Конкурирующие интересов: авторы заявили, что не существует никаких конкурирующих интересов.
Введение
<р> хирургия, лучевая терапия и химиотерапия являются основными клиническими лечения опухолей. Тем не менее, хирургическое вмешательство и лучевая терапия являются неэффективными в метастатического рака; если химиотерапия используется должным образом, метастазирование может быть подавлено [1]. Что касается развития противоракового препарата, антрациклины являются наиболее эффективными препаратами против рака [2]. Натуральные продукты из океанов являются важными источниками новых противораковых препаратов [3]. Морские микроорганизм метаболиты с уникальными структурами и фармакологической активности, как правило, используются в качестве ведущих соединений противоопухолевых [4]. Антрахинон соединения, такие как даунорубицин, доксорубицин, эпирубицин и митоксантрон, являются наиболее эффективными клиническими противораковых препаратов [2]. Морская антрахинона SZ-685C подавляет пролиферацию рака молочной железы человека [5] - [6] и карцинома носоглотки человека (NPC) клетки [7]. Хуанг и др. показали, что антрахиноны из ревеня, такие как эмодин, алоэ-эмодина и реин, подавляют рост и пролиферацию различных раковых клеток, таких как аденокарцинома легкого, миелолейкоз, нейробластома, гепатоцеллюлярный рак, рак мочевого пузыря и другие [8].
<р> механизм противоопухолевой активности антрахинонов в основном участвуют в следующих аспектах [9] - [10]: ДНК взаимодействия путем связывания, интеркаляции и мешая разделение ДНК двойной цепи; прямые мембранные эффекты; Повреждение ДНК в ответ на топоизомеразы II ингибирование или образование свободных радикалов, таких как активных форм кислорода (ROS), и индукцию апоптоза через топоизомеразы II торможения, функционального р53 или генерации активных форм кислорода. Кроме того, антрахиноны также запускать апоптоз через JNK (C-Jun N-концевой киназы) [11], РКВ /Akt (протеинкиназа В) [5], [12] и митохондриальные пути, [13] - [14].
<р> G503 представляет собой антрахинон соединение, выделенное из вторичных метаболитов мангровых эндофитная гриба № 1403 от Южно-Китайского моря [15] .Однако, обладает ли G503 противораковой потенциал как антрахиноновой соединения не исследовалась. Таким образом, данное исследование было разработано, чтобы выяснить противоопухолевую активность опухоли G503 и основной механизм вовлечен.
Химические вещества и реагенты ферментацию, экстракцию и выделение G503 из Nigrospora Клеточная культура Определение митохондриального мембранного потенциала SGC7901 клетки высевали в 6-луночные планшеты. При достижении плотности 60%, клетки обрабатывали с 20 мкмоль /л G503 в течение 18 ч и затем собирали для оценки митохондриального мембранного потенциала в соответствии с рекомендациями производителя (MitoProbe DiOC2 (3) набора для анализа). Вкратце, 1 × 10 6 /мл клетки ресуспендировали в 37 ° C PBS. Положительные контрольные группы были предварительно обработаны с 1 мкл 50 ммоль /л CCCP при 37 ° С в течение 5 мин. Все группы были затем обрабатывали 5 мкл 10 мкмоль /л DiOC <суб> 2 (3) в течение 30 мин при 37 ° С и оценивали с помощью проточной цитометрии. Потенциал митохондриальных мембран была рассчитана на основе следующего уравнения:. Митохондриального мембранного потенциала = (красный интенсивность флуоресценции) /(зеленая интенсивность флуоресценции) Обнаружение открытие митохондриальной Проницаемость Transition Pore (МРТР) G503-опосредованного ингибирования на пролиферацию является самым мощным в SGC7901 клетках среди 11 исследованных клеточных линий G503 индуцирует апоптоз в SGC7901 и AGS клеток рака желудка
<р> 3- (4 , 5-диметилтиазол-2-ил) -2,5-diphenylterazolium бромида (МТТ) и РОС поглотитель N-ацетил-цистеин (NAC) были приобретены у компании Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA). Hochest 33342, карбокси-H2DCFDA, MitoProbe DiOC2 (3) набора для анализа и MitoProbe Переходный Поры набора для анализа (M34153) были получены из компании Invitrogen (США). Аннексина V-FITC (изотиоцианат флуоресцеина) /PI (пропидий йодид) Апоптоз обнаружения Kit был приобретен у Keygen (Нанкин, провинция Цзянсу, Китай). Среда RPMI1640 и эмбриональной телячьей сыворотки (FBS) были из Hyclon (Logan, UT, США ).
