opløst i 1 ml DMSO i hver brønd. Den optiske densitet (OD) værdier af den violette opløsning, der repræsenterede cellelevedygtighed blev målt ved 570 nm [18] - [19]. Efter tre uafhængige forsøg, blev celle overlevelse ved hjælp af følgende formel: overlevelse (%) = (middelværdi eksperimentel OD-værdi /betyde kontrol OD-værdi) × 100%. Værdierne blev udtrykt som 50% inhiberende koncentration (IC _{50), der blev beregnet ved regressionsmetode i det lineære område.}}

Hoechst 33342-farvning-assay

SGC7901 celler blev udpladet i 6-brønds plader ved en densitet på 10 ^{5 celler per brønd og behandles med G503 koncentrationer fra 0 mmol /l til 40 mmol /l i 24 timer. Cellerne blev mærket med 10 ug /ml Hoechst 33342 [20] i 10 minutter ved 37 ° C og observeret ved anvendelse af fluorescensmikroskopi (Olympus X71-A12FL /PH).}

Annexin V-FITC /PI-farvning-assay

SGC7901 celler blev opsamlet ved en tæthed på 5 x 10 ^{5 til 5 × 10 6 /ml efter G503 behandling i koncentrationer fra 0 mmol /l til 40 mmol /l i 24 timer i 6-brønds plader; celler behandlet med 25 mmol /l colchicin blev anvendt som positiv kontrol. Cellerne blev derefter vasket og farvet i overensstemmelse med producentens anvisninger (Annexin V-FITC /PI Apoptose Detection Kit). Kort fortalt blev cellerne resuspenderet i 500 pi 1 × bindende buffer. Dernæst blev 5 pi AnnexinV-FITC og 5 pi 20 ug /ml PI tilsættes til prøven og inkuberes ved stuetemperatur i 15 minutter i mørke. De farvede prøver blev derefter vurderet ved flowcytometri (Becton Dickinson, NJ, USA) for at identificere apoptotiske celler.}

Bestemmelse af mitokondrisk membranpotentiale Salg

SGC7901 celler blev udpladet i 6-brønds plader. Efter opnåelse af en densitet på 60%, blev cellerne behandlet med 20 mmol /l G503 i 18 timer og derefter opsamlet for at vurdere det mitokondrielle membranpotentiale ifølge producentens anbefalinger (MitoProbe DiOC2 (3) Assay Kit). Kort fortalt blev 1 × 10 ^{6 /ml celler resuspenderes i 37 ° C PBS. De positive kontrolgrupper blev forbehandlet med 1 pi 50 mmol /l CCCP ved 37 ° C i 5 min. Alle grupper blev derefter behandlet med 5 pi 10 pmol /L DiOC _{2 (3) i 30 minutter ved 37 ° C og vurderet ved flowcytometri. Den mitochondriemembranpotential blev beregnet på grundlag af følgende ligning:. Mitokondrie membran potentiale = (rød fluorescens intensitet) /(grøn fluorescens intensitet)}}

Detection åbningen af ​​mitokondrier permeabilitet Transition Pore (MPTP)

SGC7901 celler blev udpladet i 6-brønds plader. Efter opnåelse af en densitet på 60%, blev cellerne behandlet med 20μmol /L G503 i 18 timer og opsamlet for at vurdere MPTP åbning ved flowcytometri (Becton Dickinson, NJ, USA) ifølge producentens protokol (MitoProbe Transition Pore Assay Kit). Kort fortalt blev hver prøve delt i 3 portioner og behandlet som følger: aliquot 1 blev behandlet med 5 pi 2 pmol /L Calcein AM i mørke; portion 2 blev behandlet med 5 pi Calcein AM og 5 pi 80 mmol /l CoC _{2 i mørke; og portion 3 blev behandlet med 5 uL Calcein AM, 5 uL CoC 2 og 5 pi 100 mmol /l ionomycin. De prøver blev derefter inkuberet ved 37 ° C i 15 minutter i mørke. Efter at være blevet vasket med HBSS /Ca ^{2+ og re-suspenderet i 400 pi HBSS /Ca 2+ blev cellerne bedømt ved flowcytometri løbet af 1 time. MPTP åbning tilstand beregnes som følger: (fluorescens af alikvot 2- fluorescensen af ​​aliquot 3) /(fluorescensen af ​​alikvot 1- fluorescensen af ​​aliquot 3). Calcein AM trænger cytoplasmaet og organeller herunder mitokondrier. CoCl 2 slukker Calcein AM fluorescens i cytoplasmaet, men ikke i mitokondrierne. Calcein AM translokerer til cytoplasmaet fra mitokondrierne når MPTP åbnes, og fluorescensen dæmpes ved CoCl 2.}}