Каспазы-8 ингибитором Z-IETD-ФМК, каспазы-9 ингибитор Z-LEHD-ФМК и каспазы-семьи ингибитор Z-VAD-FMK были из Calbiochem (Gibbstown, Нью-Джерси, США) и Beyotime (Китай). Антитела против каспазы-3, каспазы-4, каспазы-8, каспазы-9 и COXIV антитела были из Cell Signaling Technology (Беверли, штат Массачусетс, США). Антитела против цитохрома с
, Bax, Bcl-2, р38, р-р38 и анти-коза LGG-HRP были из Santa Cruz Biotechnology (Санта-Круз, Калифорния, США). Мышиное анти-β-актина и анти-GAPDH, первичный antibodywere от компании Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA). Анти-кроличий LGG-пероксидаза и анти-мышиного IgG-пероксидазой из вектора (Burlingame, CA, США) набор для выделения .Mitochondria была закуплена у Пирса (Pierce, IL, США), набор для анализа белка были закуплены у Bio-Rad (Геркулесовы , штат Калифорния, США), а также комплект обнаружения ЭСЛ были от Applygen Technologies Inc (Пекин, Китай).
зр. No. 1403
<р> NO.1403 был выделен из гнилой древесины Kandeliacandel
(L.) Друце и reidentified как Nigrospora
зр. (Номер Genebank вступление: HQ891110), собранный из Mai Po, Гонконг, и соленое озеро на Багамских островах. G503 был выделен и очищен от вторичных метаболитов NO. 1403 [15]. Стартовые культуры поддерживали на кукурузной морской воде агар. Втулки агар, поддерживающих рост мицелия были вырезаны и асептически переносят в колбу 250 мл Эрленмейера, содержащую 100 мл жидкой среды (глюкоза 10 г /л, пептон 2 г /л, дрожжевой экстракт 1 г /л, NaCl, <суб> 2 г /л, рН 7,0 D). Колбу инкубировали при 28 ° С. После встряхивания на ротационном шейкере в течение 3-5 дней, мицелий асептически переносили в 500 мл колбу Эрленмейера, содержащую культуральную жидкость (200 мл). Затем колбу инкубировали при 28 ° С в течение 25 дней
. <Р> Культуры (150 л) фильтруют через марлю. Фильтрат концентрировали до 5 л ниже 50 ° С и экстрагируют трижды встряхивают с равным объемом этилацетата. Объединенные органические экстракты подвергали хроматографии на колонке с силикагелем, и элюировали с градиентом петролейного эфира этилацетата с получением соединения.
<Р> Соединение растворяли в диметилсульфоксиде (ДМСО) при наличии концентрации 50 ммоль /л и разбавляют до определенных концентраций перед использованием
<р> HUVECs выделяли из пупочной вены человека шнурами нормальных parturitions и культивировали в соответствии с протоколом было описано ранее [16] -. [ ,,,0],17]. Chang клетки печени и опухолевых клеточных линий шлифовального бруска-1, НИК-2, 5-8F, HepG2, B7402, Rb, РС3, А549 и SGC7901, АГС поддерживались нашей лаборатории, и культивировали в RPMI 1640 среде, дополненной 10% FBS, 100 U /мл стрептомицина и 100 ед /мл пенициллина (Гибко), при 37 ° C в увлажненной атмосфере, содержащей 5% CO <суб> 2. Это исследование согласуется с принципами, изложенными в Хельсинкской декларации, утвержденной Комитетом по медицинской этике Сунь Ятсена университета им письменное информированное согласие было получено от донора.