Isolering af celle mitokondrier og cytoplasma

SGC7901 celler blev udpladet i 100-mm plader; hver gruppe blev udpladet i to plader. Efter at have opnået 60% -70% konfluens, blev cellerne behandlet med eller uden 20 pmol /L G503 i 18 timer. Efter behandling blev mitochondriale og cytoplasmiske fraktioner opnået ifølge producentens instruktioner (Mitokondrier isolation kit).

Western blotting-analyse

Som tidligere beskrevet blev cellerne lyseret i RIPA-buffer [21] . Protein- koncentrationer af mitokondrier, cytoplasmaet og helcelle blev detekteret ved BCA-metoden ved anvendelse af Bio-Rad protein assay kit. I alt blev 60 ug proteiner fra hver gruppe er adskilt med 12% eller 15% natriumdodecylsulfat-polyacrylamidgelelektroforese (SDS-PAGE). Proteinerne fra SDS-PAGE blev overført til en PVDF-membran. Efter de specifikke bindingssteder for membranerne blev blokeret i 1-2 timer ved stuetemperatur med TBST-buffer indeholdende 10% fedtfri mælk blev membranerne inkuberet natten over ved 4 ° C med primære antistof i henhold til producentens anvisninger. De sekundære antistoffer med eller uden fluorescens konjugeret til de relevante primære antistoffer blev inkuberet i 2 timer ved stuetemperatur. Membranerne med fluorescerende sekundære antistoffer blev vurderet ved anvendelse af Odyssey-system (Li-COR, Nebraska, USA) for at scanne de fluorescerende bånd [22], og membranerne med normale sekundære antistoffer blev visualiseret under anvendelse af ECL påvisning kit til immunblots. Membranerne blev strippet og re-probet med β-actin eller COXIV antistoffer. β-actin blev anvendt som intern standard for det samlede cellelysat og cytoplasmiske ekstraktioner, hvorimod COXIV blev anvendt som kontrol for mitokondrie ekstraktioner. Densitometrisk analyse af bånd blev udført ved anvendelse Mængde One (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) [23].

Statistisk analyse

Alle data blev præsenteret som middelværdi ± SD mindst tredobbelte bestemmelser . SPSS 13.0 software blev anvendt til t-test og envejs variansanalyse (ANOVA) i alle statistiske analyser. En P Drømmeholdet værdi 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant i alle tilfælde.

Resultater

G503-medieret hæmning på proliferation er den mest potente i SGC7901 celler blandt de 11 celle undersøgte linier

Vi bruges MTT-assayet til bestemmelse af, om anthraquinonforbindelsen G503 er cytotoksisk i de følgende cellelinier: to normale cellelinier (Humane navlevene-endotelceller (HUVEC'er) og Chang leverceller og ni tumorcellelinier (HONE -1, CNE-2, 5-8F, HepG2, B7402, Rb, PC3, A549 og SGC7901). Alle celler blev inkuberet med 0, 2,5, 5, 10, 20 eller 40 pmol /L G503 i 48 timer. Cell levedygtighed blev målt under anvendelse af MTT-assayet som bemærket, og IC _{50 værdi for SGC7901 celler var den laveste, mens IC 50 værdier for de normale cellelinier, HUVEC og Chang leverceller, var signifikant større end SGC7901 ( tabel 1).}