Жизнеспособность клеток для анализа
<р> клетки высевали при плотности 2 × 10 4 клеток /мл в 24-луночные планшеты (HUVECs высевали в покрытых желатином 24-луночных планшетах). Когда клетки достигли плотность 60% -70%, они обрабатывали различными концентрациями G503 в течение 48 ч в среде RPMI1640 (1 мл /лунку) без FBS; отрицательные контрольные группы обрабатывали PBS. Затем 100 мкл МТТ (5 мг /мл), растворенного в PBS, добавляли в каждую лунку и инкубировали в течение еще 4 ч, чтобы обеспечить образование formazancrystals. Кристаллы растворяли в 1 мл ДМСО в каждую лунку. Оптическая плотность (OD) значения фиолетового раствора, которая представляла жизнеспособность клеток измеряли при 570 нм [18] - [19]. После трех независимых экспериментов, выживаемость клеток рассчитывали по следующей формуле: Выживание (%) = (среднее экспериментальное значение OD /среднее значение OD контроля) × 100%. Значения были выражены в виде ингибирующей концентрации 50% (IC <суб> 50), которая была рассчитана методом регрессии в линейном диапазоне.
Hoechst 33342 окрашивание анализа
<р> SGC7901 клетки высевали в 6-луночные планшеты при плотности 10 5 клеток на лунку и обрабатывали концентрациями G503 в пределах от 0 мкмоль /л до 40 мкмоль /л в течение 24 ч. Клетки метили 10 мкг /мл Hoechst 33342 [20] в течение 10 мин при 37 ° С и наблюдали с помощью флуоресцентной микроскопии (Olympus X71-A12FL /PH).
аннексина V-FITC /PI окрашивания для анализа
<р> SGC7901 клетки собирали при плотности 5 × 10 5 до 5 × 10 6 /мл после обработки G503 при концентрациях в пределах от 0 мкмоль /л до 40 мкмоль /л в течение 24 ч в 6-луночные планшеты; клетки, обработанные 25 мкмоль /л колхицина, использовали в качестве положительного контроля. Затем клетки промывали и окрашивали в соответствии с инструкциями изготовителя (аннексина V-FITC /PI Апоптоз Обнаружение Kit). В кратком изложении, клетки ресуспендировали в 500 мкл 1 × буфера для связывания. Затем 5 мкл AnnexinV-FITC и 5 мкл 20 мкг /мл PI добавляли к образцу и инкубировали при комнатной температуре в течение 15 мин в темноте. Затем образцы окрашивали оценивали с помощью проточной цитометрии (Becton Dickinson, штат Нью-Джерси, США), чтобы идентифицировать апоптотических клеток.
<р> SGC7901 клетки высевали в 6-луночные планшеты. При достижении плотности 60%, клетки обрабатывали 20μmol /л G503 в течение 18 ч и собирали для оценки МРТР отверстие с помощью проточной цитометрии (Becton Dickinson, штат Нью-Джерси, США) в соответствии с протоколом производителя (MitoProbe Переходный Поры набора для анализа). Если коротко, то каждый образец был разделен на 3 аликвоты и обрабатывают следующим образом: аликвоты 1 обрабатывали 5 мкл 2 мкмоль /л Кальцеин АМ в темноте; Аликвоту 2 обрабатывали 5 мкл кальцеина AM и 5 мкл 80 ммоль /л CoCl <к югу> 2 в темноте; и аликвоты 3 обрабатывали 5 мкл кальцеина AM 5 мкл CoCl <суб> 2 и 5 мкл 100 мкмоль /л иономицина. Аликвоты затем инкубировали при 37 ° С в течение 15 мин в темноте. После промывки с HBSS /Ca 2 + и повторно суспендировали в 400 мкл HBSS /Ca 2 + клетки оценивали с помощью проточной цитометрии в течение 1 ч. Условием открытия МРТР рассчитывается следующим образом: (флуоресценцию аликвоты 2- флуоресценцию аликвоты 3) /(флуоресценцию аликвоты 1- флуоресценцию аликвоты 3). Кальцеин AM проникает в цитоплазму и органеллы, включая митохондрий. CoCl <суб> 2 утоляет Кальцеин AM флуоресценцию в цитоплазме, но не в митохондриях. Кальцеин А.М. транслоцирует в цитоплазму из митохондрий при открытии МРТР, и флуоресценцию ослабляется CoCl <суб> 2.
Выделение клеток митохондрий и цитоплазмы
<р> SGC7901 клетки высевали в 100-мм пластины; каждая группа высевали на две тарелки. После достижения 60% -70% сплошности, клетки обрабатывали с добавлением или без 20 мкмоль /л G503 в течение 18 часов. После лечения, митохондриальные и цитоплазматические фракции были получены в соответствии с инструкциями изготовителя (набор для выделения Митохондрии).
Вестерн-блоттинг анализ
<р> Как было описано выше, клетки лизируют в буфере RIPA [21] , Концентрации белка митохондрий, цитоплазму и цельного клеточного были обнаружены методом BCA с использованием набора для анализа белка Bio-Rad. В общей сложности 60 мкг белка из каждой группы были разделены на 12% или 15% додецилсульфата натрия-электрофорез в полиакриламидном геле (SDS-PAGE). Белки из SDS-PAGE переносили на PVDF мембрану. После того, как сайты неспецифического связывания мембран блокировали в течение 1-2 ч при комнатной температуре с TBST буфером, содержащим 10% обезжиренное молоко, мембраны инкубировали в течение ночи при 4 ° C с первичным антителом в соответствии с инструкциями изготовителя. Вторичные антитела, с добавлением или без флуоресценции, конъюгированных с соответствующими первичными антителами, инкубировали в течение 2 ч при комнатной температуре. Мембраны с флуоресцентными вторичными антителами оценивали с использованием системы Odyssey (Li-Cor, Небраска, США) для сканирования флуоресцентные полосы [22], а мембраны с нормальными вторичными антителами были визуализированы с использованием набора для обнаружения ECL для иммуноблоттинга. Мембраны раздели и повторно зондировали с использованием бета-актина или COXIV антител. β-актина, использовали в качестве внутреннего стандарта для общего клеточного лизата и цитоплазматического извлечений, в то время как COXIV использовали в качестве контроля для митохондриальных извлечений. Денситометрический анализ полос проводили с использованием Количество One (Bio-Rad, Hercules, CA, США) [23].
Статистический анализ
<р> были представлены Все данные, как среднее значение ± SD, по крайней мере трех экземплярах определений , SPSS 13.0 Программное обеспечение использовали для Т-тест и одностороннего анализа Стьюдента дисперсии (ANOVA) во всех статистических анализов. A значение P
0,05 считалось статистически значимым во всех случаях.
Результаты
<р> Мы использовали МТТ анализ, чтобы определить, является ли соединение антрахинона G503 является цитотоксическим в следующих клеточных линиях: две нормальные клеточные линии (пупочной вены человека эндотелиальные клетки (HUVECs) и клетки печени Чанг и девять линий опухолевых клеток (HONE -1, НИК-2, 5-8F, HepG2, B7402, Rb, РС3, А549 и SGC7901). Все клетки инкубировали с 0, 2,5, 5, 10, 20 или 40 мкмоль /л G503 в течение 48 ч. Cell viabilities были измерены с помощью анализа МТТ, как уже отмечалось, и ИК <суб> 50 значение для SGC7901 клеток был самым низким, в то время как IC <суб> 50 значений для нормальных клеточных линий, HUVEC и Чанга клетки печени, были значительно больше, чем SGC7901 ( Таблица 1).
<р> Учитывая, что SGC7901 клеточная линия была наиболее чувствительной к G503 клеточных линий одиннадцати исследовали (Таблица 1), мы дополнительно исследовали эту клеточную линию отдельно. SGC7901 клетки окрашивали Hoechst 33342, чтобы определить, был ли ингибирующий эффект, связанный с апоптозом. Результаты указывают на увеличение числа клеток, воспроизводящих ядерной усадку и конденсацию хроматина с возрастающими концентрациями G503 (Рис. 1А) Кроме того, чтобы исследовать, индуцирует ли G503 апоптоз в других желудочных линиях раковых клеток, AGS Клетки рака желудка были также исследованы. Аннексина V /PI окрашивания использовали для анализа эффектов G503 в SGC7901 и AGS клеток рака желудка с помощью проточной цитометрии. Для этих экспериментов, 25 мкмоль /л колхицин использовали в качестве положительного контроля. После обработки 0 мкмоль /л, 2,5 мкмоль /л, 5 мкмоль /л, 10 мкмоль /л, 20 мкмоль /л и 40 мкмоль /л G503 и 25 мкмоль /л колхицином в течение 24 ч, процент апоптотических SGC7901 клеток были 5,625% ± 0,50%, 6,19% ± 0,13%, 10,25% ± 0,47%, 16,99% ± 1,73%, 25,72% ± 0,55%, 31,03 ± 1,03% и 20,69% ± 1,91%, соответственно (рис 1В); процент апоптотических AGS клеток были 15,37% ± 2,36%, 19,30% ± 4,45%, 22,72% ± 4,89%, 24,93% ± 4,76%, 30,44% ± 9,42%, 47,51% ± 18.29% и 31,49% ± 2,45%, соответственно, (Рисунок 1C). Обнаружение апоптоза в клетках AGS и выше результаты показали, что G503 вызывает клетку рака желудка апоптоз в зависимости от дозы образом.