G503 inducerer apoptose i SGC7901 og AGS gastriske cancerceller

i betragtning af at SGC7901 cellelinie var den mest følsomme over for G503 af de elleve cellelinier undersøgt (tabel 1), vi yderligere undersøgt denne cellelinie særskilt. SGC7901 celler blev farvet med Hoechst 33342 for at bestemme, om den inhiberende virkning var relateret til apoptose. Resultaterne indikerer en stigning i antallet af celler, som viser nuklear svind og chromatinkondensering med stigende G503 koncentrationer (figur 1A). Desuden at undersøge om G503 inducerer apoptose i andre gastrisk cancer cellelinjer blev AGS gastriske cancerceller også undersøgt. Annexin V /PI farvning blev ansat til at analysere virkningerne af G503 i SGC7901 og AGS gastriske kræftceller ved flowcytometri. Til disse eksperimenter blev 25 pmol /L colchicin anvendt som positiv kontrol. Efter behandling med 0 pmol /l, 2,5 pmol /l, 5 pmol /L, 10 pmol /l, 20 pmol /L og 40 pmol /L G503 og 25 pmol /L colchicin i 24 timer, procentdelen af ​​apoptotiske SGC7901 celler 5,625% ± 0,50%, 6,19% ± 0,13%, 10,25% ± 0,47%, 16,99% ± 1,73%, 25,72% ± 0,55%, 31,03 ± 1,03% og 20,69% ± 1,91% henholdsvis (figur 1 B); procentdelen af ​​apoptotiske AGS celler var 15,37% ± 2,36%, 19,30% ± 4,45%, 22,72% ± 4,89%, 24,93% ± 4,76%, 30,44% ± 9,42%, 47,51% ± 18,29% og 31,49% ± 2,45% henholdsvis (figur 1C). Påvisningen af ​​apoptose i AGS celler og ovenstående resultater viste, at G503 inducerer gastrisk cancercellelinie apoptose på en dosis-afhængig måde.

G503 inducerer apoptose i en caspase-afhængig måde

For yderligere at undersøge involveret i G503-induceret apoptose i gastriske cancerceller mekanisme, studerede vi SGC7901 celler. Caspase-3 er et effektor caspase, der kan komme ind kerne og gælder interagere med dets substrat, og derved fremme celle apoptose [24]. Caspse-9 er initiatoren caspase der aktiverer caspse-3 [25]. Cellerne blev behandlet med forskellige G503 koncentrationer for angivne tidspunkter og opsamlet for at vurdere caspase-3 og -9 ved Western blotting. Ekspressionen af ​​caspase-3 precursor faldt på en dosis- og tidsafhængig måde, hvorimod caspase-3 spaltningsfragmenter steg på en dosis- og tidsafhængig måde (Figur 2A, B). Ekspressionen af ​​caspase-9 precursor også faldet og spaltningsfragmenter steget efter at cellerne blev behandlet med 20 mmol /l G503 i 24 timer (Figur 2C). Disse effekter er afskaffet ved pan-caspaseinhibitoren Z-VAD-FMK (figur 2C, D). Overensstemmelse med aktiveringen af ​​caspase-9 og -3, de apoptotiske celle satser inducerede induceret af 20 pmol /L G503 i SGC7901 celler blev tydeligt reduceret efter forbehandling med Z-VAD-FMK (Figur 2E). Disse data antydede, at G503 inducerer apoptose i SGC7901 celler i et caspase-afhængig måde.

G503-induceret apoptose ikke afhænger af caspase-8

For at undersøge om døden receptormedieret apoptosecyklus induceres af G503, studerede vi caspase-8, initiatoren caspase død receptormedieret apoptotiske vej [26]. SGC7901 celler blev behandlet med forskellige doser af G503 for angivne tider. Cellerne blev opsamlet til måling caspase-8 ved Western blotting. Resultaterne viste, at caspase-8 precursor faldt og spaltes caspase-8 steg på en tids- og dosisafhængig måde (figur 3A, B). Cellerne blev forbehandlet med 20 pmol /L caspase-8 inhibitor Z-IETD-FMK i 30 minutter og derefter behandlet med 20μmol /L G503 i 24 timer. Caspase-8 proform steg i celler co-behandlet med caspase-8 inhibitor og G503 sammenlignet med celler behandlet med G503 kun. Men den caspase-9 proform, spaltet caspase-9 og caspase-3 blev holdt på tilsvarende niveauer i celler behandlet med caspase-8 inhibitor og G503 eller G503 alene (figur 3C). I overensstemmelse med figur 3C, G503-induceret apoptotiske celle satser i SGC7901 celler blev ikke reduceret ved forbehandling med Z-IETD-FMK (figur 3D). Disse data tydede på, at på trods af aktivering af G503 er caspase-8 ikke er involveret i pro-apoptotisk aktivitet G503.