G503 индуцирует апоптоз в каспазы-зависимым образом
<р> Для дальнейшего исследования механизм участвует в G503-индуцированного апоптоза в клетках рака желудка, мы изучали SGC7901 клетки. Каспазы-3 является эффекторных каспаз, которые могут ввести ядро и непосредственно взаимодействовать с субстратом, тем самым способствуя апоптоз клеток [24]. Caspse-9 является инициатором каспазы, который активирует caspse-3 [25]. Клетки обрабатывали различными концентрациями G503 в течение указанных промежутков времени и собирали для оценки каспазы-3 и -9 с помощью вестерн-блоттинга. Экспрессия предшественника каспазы-3 снизилась в дозы и зависимым от времени образом, в то время как фрагменты каспазы-3 спайности увеличилось в дозы и времени зависимым образом (рис 2А, В). Экспрессия предшественника каспазы-9, также уменьшается, и фрагменты расщепления увеличилась после того, как клетки обрабатывали с 20 мкмоль /л G503 в течение 24 ч (рис 2С). Эти эффекты отменены ингибитор пан-каспазы Z-VAD-FMK (рис 2C, D). В соответствии с активацией каспазы-9 и -3, частота апоптотических клеток, вызываемую индуцируется 20 мкмоль /л G503 в SGC7901 клеток заметно снижена после предварительной обработки с Z-VAD-FMK (рис 2E). Эти данные свидетельствуют о том, что G503 индуцирует апоптоз в клетках SGC7901 в каспазы-зависимым образом.
G503-индуцированного апоптоза не зависимо от каспазы-8
<р> Исследовать ли смерть рецептор-опосредованного пути апоптоза индуцируется G503, мы изучали активность каспазы-8, инициатор каспаз от смерти рецептор-опосредованного пути апоптоза [26]. SGC7901 клетки обрабатывали различными дозами G503 для указанных промежутков времени. Собирали клетки для измерения каспазы-8 с помощью Вестерн-блоттинга. Результаты показали, что активность каспазы-8 предшественник снизился и расщепляется каспазы-8 увеличилось в затрат времени и дозозависимо (рис 3а, б). Клетки предварительно обрабатывали ингибитором 20 мкмоль /л каспазы-8 Z-IETD-FMK в течение 30 мин, а затем обрабатывали 20μmol /л G503 в течение 24 ч. Каспазы-8 Proform увеличилось в клетках совместно обработанных ингибитором каспазы-8 и G503 по сравнению с клетками, обработанными только G503. Тем не менее, активность каспазы-9 Proform, расщепляется каспазы-9 и каспазы-3 поддерживали на том же уровне в клетках, обработанных ингибитором каспазы-8 и G503 или G503 в одиночку (рис 3C). В соответствии с фиг.3С, G503 индуцированных скоростей апоптотических клеток в SGC7901 клетках не были уменьшены за счет предварительной обработки с Z-IETD-FMK (Рисунок 3D). Эти данные свидетельствуют о том, что, несмотря на активации G503, каспазы-8 не участвует в проапоптотического активности G503.
G503-индуцированного апоптоза зависит от каспазы-9
<р> каспазы-9, инициатор каспаз митохондриального пути апоптоза, могут быть активированы путем объединения с цитохромом <ЕМ> C
(Цито <ЕМ> C
) и апоптическая протеазы фактора активации-1 (Apaf-1) [25] - [26]. Для дальнейшего исследования является ли митохондриальный путь вовлечен в G503-индуцированного апоптоза, активация каспазы-9 исследовали после обработки G503 при различных концентрациях и времени. Кроме того, апоптическая скорость клеток также измеряли при совместном лечении с G503 и каспазы-9 ингибитора Z-LEHD-FMK. Результаты показали, что активность каспазы-9 Proform уменьшилось и фрагменты расщепления увеличилась в затрат времени и зависимости от дозы (фиг.4А, В). Затем клетки были предварительно обработаны с 20 мкмоль /л Z-LEHD-FMK в течение 30 мин и совместно инкубируют с 20 мкмоль /л G503 в течение 24 ч. Для того, чтобы определить количество апоптотических клеток, клетки окрашивали AnnexinV /PI и анализировали с помощью проточной цитометрии. Результаты показали, что апоптическая скорость клеток уменьшается, когда клетки были совместно обрабатывали Z-LEHD-FMK и G503 (фиг.4С). Взятые вместе, эти данные свидетельствуют о том, что G503-индуцированный апоптоз клеток SGC7901 зависит от каспазы-9 активации.
G503 индуцирует апоптоз посредством митохондриального пути апоптоза
<р> Хорошо известно, что митохондриальный путь является важный путь апоптоза. Для того, чтобы исследовать, индуцирует ли G503 апоптоз через митохондриальный путь, мы исследовали апоптоз, связанные с белками, митохондриальный мембранный потенциал (ММР), а также открытие МРТР для подтверждения индукции митохондриального пути апоптоза. Последующие обработкой G503, митохондриальная флуоресценция снизилась по сравнению с контрольной группой (рис 5А), тем самым предполагая, что МРТР открыл G503. К тому же, как показано на фигуре 5В, значительная интенсивность красной /зеленой флуоресценции наблюдалась в контрольной группе. Тем не менее, после обработки 20 мкмоль /л G503, был уменьшен красный /интенсивность зеленая флуоресценция. Этот результат позволяет предположить, что G503 уменьшает митохондриальный мембранный потенциал SGC7901 клеток. Кроме того, общая Цито с
уровни белка не заметно меняться между контрольной и группой наркотиков; Тем не менее, Цито с
был relocalized в цитоплазму из митохондрий (рис 5C). Вах и Bcl-2 являются важными факторами в регуляции митохондриальных каналов и высвобождение различных связанных с апоптозом белков [27]. Поэтому мы изучали распределение Bax и Bcl-2 в различных клеточных отсеках и не наблюдали заметное изменение в уровни общего белка Вах и Bcl-2 между контрольной и группой наркотиков; Тем не менее, G503 способствует транслокацию Bax из цитоплазмы в митохондрии, а также транслокации белков Bcl-2 из митохондрий в цитоплазму (рис 5D). Взятые вместе, G503 индуцирует апоптоз в клетках SGC7901 через митохондриальный путь.
G503 индуцирует апоптоз в клетках SGC7901 частично за счет активации каспазы-4
<р> каспазы-4 может непосредственно активировать каспазы-9, но не через митохондриальную пути [28] - [29]. Для того, чтобы исследовать вопрос о том каспазы-4 активируется G503 и активирует ли каспазы-9 активированного каспазы-4, мы исследовали фрагменты расщепления каспазы-4 и -9. Результаты показали, что фрагмент расщепления каспазы-4 значительно увеличилось в клетках, обработанных G503 по сравнению с контрольной группой (Фиг.6а). Лечение ингибитором каспазы-4 Z-LEVD-FMK увеличили активность каспазы-9 Proform, который не был обнаружен в группе лечения G503 (Фиг.6В). Эти результаты показывают, что G503 индуцирует SGC7901 клетку рака желудка апоптоз частично за счет активации каспазы-4.