G503-induceret apoptose er afhængig af caspase-9

Caspase-9, initiatoren caspase af mitokondrie apoptotiske vej, kan aktiveres ved at kombinere med cytochrom c
(Cyto c
) og apoptotisk protease-aktiverende faktor-1 (Apaf-1) [25] - [26]. For yderligere at undersøge, hvorvidt det mitokondriske pathway er involveret i G503-induceret apoptose, blev aktiveringen af ​​caspase-9 undersøgt efter G503 behandling ved forskellige koncentrationer og tidspunkter. Desuden blev den apoptotiske celle sats også målt ved samtidig behandling med G503 og caspase-9-inhibitor Z-LEHD-FMK. Resultaterne indikerede, at caspase-9 proform faldt og spaltningsfragmenter steg på en tids- og dosisafhængig måde (figur 4A, B). Dernæst blev cellerne forbehandlet med 20 pmol /L Z-LEHD-FMK i 30 minutter og co-inkuberet med 20 pmol /L G503 i 24 timer. For at kvantificere de apoptotiske celler, blev cellerne farvet med AnnexinV /PI og analyseret ved flowcytometri. Resultaterne indikerede, at den apoptotiske celle faldt, når cellerne blev co-behandlet med Z-LEHD-FMK og G503 (figur 4C). Samlet set viser disse data viste, at G503-induceret SGC7901 celle apoptose afhænger af caspase-9-aktivering.

G503 inducerer apoptose via den mitokondriske apoptotiske vej

Det er velkendt, at den mitokondriske pathway er en vigtig apoptotiske vej. For at undersøge om G503 inducerer apoptose via mitokondrielle pathway, undersøgte vi apoptose-relaterede proteiner, den mitokondrielle membranpotentiale (MMP), og åbningen af ​​MPTP at bekræfte induktionen af ​​mitokondrie apoptotiske vej. Følg efter G503 behandling, mitokondriel fluorescens faldt sammenlignet med kontrolgruppen (figur 5A), hvilket antyder, at MPTP blev åbnet af G503. Som vist i figur 5B, blev betydelig rød /grøn fluorescensintensitet observeret i kontrolgruppen. Men efter behandling med 20 pmol /L G503, blev rød /grøn fluorescensintensitet reduceret. Dette resultat antydede, at G503 nedsætter mitokondrielle membranpotentiale af SGC7901 celler. Desuden alt Cyto c
protein niveauer ikke især skifte mellem kontrolgruppen og narkotika gruppe; dog Cyto c
blev relocalized til cytoplasmaet fra mitokondrierne (figur 5C). Bax og Bcl-2 er afgørende faktorer i reguleringen af ​​mitokondrielle kanaler og frigivelse af forskellige apoptose-relaterede proteiner [27]. Derfor Vi undersøgte fordelingen af ​​Bax og Bcl-2 i forskellige cellulære rum og ikke observere en fremtrædende ændring i det totale protein niveauer af Bax og Bcl-2 mellem betjeningsorganet og narkotika-gruppe; dog G503 fremmet translokationen af ​​Bax fra cytoplasmaet til mitokondrierne samt translokationen af ​​Bcl-2 fra mitokondrierne til cytoplasmaet (figur 5D). Tilsammen G503 inducerer apoptose i SGC7901 celler via den mitokondrielle pathway.

G503 inducerer apoptose i SGC7901 celler dels gennem caspase-4-aktivering

Caspase-4 kan direkte aktivere caspase-9, men ikke gennem den mitokondriske pathway [28] - [29]. For at undersøge om caspase-4 aktiveres af G503 og hvorvidt aktiverede caspase-4 aktiverer caspase-9, vi undersøgte spaltningsfragmenter af caspase-4 og -9. Resultaterne indikerede, at caspase-4 spaltningsfragment signifikant forøget i celler behandlet med G503 sammenlignet med kontrolgruppen (figur 6A). Behandling med caspase-4 inhibitor Z-LEVD-FMK forøgede caspase-9 proform, som ikke blev detekteret i G503 behandlingsgruppe (figur 6B). Disse resultater viste, at G503 inducerer SGC7901 mavekræft celle apoptose dels gennem aktivering af caspase-4.