Обсуждение
<р> Сообщается, что р
-quinone фрагмент хинона -содержащие молекулярные играет очень важную роль в борьбе с раком потенциала [30]. Perchellet и др. также обнаружили, что п-хинон Д4, о-хинон Ю1 и незамещенного модель п-хинон J7 снижается наиболее жизнеспособность опухолевых клеток L1210, среди восьми синтезированных соединений и подвергают скринингу на их предварительном исследовании [31]. Для того, чтобы понять взаимосвязь между потенциалом противораковой altersolanol А и структура-активность, Teiten и др. оценивали влияние altersolanol А и его родственные производные антрацена: tetraacetylaltersolanol A, B и tetrahydroaltersolanol ampelanol. Они обнаружили, что только altersolanol А и его ацетилированного производного tetraacetylaltersolanol Подарок цитотоксическое действие на клетки K562, в то время как производные с уменьшением одной из карбонильных групп, таких как tetrahydroaltersolanol B и ampelanol, не имеют никакого эффекта [32]. р
-quinone структуры G503 (рис S1) может быть также способствовало раковых клеток апоптоза, и в следующем исследовании мы будем анализировать G503 и его производные, чтобы определить взаимосвязь предварительную структура-активность. В этом исследовании мы обнаружили, что клетку рака желудка линии SGC7901 является наиболее G503-чувствительной линии клеток рака исследовали с использованием анализа жизнеспособности клеток в девяти линиях раковых клеток и двух линий нормальных клеток. G503 индуцирует SGC7901 желудка гибель раковых клеток с помощью апоптоза в зависимости от дозы образом. Другой клеток рака желудка AGS также рассматривается, и чувствителен к G503-индуцированного апоптоза, а также. В результате, 20 мкмоль /л G503 является оптимальная концентрация, которая вызывает сильную апоптозу.
<Р> Геном человека кодирует по меньшей мере, 10 типов каспазы гомологов. Следующие каспазы гомологи участвуют в апоптоз: каспазы-2, -3, -8, -9 и -10 [33]. Хотя каспазы играют определенную роль в апоптозе, существуют различные каспазы существуют независимые пути. Например, в присутствии ингибиторов каспаз, фактор некроза опухолей (ФНО), индуцирует некроз клеток, который обладает характеристиками апоптоза и некроза [34] - [36]. Кроме того, апоптозиндуцирующая фактор (AIF), представляет собой ДНК-фермент, который непосредственно деградирует ДНК. Когда потенциал митохондриальных мембран изменяется, AIF, высвобождается в цитоплазму из митохондрий и активируется при его взаимодействии с cyclophilinA [37] - [38]. Эндо G также может привести к снижению ДНК непосредственно в каспазы-независимым способом [39].
<Р> В нашем исследовании, экспозиция G503 активирует каспазы-3, -8 и -9 в дозы и зависимым от времени образом (рис 2А, В, 3А, В, 4А, В). Является ли G503-индуцированный апоптоз зависит от каспаз? Когда клетки совместно обрабатывали Z-VAD-FMK и G503, Z-VAD-ФМК ингибирует активность каспазы-9 и -3 активации (рис 2С, D), а количество апоптотических клеток, индуцированных G503 уменьшилась (рис 2E), указывая тем самым, что G503-индуцированной SGC7901 апоптоз клеток является каспазы-зависимой. Для того, чтобы различать, зависит от каспазы-8, -9, или как G503-индуцированный апоптоз, SGC7901 клетки предварительно обрабатывают с Z-IETD-FMK и Z-LEHD-ФМК, а затем совместно обрабатывали G503. Эти результаты указывают на то, что Z-IETD-ФМК не ингибируют активность каспазы-9 и -3 активации (3С) и не уменьшать количество апоптотических клеток, индуцированных G503 (рис 3D); Тем не менее, Z-LEHD-ФМК уменьшилось количество апоптотических клеток (рис 4в). Таким образом, G503-индуцированной SGC7901 апоптоз клеток не зависит от каспазы-8, но на каспазы-9
. <Р> Митохондрии состоят из наружной мембраны, мембранной космической и матрицы. Связанных с апоптозом белки, такие как каспазы проферментов, Цито <ЕМ> C
и AIF, существуют в мембранном пространстве. Тем не менее, когда поры, образованные в наружной митохондриальной мембране или проницаемость изменяется, эти связанных с апоптозом белки высвобождаются в цитоплазму. Члены семейства Bcl-2, контролировать проницаемость внешней митохондриальной мембраны, и могут быть разделены на два члена, которые способствуют апоптозу (например, Bax и Bak) или ингибируют апоптоз (например, Bcl-2 и Bcl-XL). В проапоптотического члены содействовать освобождению связанных с апоптозом белков, таких как CYTO с
, из митохондрий, тогда как антиапоптические члены имеют противоположный эффект [40]. Вах в основном существует в цитоплазме, в то время как Bcl-2 в сочетании с гидрофобными группами на С-конце био-клеточной мембраны [41]. Структура Вах изменяется во время внешнего напряжения так, что он соединяется с внешней митохондриальной мембраной tospontaneously образуют галерею посредством гомологичной олигомеризации. Это действие индуцирует высвобождение связанных с апоптозом белков [42] или формирования митохондрии Проницаемость Transition Поре (МРТР), который состоит из напряжения-зависимого анионного канала (VDAC) на внешней мембране митохондрий и аденин нуклеотидов транслокатору (ANT) на внутренняя мембрана [43]. Вах взаимодействует только с VDAC создать с открытыми порами, когда концентрации Bax являются низкими. В противоположность этому, Бакс одновременно взаимодействует с VDAC и муравей при концентрации Bax высоки, чтобы открыть поры во внутренней и внешней мембраны. Это действие уменьшает внутренний потенциал мембраны, увеличивает осмотическое давление митохондриях, способствует внутренней мембраны отек и увеличивает осмотическое давление внешней мембраны, способствуя тем самым высвобождение связанных с апоптозом белков [26], [44] - [46 ]. Важным шагом в митохондриальной пути апоптоза является высвобождение CYTO с
[47] - [49]. Цито <ЕМ> C
объединяется с Apaf-1 и каспазы-9 Proform для создания апоптосома. Apaf-1 выставляет свой домен олигомеризации, и N-концевой активации каспазы и домены по набору персонала (CARD) объединяется с PROFORM CARD каспазы-9. Таким образом, каспазы-9 активируется, и активированный каспазы-9 расщепляет вниз по течению каспазы, такие как caspse-3 и -7. Эффекторные каспазы в конце концов, расщеплять их соответствующие субстраты, чтобы вызвать апоптоз клеток [47], [49] - [50].
<Р> В этом исследовании, G503 увеличивает долю Вах /Bcl-2 на митохондриальной мембране и уменьшается отношение Bax /Bcl-2 в цитоплазме (рис 5D). G503 также способствует открытию МРТР и снижение мембранного потенциала митохондрий (рис 5А, В). Затем Цито с
был переведен из митохондрий в цитоплазму (рис 5C). Кроме того, G503 способствует передаче Bax в митохондрии из цитоплазмы и Bcl-2 в цитоплазму из митохондрий. Увеличение Вах и снижение Bcl-2 в митохондриях увеличивают проницаемость митохондриальной наружной мембраны и способствовать освобождению CYTO C
. Регулирование Bax /Bcl-2 с помощью G503 может наблюдаться, так как G503 представляет собой небольшой молекулярное соединение.
Микробиом влагалища может влиять на эффективность профилактической терапии ВИЧ.
Генетика может влиять на состав микробиома больше, чем факторы окружающей среды.
Как справиться с синдромом раздраженного кишечника
Как массовые обследования помогли выявить больше случаев глютеновой болезни у детей
Тип бактерий верхних дыхательных путей может влиять на тяжесть астмы
Как укрепить свою иммунную систему для борьбы с коронавирусом
Белок SARS-CoV N вызывает выработку IFN-β, провоцируя убиквитинирование RIG-I,
находит исследование Многие представители семейства Coronaviridae, такие как ближневосточный респираторный синдром (MERS), тяжелый острый респираторный синдром (ОРВИ), и тяжелый острый респираторный с
Растительные диеты улучшают здоровье сердца за счет микробиома кишечника
Новое исследование, опубликованное в феврале 2020 г. Журнал Американского колледжа кардиологии сообщает, что сокращение потребления продуктов животного происхождения и диеты на основе растений могут
Исследование с участием близнецов показывает, что симптомы COVID-19 имеют генетический вклад
Новое исследование опубликовано на сервере препринтов medRxiv из Королевского колледжа, Лондон, предполагает, что генетический состав человека может повлиять на то, насколько человек может пострадат