Diskussion

Det forlyder, at s
-quinon del af quinon holdige molekylære spiller en meget vigtig rolle i anti-cancer potentiale [30]. Perchellet et al. fandt også, at p-quinon J4, o-quinon J1 og substitueret model p-quinon J7 reduceret mest L1210 tumor celle levedygtighed blandt otte forbindelser syntetiseret og screenet i deres indledende undersøgelse [31]. At forstå forholdet mellem den anti-cancer potentiale altersolanol A og struktur-aktivitet, Teiten et al. evaluerede effekten af ​​altersolanol A og dens relaterede anthracen derivater: tetraacetylaltersolanol A, tetrahydroaltersolanol B og ampelanol. De fandt, at kun altersolanol A og dens acetyleret derivat tetraacetylaltersolanol En gave en cytotoksisk virkning på K562-celler, mens derivater med reduktion af en af ​​carbonylgrupper, såsom tetrahydroaltersolanol B og ampelanol, har ingen effekt [32]. s
-quinon struktur G503 (figur S1) kan også bidraget til kræftcellen apoptose, og i det næste forskning vil vi analysere G503 og dets derivater til at identificere den foreløbige struktur-aktivitet relationer. I denne undersøgelse finder vi, at den gastriske cancercellelinie SGC7901 er den mest G503-sensitive cancercellelinie undersøgt under anvendelse af et celleviabilitetstest i ni cancercellelinier og to normale cellelinier. G503 inducerer SGC7901 mavekræft celledød via apoptose på en dosis-afhængig måde. En anden gastrisk cancer cells AGS er også undersøgt, og er følsom over for G503-induceret apoptose samt. Som et resultat, 20 pmol /L G503 er den optimale koncentration, der inducerer svær apoptose.

Det humane genom koder for mindst 10 typer af caspase homologer. Følgende caspase homologer deltage i apoptose: Caspase-2, -3, -8, -9 og -10 [33]. Selvom caspaser spiller en rolle i apoptose, er der eksisterer forskellige caspase uafhængige veje. For eksempel i nærvær af caspaseinhibitorer, tumornekrosefaktor (TNF) inducerer celle nekrose, som har den egenskab af apoptose og nekrose [34] - [36]. Desuden apoptoseinducerende faktor (AIF) er et DNA enzym, der direkte nedbryder DNA. Når mitochondriemembranpotential ændres, er AIF frigives til cytoplasmaet fra mitokondrier og aktiveres af dens interaktion med cyclophilinA [37] - [38]. Endo G kan også forringe DNA direkte i et caspase-uafhængig måde [39].

I vores undersøgelse G503 eksponering aktiverer caspase-3, -8 og -9 på en dosis- og tidsafhængig måde (figur 2A, B; 3A, B; 4A, B). Er G503-induceret apoptose afhængig af caspaser? Når celler blev co-behandlet med Z-VAD-FMK og G503, Z-VAD-FMK inhiberer caspase-9 og -3 aktivering (figur 2C, D), og antallet af apoptotiske celler induceret af G503 faldt (figur 2E), derved indikerer, at G503-induceret SGC7901 celle apoptose er caspase-afhængig. At skelne, om G503-induceret apoptose afhænger af caspase-8, -9 eller begge, blev SGC7901 celler forbehandlet med Z-IETD-FMK og Z-LEHD-FMK og derefter co-behandlet med G503. Resultaterne indikerer, at Z-IETD-FMK ikke hæmmer caspase-9 og -3 aktivering (figur 3C) eller formindske antallet af apoptotiske celler induceret af G503 (figur 3D); dog Z-LEHD-FMK faldt antallet af apoptotiske celler (Figur 4C). Således G503-induceret SGC7901 celle apoptose er ikke afhængig af caspase-8, men er på caspase-9.

mitokondrier består af en ydre membran, membran plads og matrix. Apoptose-relaterede proteiner, såsom caspase proenzymer, Cyto c
og AIF findes i membranen rummet. Men når porerne er dannet i den ydre mitokondriske membran eller permeabiliteten ændres, er disse apoptose-relaterede proteiner frigivet til cytoplasmaet. Medlemmer af Bcl-2-familien styrer permeabiliteten af ​​den ydre mitokondriske membran, og kan opdeles i to medlemmer, der fremmer apoptose (såsom Bax og Bak) eller inhibere apoptose (såsom Bcl-2 og Bcl-XL). De pro-apoptotiske medlemmer fremmer frigivelsen af ​​apoptose-relaterede proteiner, såsom Cyto c
, fra mitokondrierne, mens de anti-apoptotiske medlemmer har en modsat effekt [40]. Bax eksisterer primært i cytoplasmaet, hvorimod Bcl-2 kombinerer med hydrofobe grupper ved C-terminalen af ​​cellens bio-membran [41]. Bax struktur ændres under ekstern stress, så det kombinerer med den ydre mitokondrielle membran tospontaneously danne et galleri af homolog oligomerisering. Denne handling inducerer frigivelsen af ​​apoptose-relaterede proteiner [42] eller dannelse af mitokondrierne permeabilitetsovergang Pore (MPTP), der består af spændingsafhængige anion kanal (VDAC) på den ydre mitokondriske membran og adeninnukleotid translokatoren (ANT) på den indre membran [43]. Bax kun interagerer med VDAC at skabe en åben pore når Bax koncentrationerne lave. I modsætning hertil Bax samtidigt interagerer med VDAC og ANT når Bax koncentrationer er høj for at åbne porerne i den indre og ydre membran. Det reducerer den indre membran potentiale, forøger det osmotiske tryk i den mitokondriske matrix, fremmer indre membran hævelse og øger det osmotiske tryk af den ydre membran og dermed fremme frigivelsen af ​​apoptose-relaterede proteiner [26], [44] - [46 ]. Et vigtigt skridt i mitokondrie apoptosecyklus er udgivelsen af ​​Cyto c
[47] - [49]. CYTO c
kombinerer med Apaf-1 og caspase-9 proform at oprette apoptosome. Apaf-1 blotlægger sit oligomerisering domæne og den N-terminale caspaseaktivering og rekruttering domæner (CARD) kombinerer med caspase-9 proform CARD. Således er caspase-9 aktiveres, og det aktiverede caspase-9 spalter downstream caspaser, såsom caspse-3 og -7. Effektorcellerne caspaser vinder spalte deres tilsvarende substrater til at inducere celle apoptose [47], [49] - [50].

I denne undersøgelse G503 øger andelen af ​​Bax /Bcl-2 på den mitokondriske membran og falder Bax /Bcl-2-forhold i cytoplasmaet (figur 5D). G503 fremmer også MPTP åbning og reduktion af det mitokondrielle membranpotentiale (figur 5A, B). Derefter Cyto c
blev overført fra mitokondrierne til cytoplasmaet (figur 5C). Desuden G503 fremmer overførslen af ​​Bax til mitokondrierne fra cytoplasmaet og Bcl-2 til cytoplasmaet fra mitokondrierne. Øget Bax og reduceret Bcl-2 i mitokondrier øge gennemtrængningen af ​​den mitokondriske ydre membran og fremmer frigivelsen af ​​Cyto c
. kan observeres Reguleringen af ​​Bax /Bcl-2 ved G503 fordi G503 er en lille molekylforbindelse. Det er muligt, at G503 direkte trænger ind i celler og kombinerer med Bax og Bcl-2 for at ændre deres strukturer, hvorved Bax binding til den ydre mitochondriemembran og Bcl-2-frigivelse fra mitokondrier.

Flere undersøgelser har vist, at ROS-generering er afgørende for anthraquinon-induceret apoptose i cancerceller [51] - [52]. ROS er en potent inducer af oxidation skade, der kan resultere i basepar oxidation samt depurineret og aldehydisk DNA [44], [46], [48], på trods af denne skade kan counter afbalanceret antioxidanter, hvis ekspression medieres af Toll

• PLoS ONE: Ekspression af XPG Protein i Udvikling, Progression og Prognose for Gastric Cancer
• PLoS ONE:. Kirurgiske Resultater og prognostiske faktorer af T4 mavekræft Patienter uden Distant Metastasis